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Bioengineering

Fermentações controladas por luz para produção de produtos químicos e proteicos microbianos

Published: March 22, 2022 doi: 10.3791/63269
Automatic Translation
*1, *1, 1,2,3,4
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University
* These authors contributed equally

Summary

O controle optogenético do metabolismo microbiano oferece controle dinâmico flexível sobre os processos de fermentação. O protocolo aqui mostra como configurar fermentações reguladas por luz azul para produção química e proteica em diferentes escalas volumosas.

Abstract

As fábricas de células microbianas oferecem uma alternativa sustentável para a produção de produtos químicos e proteínas recombinantes a partir de matérias-primas renováveis. No entanto, sobrecarregar um microrganismo com modificações genéticas pode reduzir o condicionamento físico e a produtividade do hospedeiro. Esse problema pode ser superado usando o controle dinâmico: expressão indutível de enzimas e caminhos, tipicamente usando aditivos à base de químicos ou nutrientes, para equilibrar o crescimento e a produção celular. A optogenética oferece um método não invasivo, altamente tável e reversível de regular dinamicamente a expressão genética. Aqui, descrevemos como configurar fermentações controladas por luz de Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae para a produção de produtos químicos ou proteínas recombinantes. Discutimos como aplicar luz em horários selecionados e dosagens para desacoplar o crescimento e a produção microbiana para melhor controle de fermentação e produtividade, bem como as principais considerações de otimização para melhores resultados. Além disso, descrevemos como implementar controles de luz para experimentos bioreatores em escala de laboratório. Esses protocolos facilitam a adoção de controles optogenéticos em microrganismos projetados para melhor desempenho de fermentação.

Introduction

A optogenética, o controle de processos biológicos com proteínas leves responsivas, oferece uma nova estratégia para controlar dinamicamente as fermentações microbianas para a produção química e proteica1,2. A carga de vias metabólicas projetadas e a toxicidade de alguns intermediários e produtos muitas vezes prejudicam o crescimento celular3. Tais tensões podem levar à má acumulação de biomassa e à redução da produtividade3. Esse desafio pode ser enfrentado dividindo temporalmente as fermentações em uma fase de crescimento e produção, que dedicam recursos metabólicos ao acúmulo de biomassa ou à síntese do produto, respectivamente4. Recentemente, mostramos que a transição do crescimento para a produção nesta fermentação em duas fases pode ser induzida com mudanças nas condições de iluminação5,6,7. A alta sintonia, reversibilidade e ortogonalidade dos insumos leves8 oferecem vantagens únicas às fermentações controladas pela luz que são difíceis ou impossíveis de replicar com indutores químicos usados no controle dinâmico das fermentações convencionais em duas fases4,9,10,11.

A proteína EL222 responsiva de luz azul derivada de Erythrobacter litoralis tem sido usada para desenvolver vários circuitos optogenéticos para engenharia metabólica em Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. El222 contém um domínio sensor de tensão de oxigênio leve (LOV) que sofre uma mudança conformacional sobre a ativação da luz azul (465 nm), que permite que ele se ligue à sua sequência de DNA cognato (C120)13. Fundir EL222 ao domínio de ativação do VP16 viral (VP16-EL222) resulta em um fator de transcrição responsiva de luz azul que pode ativar reversivelmente a expressão genética em S. cerevisiae7 e outros organismos14 do promotor sintético PC120. Vários circuitos baseados no EL222 foram desenvolvidos e utilizados para a produção química em S. cerevisiae, como o sistema OptoEXP ativado pela luz básica7, no qual o gene de interesse é diretamente expresso a partir de PC120 (Figura 1A). No entanto, preocupações com a penetração da luz nas altas densidades celulares tipicamente encontradas na fase de produção de fermentações nos motivaram a desenvolver circuitos invertidos que são induzidos no escuro, como os circuitos OptoINVRT e OptoQ-INVRT (Figura 1B)5,7,13. Estes sistemas aproveitam os regulons galactose (GAL) ou quinic acid (Q) de S. cerevisiae e N. crassa, respectivamente, controlando seus repressores correspondentes (GAL80 e QS) com VP16-EL222, para reprimir a expressão genética na luz e induzi-la fortemente no escuro. A combinação de circuitos OptoEXP e OptoINVRT resulta em controle bidirecional da expressão genética, permitindo fermentações em duas fases nas quais a fase de crescimento é induzida com luz azul, e a fase de produção com escuridão (Figura 2A)5,7.

Usar a luz em vez de escuridão para induzir a expressão genética durante a fase de produção expandiria muito as capacidades de controles optogenéticos, mas também exigiria superar as limitações de penetração de luz das altas densidades celulares tipicamente encontradas nesta fase de fermentação. Para isso, desenvolvemos circuitos, conhecidos como OptoAMP e OptoQ-AMP, que amplificam a resposta transcricional à estimulação da luz azul. Esses circuitos usam mutantes do tipo selvagem ou hipersensíveis do VP16-EL222 para controlar a produção dos ativadores transcricionais Gal4p ou QF2 dos regulons GAL ou Q, respectivamente, alcançando maior sensibilidade e expressão genética mais forte com luz12,13 (Figura 1C). Os circuitos optoAMP podem alcançar indução de luz completa e homogênea em bioreatores de 5 L a uma densidade óptica (medida a 600 nm; OD600) valores de pelo menos 40 com apenas ~0,35% de iluminação (5% de dose leve em apenas ~7% da superfície a granel). Isso demonstra um maior grau de sensibilidade em comparação com o OptoEXP, que requer cerca de 100% de iluminação12. A capacidade de induzir efetivamente a expressão genética com luz em altas densidades celulares abre novas oportunidades para o controle dinâmico das fermentações. Isso inclui fermentações operacionais em mais de duas fases temporais, como fermentações trifásicas, nas quais as fases de crescimento, indução e produção são estabelecidas com cronogramas de luz únicos para otimizar a produção química (Figura 2B)12.

Figure 1
Figura 1: Circuitos optogenéticos para controle dinâmico de S. cerevisiae. Os circuitos OptoEXP, OptoINVRT e OptoAMP são baseados no sistema VP16-EL222 sensível à luz. (A) No circuito OptoEXP, a exposição à luz azul causa uma alteração conformacional e a dimerização do VP16-EL222, que expõe um domínio de vinculação de DNA e permite a transcrição do PC120. O número foi modificado de Zhao et al.7. (B) Os circuitos OptoINVRT aproveitam os regulons GAL (mostrado) ou Q para induzir a expressão no escuro. Nos circuitos baseados em GAL, VP16-EL222 e GAL4 são expressos constitutivamente, enquanto a expressão de drives PC120 do repressor GAL80 (em circuitos baseados em Q, GAL4 e GAL80 são substituídas por QF2 e QS, respectivamente, e um promotor sintético contendo QUAS é usado em vez de um promotor gal). À luz, Gal80p impede a ativação do gene de interesse do PGAL1. No escuro, GAL80 não é expresso e rapidamente degradado, fundindo-o a um domínio degron constitutivo (pequeno domínio marrom), que permite a ativação de PGAL1 por Gal4p. O número foi modificado de Zhao et al.5. (C) Os circuitos OptoAMP também usam VP16-EL222 para controlar os regulons GAL (mostrado) ou Q. Nestes circuitos, o repressor GAL80 (ou QS) é expresso e fundido constitutivamente e fundido a um degron sensível a fotos (pequeno domínio azul) garantindo uma repressão apertada no escuro. PC120 e uma expressão de controle mutante hipersensível VP16-EL222 de GAL4 (ou QF2) com luz, que ativa fortemente O PGAL1 (ou um promotor contendo QUAS) na luz. Os circuitos derivados de GAL podem usar formas projetadas de PGAL1, como PGAL1-M ou PGAL1-S, que aumentaram a atividade, bem como promotores do tipo selvagem controlados pelo regulon GAL (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). A figura foi modificada de Zhao et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Fermentações de duas e três fases através do tempo. (A) Fermentações em duas fases operadas com circuitos invertidos consistem em uma fase de crescimento orientada pela luz e uma fase de produção escura. Na fase de crescimento, a biomassa se acumula à medida que a via de produção permanece reprimida. Ao atingir o OD600 desejado, as células são deslocadas para o escuro para ajustar metabolicamente antes de serem resuspendidas em novas mídias para a fase de produção. (B) Em um processo trifásica, as fases de crescimento, incubação e produção são definidas por cronogramas de luz únicos, que podem consistir em um período de crescimento escuro, incubação pulsada e fase de produção totalmente iluminada. Figura criada com Biorender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Circuitos optogenéticos também foram desenvolvidos para controle dinâmico da produção química e proteica em E. coli. Os circuitos optoLAC controlam o repressor LacI bacteriano usando o circuito pDawn responsivo à luz, que é baseado no sistema de dois componentes YF1/FixJ6 (Figura 3). Semelhante ao OptoINVRT5, os circuitos OptoLAC são projetados para reprimir a expressão genética na luz e induzi-la no escuro. Os níveis de expressão usando circuitos OptoLAC podem corresponder ou exceder aqueles alcançados com indução isopropílico padrão β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), mantendo assim a força da indução química ao mesmo tempo que oferece maior sintonia e reversibilidade6. Portanto, os circuitos OptoLAC permitem um controle optogenético eficaz para a engenharia metabólica em E. coli.

Figure 3
Figura 3: Circuitos OptoLAC para controle dinâmico de E. coli. Os circuitos OptoLAC adaptam o sistema pDawn e operon de lac para alcançar ativação no escuro e repressão à luz. No escuro, o YF1 fosforila fixJ, que então ativa o promotor PFixK2 para expressar o repressor cI . O repressor de IC impede a expressão do repressor lacI do promotor de PR , que permite a transcrição do gene de interesse de um promotor contendo lacO. Por outro lado, a luz azul reduz a atividade de quinase líquida YF1, invertendo a fosforilação fixJ e, portanto, a expressão cI , que deprime a expressão do lacI e impede a expressão do promotor contendo lacO. O número foi modificado de Lalwani et al.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Descrevemos aqui os protocolos básicos para fermentações controladas pela luz de S. cerevisiae e E. coli para produção química ou proteica. Para a levedura e as bactérias, primeiro focamos em fermentações com uma fase de crescimento impulsionada pela luz e uma fase de produção induzida pela escuridão habilitada pelos circuitos OptoINVRT e OptoLAC. Posteriormente, descrevemos um protocolo para uma fermentação trifásica (crescimento, indução, produção) controlada por luz habilitada pelos circuitos OptoAMP. Além disso, descrevemos como escalar fermentações optogeneticamente controladas de microplacos a bioreatores em escala de laboratório. Com este protocolo, pretendemos fornecer um guia completo e facilmente reprodutível para a realização de fermentações controladas por luz para produção química ou proteica.

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Protocol

1. Produção química controlada por luz utilizando o circuito S. cerevisiae OptoINVRT7

  1. Construção de cepa
    1. Obtenha uma cepa com sua3 auxotrofia, pois este marcador é necessário para a maioria dos plasmídeos OptoINVRT existentes5. Se buscar a regulação optogenética de um gene nativo de S. cerevisiae, construa uma cepa na qual qualquer cópia endógena do gene seja excluída.
    2. Linearize o plasmídeo contendo o circuito OptoINVRT7, como o EZ-L4395, e integre-o no his3-locus da cepa auxotrófica usando métodos padrão de transformação de lítio-acetato15. Se usar o plasmídeo EZ-L439, que contém os componentes para reprimir O PGAL1 na luz e ativá-lo no escuro, linearize-o no local de restrição do PmeI.
    3. Após a transformação, centrifugar as células a 150 x g por 1 min e suavemente resuspend em 200 μL de meio completo sintético de histidina fresco (SC-His).
    4. Emplaque todo o volume celular em placas de ágar SC-Seu e incubar a 30 °C por 2-3 dias até que as colônias apareçam.
    5. Prepare células competentes dessa cepa usando protocolos padrão de transformação de acetato de lítio e transforme-as com um plasmídeo contendo os genes para serem controlados optogeneticamente a jusante do promotor PGAL1-M ou PGAL1-S5.
      NOTA: O uso de um plasmídeo que se integra em δ-locais (YARCdelta5) e seleciona com Zeocin permite integração multicópia estável7,16,17,18.
    6. Após a transformação, centrifugar a cultura a 150 x g por 1 min e suavemente resuspend em 200 μL de meio sc-dropout fresco.
      NOTA: O promotor PGAL1-M é uma versão sintética do promotor PGAL1 com os sites de repressão Mig1p excluídos, enquanto o PGAL1-S é uma versão projetada do PGAL1-M, que tem sites extras de ligação do ativador Gal4p. O promotor PGAL1 regular pode ser usado para controlar a expressão; no entanto, a força de expressão será menor do que esses promotores projetados.
    7. Plaque o volume inteiro da célula em uma placa de ágar extrato de levedura peptone dextrose (YPD) se integrando-se em δ-locais, ou uma placa de evasão sc se transformar com um plasmídeo contendo um marcador de seleção. Incubar a 30 °C por 16 h sob luz azul constante para manter o gene otogeneticamente controlado reprimido.
      NOTA: Para algumas cepas, as colônias podem crescer mais rapidamente quando incubadas em pulsos de luz azul (por exemplo, 1 s on/79 s off, 5 s on/75 s off, 10 s on/70 s off, etc.) em vez de em iluminação constante, que deve ser determinada experimentalmente para cada cepa, se necessário.
    8. Use qualquer fonte de luz de 465 nm e coloque um painel LED ~40 cm acima da placa de tal forma que a intensidade da luz seja ~80-110 μmol/m2/s. Meça a intensidade usando um medidor quântico (ver Tabela de Materiais).
    9. Se integrar em δ-sites, crie uma réplica da placa em placas YPD contendo uma gama de concentrações de Zeocina entre 400 μg/mL e 1.200 μg/mL para selecionar para uma variedade de números de cópia de integração5,7,12,16,17,18. Incubar as placas de réplica a 30 °C sob luz azul constante ou pulsada por 2-3 dias até que as colônias apareçam.
  2. Triagem preliminar para as melhores colônias
    1. Selecione oito colônias de cada placa e use-as para vacinar 1 mL de SC-Seu meio complementado com 2% de glicose em poços individuais de uma placa de 24 poços. Cresça em placas de 24 poços sob as células durante a noite (16-20 h) a 30 °C com 200 rpm (diâmetro orbital de 19 mm) tremendo sob iluminação constante de luz azul.
    2. Na manhã seguinte, diluir cada cultura em 1 mL de um sc-seu médio fresco com 2% de glicose a OD600 valores variando de 0,01-0,3 e crescer em placas de 24 poços sob luz constante ou pulsada a 30 °C com 200 rpm tremendo até atingirem densidades celulares entre 2 e 9 valores OD600 (Figura 4A). A quantidade de tempo necessária para esta fase de crescimento dependerá da tensão.
    3. Incubar as placas no escuro por 4h a 30 °C com 200 rpm tremendo desligando o painel de luz e enrolando as placas em papel alumínio.
      NOTA: Esta etapa permite que as células transitem metabolicamente para a fase de produção antes da ressuspensão na mídia de produção.
    4. Para iniciar a fase de produção, centrifugar as culturas na placa de 24 poços a 234 x g por 5 min e resuspend células em 1 mL de sc-dropout médio fresco com 2% de glicose. Sele as placas para evitar a evaporação do produto desejado usando fita de vedação microplatéria estéril.
    5. Fermente as placas seladas no escuro por 48h a 30 °C com agitação a 200 rpm. Certifique-se de que as placas estão enroladas em papel alumínio para evitar qualquer exposição à luz.
      NOTA: Embrulhar as placas em papel alumínio não limita a disponibilidade de oxigênio ou gás nas fermentações; no entanto, a fita de vedação estéril limita a transferência de gás. Pequenos orifícios podem ser cutucados na fita para introduzir oxigênio, se necessário.
  3. Colheita e análise
    1. Para colher as fermentações, centrifufique as placas por 5 min a 234 x g e transfira 800 μL do supernatante em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL.
    2. Dependendo do produto químico de interesse, analise usando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), espectrometria de cromatografia-massa gasosa (GC-MS), ou outro método analítico utilizando a técnica de preparação da amostra mais adequada para o instrumento utilizado.

2. Produção de proteína controlada por luz utilizando o sistema E. coli OptoLAC

  1. Construção de cepa
    1. Co-transforme eletrocompetente BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3 com um plasmídeo contendo o circuito OptoLAC1B ou OptoLAC2B6 e um plasmídeo que expressa a proteína recombinante de interesse do promotor PT719.
    2. Após a transformação, recupere as células por 1 h em 1 mL de caldo super ótimo com repressão catabólito (SOC; 2% tripla, extrato de levedura de 0,5%, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM de glicose) a 37 °C com rotação ou agitação.
      NOTA: O plasmídeo contendo a proteína de interesse deve ser compatível com o plasmídeo OptoLAC (ou seja, marcador de resistência diferente e origem da replicação) e não deve conter uma cópia de lacI.
    3. Centrifugar as células a 4845 x g por 3 min e concentrar a pelota em 200 μL de caldo de lysogenia (LB). Coloque as células concentradas em uma placa de ágar LB com antibióticos apropriados e cresça a 37 °C durante a noite sob luz azul constante para manter a expressão proteica reprimida.
  2. Triagem inicial para verificar a expressão
    1. Pegue três colônias simples e use-as para vacinar 1 mL de mídia LB com antibióticos apropriados em poços individuais de uma placa de 24 poços. Cresça durante a noite (16-20 h) a 37 °C com 200 rpm tremendo sob iluminação constante de luz azul (Figura 4A).
    2. No dia seguinte, use 1,5 μL de cultura para medir OD600 em um espectrofotômetro com uma medição de microvolume. Culturas diluídas em 1 mL de LB fresco em placas de 24 poços a valores OD600 que variam de 0,01-0,1.
    3. Cresça as culturas a 37 °C com 200 rpm tremendo sob luz azul por 2-3 h. A partir da segunda hora, faça medições de OD600 a cada 15 minutos para garantir que as culturas não superem a faixa OD600 de 0,1-1,5.
    4. Uma vez que as culturas estejam no OD600 desejado, desligue o painel de luz e enrole a placa em papel alumínio para iniciar a fase de produção. Mantenha a placa no escuro por 8h (37 °C), 20 h (30 °C) ou 48 h (18 °C), com 200 rpm tremendo.
    5. Medir e registrar o valor final de OD600 de cada cultura.
  3. Colheita e análise
    1. Transfira 800 μL de cada cultura para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e centrífuga por 5 min a 17.000 x g.
    2. Resuspense a pelota de célula em 200 μL de tampão de ressuspensão (Tris 50 mM, pH 8.0, NaCl 300 mM).
      NOTA: A concentração de NaCl pode ser ajustada com base na proteína recombinante que está sendo analisada.
    3. Adicione 50 μL de 6x sulfato de sódio (SDS) tampão de amostra (Tris 375 mM, pH 6.8, SDS 9%, glicerol 50%, azul bromofenol 0,03%, DTT 9%). Incubar a 100 °C por 10 min com agitação a 700 rpm em um termomixer.
    4. Carregue ~3-20 μL da cultura em um gel SDS-PAGE de 12%. Utilizando a medição final de OD600 como guia, carregue aproximadamente a mesma quantidade de proteína para cada amostra (equivalente a 10 μL da amostra correspondente a um valor final de OD600 de 1). Use uma fonte de alimentação para executar a eletroforese a 100 V até que o gel esteja totalmente resolvido.
    5. Colora o gel com solução G-250 azul brilhante Coomassie aquecendo para 30-40 s em um forno de micro-ondas, e depois incubando em um rotador de plataforma por pelo menos 15 minutos.
    6. Enxágüe com água deionizada duas vezes e desestir em um rotador de plataforma por pelo menos 30 minutos (ou durante a noite), adicionando dois lenços de limpeza amarrados em um nó para ajudar a absorver a mancha. Ferva o gel em quantidade suficiente de água no forno micro-ondas por 15 minutos para acelerar o processo de desinsindúnte.

3. Fermentação trifásica utilizando o sistema S. cerevisiae OptoAMP

  1. Construção de cepa
    1. Obtenha uma cepa com um marcador auxotrófico his3 , pois este marcador é necessário para usar os plasmídeos OptoAMP existentes5. Se buscar a regulação optogenética de um gene nativo de S. cerevisiae, construa uma cepa na qual a cópia endógena deste gene seja excluída.
    2. Linearize um plasmídeo contendo o circuito OptoAMP4, como o EZ-L58012, e integre-o no lócus his3 da cepa auxotrófica usando métodos padrão de transformação de lítio-acetato15. Se usar OZ-L580, linearize o plasmídeo no local de restrição do PmeI.
    3. Após a transformação, centrifugar as células a 150 x g por 1 min e suavemente resuspend em 200 μL de SC-Seu médio fresco.
    4. Emplaque todo o volume celular em mídia seletiva (SC-His-ágar) e incubar a 30 °C por 2-3 dias até que as colônias apareçam.
    5. Prepare células competentes dessa cepa e transforme-as com um plasmídeo contendo os genes para serem controlados optogeneticamente a jusante do promotor PGAL1-S12.
      NOTA: O uso de um plasmídeo que se integra em δ locais e seleciona com Zeocin permite integração e seleção de multicópias estáveis.
    6. Depois de transformar, centrifugar a cultura a 150 x g por 1 min e suavemente resuspend em 200 μL de médio sc-dropout fresco.
      NOTA: O promotor PGAL1-S é uma versão sintética do promotor PGAL1 no qual os sites de repressão Mig1p são excluídos e sites extras de vinculação do ativador Gal4p são adicionados. O promotor PGAL1 regular pode ser usado; no entanto, a força de expressão será menor do que este promotor projetado.
    7. Emplaque todo o volume celular em uma placa de ágar YPD ou SC-dropout e incubar a 30 °C por 16 h no escuro (envolto em papel alumínio). A incubação no escuro mantém o gene otogeneticamente controlado reprimido, o que permite que as células direcionem seus recursos metabólicos para o crescimento celular em vez de produção química.
    8. Se integrar em δ-sites, a réplica de placas YPD contendo uma série de concentrações de Zeocin para selecionar para uma variedade de números de cópia de integração. Incubar as placas a 30 °C no escuro (embrulhado em papel alumínio) por 2-3 dias até que as colônias apareçam.
  2. Triagem preliminar para as melhores colônias
    1. Selecione oito colônias de cada placa e use-as para vacinar 1 mL de SC-Seu meio com 2% de glicose em poços individuais de uma placa de 24 poços. Cresça as células durante a noite (16-20 h) no escuro a 30 °C com 200 rpm tremendo.
    2. Na manhã seguinte, diluir cada cultura em 1 mL de SC-Seu médio fresco com 2% de glicose a 0,1 OD600 e crescer no escuro a 30 °C com 200 rpm tremendo até atingir um OD600 de 3. Enrole as placas em papel alumínio para evitar a exposição à luz. A quantidade de tempo necessária para esta fase de crescimento dependerá da tensão.
    3. Para iniciar a fase de indução, incubar as placas sob luz pulsada (por exemplo, 5 s on/95 s off) por 12 h a 30 °C com 200 rpm tremendo. Use qualquer fonte de luz de 465 nm e coloque um painel led acima da placa de tal forma que a intensidade da luz seja ~80-110 μmol/m2/s para obter resultados ótimos (Figura 4A).
      NOTA: A duração ideal do pulso de luz para esta incubação variará de acordo com o produto químico produzido. Recomenda-se a triagem de uma série de horários de luz de 0,1% (por exemplo, 1 s em 999 s off) a 100% (luz completa).
    4. Para iniciar a fase de produção, centrifugar as culturas a 234 x g por 5 min e resuspend em SC-Seu médio fresco com 2% de glicose. Sele as placas para evitar a evaporação do produto desejado usando fita de vedação microplata estéril.
    5. Fermente as placas seladas em luz por 48h a 30 °C com agitação a 200 rpm. Otimize o cronograma de luz durante esta etapa, pois alguns produtos químicos se beneficiam de uma fase de produção pulsada em vez de luz total.
  3. Colheita e análise
    1. Colher as fermentações por centrifugação das placas por 5 min a 234 x g e transferir 800 μL do supernante em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL.
    2. Dependendo do produto químico de interesse, analise usando HPLC, GC-MS ou outro método analítico utilizando a técnica de preparação da amostra mais adequada para o instrumento utilizado.

4. Produção química (mevalonato) de E. coli em um bioreator controlado pela luz

  1. Inoculação inicial e configuração do bioreator
    1. Inocula uma colônia de uma cepa E. coli projetada com produção química controlada pela luz em 5 mL de sais mínimos M9 (3,37 mM Na2HPO4, 2,2 mM KH2PO4, 0,855 mM NaCl, 0,935 mM NH4Cl) suplementados com 0,2% w/v casaminoácidos, 5% w/v de glicose e mistura de metais trace20 (0,0084 g/L EDTA, 0,0025 g/L CoCl2, 0,015 g/L MnCl2, 0,0015 g/L CuCl2, 0,003 g/L H3BO3, 0,0025 g/L Na2MoO4, 0,008 g/L ZnCl2, 0,06 g/L Fe (III) citrato, 0,0045 g/L thiamine, 1,3 g/L MgSO4) em um tubo conlical de 50 m.
    2. Cresça a cultura durante a noite a 30 °C com 200 rpm tremendo sob iluminação de luz azul.
    3. Configure a placa principal do vaso bioreator, certificando-se de que as seguintes portas estejam instaladas: inserir para sonda térmica; sonda de oxigênio dissolvido (DO); sparger de gás - conectar-se à fonte de ar através de um filtro de 0,2 μm; impulsor; condensador de gás - conecte-se a um filtro de 0,2 μm; linha de resfriamento (x2); linhas de alimentação (x2) - uma para adição de mídia, outra para controle de pH; linha de amostragem - garantir que atinja a parte inferior do vaso; porto vazio; pH sonda - calibrar a sonda com padrões de pH = 4 e pH = 7 antes da instalação, seja autoclave com o resto do vaso ou esterilizar com 95% de etanol e asepticamente inserir antes da configuração.
    4. Encha o recipiente com 1 L de água filtrada, e conecte a placa da cabeça e aperte, certificando-se de que o anel O se encaixa e sela.
    5. Cubra qualquer abertura no reator com papel alumínio.
    6. Prepare três tiras de tubulação: uma para a remoção da água, uma para inserção da ração e outra para controle de pH. Cubra as extremidades com papel alumínio e enrole toda a tubulação em papel alumínio.
      NOTA: O NH4OH, que é usado para ajuste de pH, não flui suavemente em tubos de silicone, o que pode levar a taxas de fluxo imprecisas e sobre-basificação da cultura. Para evitar esse problema, use tubos de bomba biocompatíveis (BPT) para a alimentação NH4OH.
    7. Autoclave o bioreator e tubo, usando um ciclo líquido de 30 minutos.
    8. Remova os materiais da autoclave. Uma vez frio o suficiente para manusear, conecte as sondas impeller, pH e DO, fonte de ar, entrada e saída do condensador, e entrada e saída de resfriamento à estação de controle.
    9. Insira a sonda térmica e cubra a nave com uma jaqueta de aquecimento. Fixar a jaqueta em direção ao topo do vaso para evitar bloquear a cultura da exposição à luz.
    10. Conecte um dos tubos estéreis à linha de amostragem e fixe através da bomba de amostragem. Coloque a outra extremidade de tal forma que ela flua em um recipiente vazio que pode conter pelo menos 1 L. Drene a água dentro do vaso.
    11. Conecte outro tubo estéril a uma das linhas de alimentação e proteja através de uma das bombas de alimentação. Conecte a outra extremidade do tubo a uma garrafa de mídia M9. Alimente a mídia para o reator.
    12. Conecte outro tubo estéril a uma das linhas de alimentação e proteja através de uma das bombas de alimentação. Conecte a outra extremidade do tubo à garrafa contendo 28%-30% NH4OH.
      ATENÇÃO: NH4OH é corrosivo. Trabalhe em um capô de fumaça enquanto se transfere para uma garrafa de ração e certifique-se de que a garrafa de alimentação seja colocada em contenção secundária.
    13. Coloque três painéis de luz em uma formação triangular ~20 cm de distância do reator, verificando se as intensidades de luz na superfície do vaso atingem ~80-110 μmol/m2/s de cada lado (Figura 4B).
    14. No dia seguinte, ligue o sistema bioreator e o refrigerador. Defina o ponto de temperatura do reator para 37 °C, o ponto de 7,0 do pH e a agitação a 200 rpm. A jaqueta de aquecimento deve ligar.
    15. Calibrar a sonda DO pela primeira vez esperando até que a temperatura e as medições DO se tornem constantes (este será o ponto de setpoint 100%). Em seguida, desconecte a sonda do sistema (este será o setpoint de 0%). Repita até que a medição DO se estabilize em 100% quando a sonda estiver conectada e, em seguida, defina o setpoint DO para 20%.
  2. Produção química controlada por luz
    1. Inocular o bioreator a um OD600 inicial de 0,001-0.1. Ligue os painéis de luz para iniciar o crescimento.
    2. Após 3h, comece a colher amostras da linha amostral para tomar medições de OD600 para evitar o excesso de crescimento da densidade celular ideal de indução (ρs). Uma vez alcançado o ρs ideal (o valor ideal para a produção de mevalonato é 0,17), desligue os painéis de luz, cubra o reator em papel alumínio e enrole a configuração em pano preto para iniciar a fase de produção escura.
    3. Adicione 50 μL de antifoam, 8h depois de mudar para escuridão. Desaparafusar a porta vazia e pipeta o antifoam diretamente no reator.
    4. Use a porta de amostragem para coletar periodicamente amostras para análise hplc ou gc.
  3. Desmontagem e análise
    1. Depois que o experimento for concluído, desligue o sistema. Desaparafusar cuidadosamente as sondas DO e pH e lavá-las com água e sabão. Desaparafusar a placa da cabeça e lavá-la com água e sabão usando um pincel.
    2. Transfira a cultura para um recipiente vazio e adicione alvejante a uma concentração final de 10% v/v. Coloque em um capô de fumaça e descarte depois de 30 minutos.
    3. Lave o vaso do reator com água e sabão usando uma escova.
    4. Prepare as amostras para análise com base no produto de interesse. Para produção de mevalonato, misture 560 μL de cultura com 140 μL de 0,5 M HCl e vórtice em alta velocidade por 1 min. Isso converte mevalonato em (±)-mevalonolactona.
      ATENÇÃO: HCl é um risco para a saúde. Manuseie com EPI adequado e certifique-se de que os tubos de amostra estejam devidamente tampados antes do vórtice.
    5. Centrifugar a 17.000 x g por 45 min a 4 °C. Transfira 250 μL do supernatante para um frasco HPLC.
    6. Para o mevalonato, analise amostras usando uma coluna de troca de íons ácidos orgânicos. Quantifique a produção usando um detector de índice refrativo (RID), comparando áreas de pico a um padrão de (±)-mevalonolactona.

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Representative Results

A regulação optogenética do metabolismo microbiano foi implementada com sucesso para produzir uma variedade de produtos, incluindo biocombustíveis, produtos químicos a granel, proteínas e produtos naturais5,6,7,12,13. A maioria desses processos são projetados para que o crescimento celular ocorra à luz (quando a baixa densidade celular apresenta desafios mínimos com a penetração da luz), e para que a produção seja induzida pela escuridão uma vez que as células sejam cultivadas. Vários produtos químicos que foram produzidos a partir de leveduras usando esta abordagem, incluindo ácido láctico, um valioso precursor de polímero e aditivo alimentar, bem como isobutanol, um biocombustível de próxima geração. Para ambos os produtos químicos, um desafio comum decorre do forte impulso da S. cerevisiae para metabolizar a glicose em direção à produção de etanol em vez do produto de interesse e a incapacidade de excluir a via de fermentação do etanol sem causar um grave defeito de crescimento7. Uma combinação de circuitos OptoEXP ativados pela luz e otoINVRT reprimidos à luz têm sido usados para ativar seletivamente com luz o gene para decarboxilase piruvada (PDC1) necessário para a fermentação de etanol, e induzir o caminho para o produto desejado no escuro5 (Figura 5A,B). Utilizando-se essa estratégia com uma densidade celular otimizada de indução (ρs), podem ser alcançados altos títulos de ambos os produtos químicos desejados (Figura 5C,D), destacando o valor do controle bidirecional oferecido pela optogenética.

Embora a maioria dos processos optogenéticos baseados em levedura tenha se centrado em uma fase de crescimento leve e na fase de produção induzida pela escuridão, o desenvolvimento recente de circuitos OptoAMP extra sensíveis e fortes abriu oportunidades para fermentações orientadas pela luz também12. Essas fermentações orientadas à luz são semelhantes aos processos descritos anteriormente; no entanto, os cronogramas de luz são invertidos de tal forma que a produção ocorre à luz. Além disso, esses circuitos permitem a implementação de processos trifásicas, o que agrega mais flexibilidade e controle à produção em comparação com a abordagem bimás de duas fases padrão. Dada a sensibilidade e a força desses circuitos, esses processos trifásicas são tipicamente otimizados pela triagem de diferentes cronogramas de luz em cada fase. Os pulsos de luz ideais dependem da tensão e do produto de interesse. Tais circuitos têm sido aplicados com sucesso na produção de naringenina, um produto natural com aplicações terapêuticas, além de ácido láctico e isobutanol12 (Figura 6). O aumento da produção de todos os três produtos químicos demonstra o valor da regulação optogenética em uma gama de complexidades de vias, bem como o novo potencial oferecido pelas fermentações trifásicas.

Além dessas demonstrações na levedura, a optogenética também tem sido aplicada para melhorar a produção de proteínas e produtos químicos no cavalo de trabalho bacteriano E. coli. As fermentações com este hospedeiro seguiram uma estrutura de produção induzida pela luz e induzida pela escuridão usando a suíte optoLAC de circuitos6. Quando usada para produzir uma proteína fluorescente amarela (YFP) ou fator de transcrição FdeR, a produção controlada por luz é comparável ou superior aos níveis alcançados com a indução padrão de IPTG, mas com uma sintonia mais fácil para níveis intermediários de produção (Figura 7A). Além disso, os circuitos OptoLAC foram aplicados para produzir mevalonato, um importante precursor terpenóide, tanto nos níveis de microplaca quanto de bioreatores (Figura 7B,C). Esses resultados selecionados dão uma visão geral da força, versatilidade e sintonia da regulação optogenética para a produção de produtos químicos e proteicos microbianos.

Figure 4
Figura 4: Configuração experimental para placas iluminadoras e bioreatores. (A) placas de 24 poços podem ser iluminadas enquanto tremem colocando um painel de luz LED azul aproximadamente 40 cm acima do agitador. A intensidade da luz deve ser medida com um medidor quântico para garantir que esteja entre ~80-110 μmol/m2/s. (B) Para iluminar um bioreator, coloque três painéis de luz em uma formação triangular ao redor do bioreator. Assim como nas placas de 24 poços, a intensidade da luz deve ser medida e ajustada para atingir ~80-110 μmol/m2/s de todos os lados. Figura criada com Biorender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Produção leve reprimida de produtos químicos de S. cerevisiae. Para melhorar a produção de ácido láctico (A) ou isobutanol (B), uma combinação de circuitos indutores claros e escuros têm sido usados para ativar seletivamente caminhos específicos. Em ambos os cenários, a via essencial de produção de etanol é induzida pela luz controlando a expressão PDC1 com OptoEXP, enquanto as vias de produção são ativadas no escuro usando um circuito OptoINVRT. (C) A produção de ácido láctico foi testada em uma gama de valores ρs com dois circuitos da suíte OptoINVRT. A versão OptoINVRT7 teve o melhor desempenho, com um ótimo valor de 7.0. (D) A versão OptoINVRT7 também maximizou a produção de isobutanol em comparação com o outro circuito, com um ótimo ρs de 8,75. **p < 0,01, ***p < 0,001. As estatísticas são derivadas usando um teste t de dois lados. Os dados são mostrados como valores médios e as barras de erro representam os desvios padrão de quatro réplicas. O número foi modificado de Zhao et al.5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Produção ativada por luz de produtos químicos em fermentações trifásicas de S. cerevisiae. As fermentações utilizando os circuitos OptoAMP podem operar com três fases dinâmicas: crescimento (i), indução (ii) e produção (iii), cada uma definida por diferentes ciclos de direito de luz. (A) A biossíntese do ácido láctico é induzida em luz azul pelo controle optogenético da expressão LDH . (B) A produção de ácido láctico pode ser otimizada utilizando um cronograma de luz pulsado (1 s on/79 s off) na fase de crescimento e iluminação completa nas fases de indução e produção. (C) A produção de isobutanol é induzida pelo controle optogeneticamente da expressão ILV2 . (D) A produção de isobutanol é otimizada usando uma fase de crescimento pulsado (1 s on/79 s off), fase de indução totalmente iluminada e pulsada (2 s on/118 s off). (E) Controle da via biossintética mais complexa para a naringenina, induzida pelo controle optogeneticamente dos genes TAL e PAL . (F) A biossíntese de naringenina é melhor otimizada usando um crescimento pulsado (1 s on/79 s off), indução totalmente iluminada e fase de produção escura. *p < 0,05, **p < 0,01, n.s. = sem significado. As estatísticas são derivadas usando um teste t de dois lados. Os dados são mostrados como valores médios e as barras de erro representam os desvios padrão de quatro réplicas independentes. O número foi modificado de Zhao et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Produção optogenética de proteínas recombinantes e produtos químicos em E. coli. O sistema OptoLAC tem sido usado para produzir proteínas e produtos químicos em títulos comparáveis ou superiores aos alcançados usando indução química com IPTG. (A) A expressão optogenética do FdeR é forte e incapaz de usar uma variedade de ciclos de serviço de luz, conforme resolvido e quantificado com mancha ocidental. (B) Uma cepa projetada para a produção de mevalonato excede os títulos alcançados usando a indução IPTG na escala de 24 poços no valor ideal. (C) A produção optogenética de mevalonato em um bioreator 2 L demonstra a escalabilidade da produção além das microplacas. *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. As estatísticas são derivadas usando um teste t de dois lados. Todos os dados são mostrados como valores médios e as barras de erro representam os desvios padrão de amostras biologicamente independentes. Os dados para (A) e (C) representam três réplicas, enquanto para (B), o número de réplicas da esquerda para a direita= 4, 4, 6, 3, 4, 4, 4, 4, 4. O número foi modificado de Lalwani et al.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O controle dinâmico tem sido aplicado há muito tempo para melhorar os rendimentos da engenharia metabólica e da produção de proteínas recombinantes4. Mudanças na expressão enzimática são mais tipicamente implementadas usando indutores químicos como IPTG21, galactose22 e tetraciclina23, mas também foram mediadas usando condições de processo como temperatura e pH. O controle optogenético da expressão genética elimina a necessidade de alterações nos parâmetros de fermentação ou na composição da mídia, tornando-a uma alternativa facilmente aplicável às estratégias tradicionais de indução. A facilidade com que a luz pode ser ligada ou desligada também oferece novos recursos, como o ajuste rápido e reversível da dosagem genética. Além disso, enquanto esses protocolos se concentram em sistemas de resposta à luz azul, a existência de ferramentas optogenéticas que invertem as respostas de luz existentes24 ou respondem a outros comprimentos de onda de luz25,26,27,28,29 oferece um potencial emocionante para controlar ortogonalmente múltiplas vias para um nível de controle sem precedentes. Tais vantagens tornam a luz uma nova solução versátil para controle flexível sobre fermentações microbianas.

Além da triagem para as melhores colônias, como discutido nos protocolos, outros parâmetros como a densidade celular em que as culturas são mudadas do crescimento para a produção (ρs), comprimentos dos períodos de produção e incubação, e ciclos de trabalho leve também devem ser otimizados. Os melhores valores desses parâmetros são dependentes de produtos e cepas e, portanto, devem ser retim otimizados para qualquer nova aplicação. Por exemplo, caminhos envolvendo produtos finais tóxicos podem se beneficiar de valores mais elevados, que permitem o acúmulo suficiente de células antes de induzir a produção6,7, enquanto um circuito mais fraco, mas menos vazado, pode favorecer valores mais baixos de ρs para maximizar o tempo total de expressão. Da mesma forma, algumas vias e proteínas recombinantes podem se beneficiar de níveis intermediários de expressão, que podem ser alcançados com deveres leves únicos. Além disso, no caso de fermentações que utilizam circuitos OptoAMP, o número de fases temporais pode ser otimizado. Embora o protocolo demonstrado descreva um processo trifásica, as fermentações que utilizam esses circuitos podem ser controladas com um maior número de fases definidas por horários e durações exclusivas do direito de luz. Assim, uma gama desses parâmetros deve ser testada para otimizar o desempenho.

Evitar fontes de contaminação por luz apresenta uma consideração importante durante a configuração experimental. Para processos que requerem um atraso de estimulação da luz até estágios posteriores (por exemplo, fermentações escuras a claras), trabalhar em uma sala escura pode ser aconselhável para evitar a ativação prematura de sistemas optogenéticos. Nestes casos, uma fonte de luz inerte pode ser aplicada para visibilidade durante a configuração experimental (por exemplo, uma fonte de luz muito vermelha de ~700 nm ao trabalhar com sistemas ativados por luz azul). Uma vantagem dos processos que começam com o crescimento induzido pela luz (leve a escuro) é que as manipulações experimentais iniciais podem ser realizadas sob a luz ambiente com ampla visibilidade.

A facilidade com que um grande número de cronogramas de serviços leves podem ser aplicados às fermentações apresenta a oportunidade de desenvolver métodos de maior rendimento para equilibrar caminhos biossintéticos e elucidar as condições ideais que maximizam a produtividade da fermentação. Em vez de equilibrar as vias metabólicas testando um grande número de construtos combinados montados tendo cada enzima expressa por promotores de diferentes pontos fortes, as vias poderiam ser equilibradas por diferentes níveis de expressão genética usando diferentes ciclos de serviço de luz de um número muito menor de construções. Isso evita a necessidade de configurações experimentais mais complicadas, como a ressuspensão em diferentes mídias de indução ou diluições seriais para indutores químicos. Experimentos optogenéticos poderiam potencialmente até mesmo ser automatizados para aumentar o throughput usando em controladores silico para fornecer pulsos de luz especificamente cronometrados ou localizados para diferentes pools de amostras30. No entanto, experimentos de alto rendimento em diferentes condições de luz devem ser suficientemente separados para evitar a contaminação cruzada da luz, o que pode representar restrições espaciais. Além disso, a exigência de estimulação da luz impede o uso da maioria dos leitores de placas e micro bioreatores para medições contínuas. Embora ainda não tenham sido amplamente disponíveis comercialmente, vários aparelhos e algoritmos foram recentemente desenvolvidos para experimentos optogenéticos de alto rendimento e contínuos, que ajudam a enfrentar essas restrições espaciais31,32,33,34. Assim, apesar dessas limitações, a optogenética oferece um enorme potencial para aumentar o throughput experimental, ao mesmo tempo em que proporciona maior controlabilidade.

Os protocolos e vídeos aqui apresentados diminuirão as barreiras para que outros pesquisadores adotem controles optogenéticos do metabolismo celular e fermentações microbianas. A optogenética é uma tecnologia facilitadora para pesquisas básicas e aplicações biotecnológicas que podem se beneficiar do controle afinado das expressões genéticas, como genética, biologia molecular e celular, metabolismo, biologia de sistemas e cibergenética35,36,37,38. Além disso, a regulação optogenética da expressão genética tem sido demonstrada em outros microrganismos como Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa, sugerindo que os benefícios do controle da luz podem ser estendidos ao estudo e aplicação de diversas espécies39,40,41. Essas possibilidades destacam o potencial futuro da optogenética para engenharia metabólica, produção de proteínas e outras aplicações biotecnológicas.

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Disclosures

Os autores solicitaram várias patentes para os circuitos e métodos optogenéticos descritos neste artigo.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciência, Office of Biological and Environmental Research Award Número DE-SC0019363, o NSF CAREER Award CBET-1751840, The Pew Charitable Trusts e o Camille Dreyfus Teacher-Scholar Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Light-controlled chemical production using S. cerevisiae
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Agar powder Thermo Fisher Scientific 303991049
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid N/A N/A See Reference 1
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
PmeI New England Biolabs R0560L
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
Replica-plating device Thomas Scientific F37848-0000
Replica-plating pads Sunrise Science Products 3005-012
SC-His powder Sunrise Science Products 1303-030
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100
Sterile sealing film Excel Scientific STR-SEAL-PLT
YPD agar plates VWR 100217-054
Zeocin Thermo Fisher Scientific R25005
Light-controlled protein production using E. coli
6X SDS Sample Buffer Cepham Life Sciences 10502
12% Acrylamide protein gels Thermo Fisher Scientific NP0341BOX
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250 Thermo Fisher Scientific 20279
Electrophoresis cell Bio-Rad 1658004
Electrophoresis power supply Bio-Rad 1645050
LB broth (Miller) Fisher Scientific BP97235
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NaCl Thomas Scientific SX0425-1
OptoLAC plasmids N/A N/A See Reference 2
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SOC medium Thermo Fisher Scientific 15544034
Thermomixer Eppendorf 5382000015
Tris base Fisher Scientific BP1521
Three-phase fermentation using S. cerevisiae
Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following:
EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid N/A N/A See Reference 10
Chemical production in a light-controlled bioreactor
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
Antifoam Sigma-Aldrich A8311
Bioreactor with control station Eppendorf B120110001
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Bleach VWR Scientific 89501-620 (CS)
Blue LED panel HQRP 884667106091218
BPT tubing Fisher Scientific 14-170-15
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific 7647-01-0
M9 Minimal Salts Thermo Fisher Scientific A1374401
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NH4OH Solution Sigma-Aldrich I0503-1VL
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100

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Bioengenharia Edição 181
Fermentações controladas por luz para produção de produtos químicos e proteicos microbianos
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Hoffman, S. M., Lalwani, M. A.,… More

Hoffman, S. M., Lalwani, M. A., Avalos, J. L. Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production. J. Vis. Exp. (181), e63269, doi:10.3791/63269 (2022).

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