Summary
Her beskriver vi bruken av inducer gradient plater for å evaluere bakteriell swarming motility samtidig oppnå flere konsentrasjonsresponser.
Abstract
Bakteriell swarming motility er en vanlig mikrobiologisk fenotype som bakterielle samfunn bruker til å migrere over halvsolide overflater. I undersøkelser av indusert swarming motility, kan spesifikk konsentrasjon av en induser ikke være i stand til å rapportere hendelser som forekommer innenfor det optimale konsentrasjonsområdet for å fremkalle de ønskede svarene fra en art. Halvsolide plater som inneholder flere konsentrasjoner, brukes vanligvis til å undersøke responsen innenfor et induserkonsentrasjonsområde. Imidlertid øker separate halvsolide plater variasjoner i middels viskositet og fuktighetsinnhold i hver plate på grunn av ikke-enhetlig størkningstid.
Dette dokumentet beskriver en ett-trinns metode for samtidig å teste overflatesvermende motilitet på en enkelt gradientplate, der de isometrisk arrangerte testbrønnene tillater samtidig oppkjøp av multikonsentrasjonsresponser. I det nåværende arbeidet ble overflaten swarming av Escherichia coli K12 og Pseudomonas aeruginosa PAO1 evaluert som svar på en konsentrasjonsgradient av indusere som resveratrol og arabinose. Periodisk ble svermmorfologiene avbildet ved hjelp av et bildesystem for å fange hele overflatesvermprosessen.
Den kvantitative målingen av svermmorfologiene ble anskaffet ved hjelp av ImageJ-programvare, og ga analyserbar informasjon om svermområdet. Dette papiret presenterer en enkel gradient sverm plate metode som gir kvalitativ og kvantitativ informasjon om indusere effekter på overflaten swarming, som kan utvides til å studere effekten av andre indusere på et bredere spekter av motile bakterielle arter.
Introduction
Bakteriell swarming motility refererer til den kollektive migrasjonen av bakterieceller over overflaten av et stoff. I tillegg til halvsolid agarplater spesielt tilberedt i laboratoriet1, observeres denne fenotypen også på noen myke substrater som dyrevev2, hydrerte overflater3 og planterøtter4. Mens en semisolid overflate regnes som en av de grunnleggende forholdene for bakteriell swarming, krever noen arter også et energirikt medium for å støtte deres swarming motility5. Flagella rotasjon driver både svømming og swarming motility-svømming beskriver den encellede motiliteten i et flytende miljø, mens swarming er den synkrone bevegelsen av en mikrobiell befolkning over halvsolide overflater.
Substrat viskositet påvirker bakteriell bevegelighet; studier av patogene mikrober, som Helicobacter pylori, har vist at patogenets motilitet endres avhengig av mucinlagets viskositet, som påvirkes av miljøforsuring i den menneskelige verten6. For å gjenskape disse miljøene begrenser tidligere studier ved hjelp av agarkonsentrasjon over 0,3% (w / v) bakteriell svømmemotilitet for å påvirke et gradvis skifte til overflatesverm. Bruken av agarkonsentrasjon over 1% (w / v) forhindrer den svermende motiliteten til mange arter7. Kolonimønstrene som dannes på overflaten er varierte, inkludert funksjonsløs mat8, oksens øye9, dendritter10 og virvel11.
Selv om relevansen av slike mønstre fortsatt er uklar, synes disse mønstrene å være avhengige av miljømessige og kjemiske signaler12. Miljøsignaler dekker ulike aspekter, inkludert temperatur, saltholdighet, lys og pH, mens kjemiske signaler inkluderer tilstedeværelsen av mikrobielle quorumssensormolekyler, biokjemiske biprodukter og næringsstoffer. Autoinducer quorum sensing signalmolekyler som AHL (N-hexanoyl-L homoserine lactone) kan påvirke overflaten swarming ved å regulere produksjonen av surfactant13,14. Resveratrol, en fytoalexin sammensatte, kan begrense bakteriell swarming motility15.
I det nåværende arbeidet undersøker vi effekten av gradientkonsentrasjoner av resveratrol på villtype Escherichia coli K12-stamme og undersøker arabinose-inducible swarming motility av konstruerte E. coli K12-YdeH og Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH arter. Produksjonen av YdeH-enzymet induseres av arabinose via araBAD-promotoren, noe som resulterer i cellulær c-di-GMP-perturbasjon og påvirker bakteriell swarmingmotilitet16,17. Denne inducible swarming oppførselen studeres ved hjelp av arabinose gradient swarm plater med E. coli K12-YdeH og P. aeruginosa PAO1-YdeH stammer.
Gradientsvermplatene fremstilles ved suksessivt størkning av dobbeltlagsmedium (figur 1B). Bunnlaget består av mediet som er tilsatt med induseren, helles på den ene siden av en propped-up Petri-tallerken. Ved størkning av bunnlaget returneres Petri-parabolen til en flat overflate, hvor det øvre laget som inneholder mediet uten induseren, tilsetts fra den andre siden av platen. Etter at sværmplatene er fullstendig størknet, produseres isometrisk arrangerte holdebrønner ved boring av hull på sværmeplatene etter en fast layout (figur 1C) eller ved å trykke brønnene ved hjelp av en 3D-trykt modell av platedekselet som inneholder pinner under middels herdeprosess (Supplerende figur S1). Et gelavbildningssystem brukes til å fange de svermende morfologiene på forskjellige tidspunkter (figur 2). Analyse av overflatesverm ved hjelp av ImageJ-programvare (Supplemental Figure S2) gir kvantitative resultater av overflatesvermprosessen (figur 3).
Dermed foreslår vi en enkel metode for å teste overflatesvermende bevegelighet innenfor et konsentrasjonsområde av indusere. Denne metoden kan brukes til å teste flere konsentrasjonsresponser fra andre indusere ved å blande induseren inn i bunnlagsmediet og kan brukes på andre motile arter (f.eks. Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Denne tilnærmingen kan gi pålitelige kvalitative og kvantitative resultater for screening av en enkelt kjemisk induser, og separate plater kan brukes til å evaluere flere kjemiske indusere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av gradient svermplater
- Forberedelse av sværm medium
MERK: Se diskusjonsdelen for en kort sammenligning av ulike medium viskositeter; 0,7% (w / v) agarkonsentrasjon av svermmedium ble brukt i denne protokollen.- Forbered Lysogeny kjøttkraft (LB) pulver med agar i to koniske kolber; hver kolbe inneholder 2 g trypton, 2 g natriumklorid, 1 g gjærekstrakt og 1,4 g agar. Tilsett dobbeltdestillert vann (ddH2O) og rør suspensjonen ved hjelp av en magnetisk rørestang. Juster det endelige volumet til 200 ml ved å legge til ekstra ddH2O.
- Autoklaver oppløsningen ved 121 °C i 20 minutter. Bruk en luftgjennomtrengelig hette eller flaskeforseglingsfilm med luftventil.
MERK: Agar oppløses ved oppvarming i autoklaven. - Når temperaturen faller til 65 °C, bland oppløsningen for å sikre homogenitet, og overfør mediet til en 65 °C inkubator eller vannbad for korttidsbruk.
- Forberedelse av bunnlags sverm medium
MERK: Bunnlagsmediet er blandingen av svermmedium og induserlagerløsninger. Formuleringen av induser gradient svermplater er vist i tabell 1.- Forbered en 100 mM resveratrol lagerløsning ved å oppløse 114.12 mg lyofilisert resveratrol pulver i 5 ml dimetylsulfoksid (DMSO), og lagre løsningen ved -20 °C.
- Forbered en 20% (w / v) arabinose lagerløsning ved å oppløse 6 g arabinosepulver i 30 ml ddH2O; vent i 10-15 min for å la arabinosen oppløses; og oppbevar oppløsningen ved romtemperatur.
- Ta ut mediet fra 65 °C inkubatoren og plasser det ved romtemperatur; la svermmediet avkjøles til Erlenmeyer-kolben er avkjølt nok til å holde (~50 °C). Ikke plasser sværmemediet ved romtemperatur i lange perioder, da dette vil føre til størkning av agar.
- Tilsett ønsket volum av induserens lagerløsning til sværmemediet ved 50 °C (tabell 1). Bruk en pipette til å dispensere induserløsningen i stedet for å helle den. Virvle forsiktig for å blande induseren med sværmmediet.
MERK: Dette trinnet er for indusere som ikke kan autoklaveres. Vær forsiktig så du ikke introduserer bobler i mediet.
- Forberedelse av dobbeltlags gradient svermplater
MERK: Det øvre lagmediet er LB-medium som inneholder en agar på 0,7 % (w/v).- Merk 13 x 13 cm firkantede Petri-retter med indusernavn og stammer, og prop opp opp over kanten av lokkene (figur 1B).
- Tilsett 40 ml varmt bunnlagsmedium (50 °C) ved hjelp av en 50 ml pipette eller et 50 ml sentrifugerør.
MERK: Alternativt, for 13 x 13 cm firkantede Petri-retter, er 40 ml bunnlag og øvre lagmedium egnet; for 10 x 10 cm firkantede Petri-retter, er 25 ml bunnlag og øvre lagmedium egnet. - La bunnlagsmediet herdes i 1 time inne i en laminær strømningshette. Ikke forstyrr firkantede Petri-retter mens mediet størkner.
MERK: Under herding av bunnlaget skal svermmediet som ikke inneholder indusere, opprettholdes i en inkubator eller vannbad på 65 °C. - Når bunnlaget er helt størknet, fjern lokkene og legg de firkantede Petri-rettene inne i en laminær strømningshette.
- Tilsett 40 ml varmt overlagsmedium (50 °C) ved hjelp av en 50 ml pipette eller 50 ml sentrifugerør.
MERK: Mediet på det øvre laget inneholder ikke indusere. - Herd dobbeltlagsplatene på benken dekket og uforstyrret i 1 time. Oppbevar de tilberedte platene ved 4 °C i opptil 24 timer.
MERK: Lengre herdetider vil redusere fuktighetsinnholdet og begrense svermende motilitet.
2. Vekst av E. coli K12 og P. aeruginosa PAO1
- Forbered 500 ml LB-medium ved å legge til 5 g trypton, 5 g NaCl og 2,5 g gjærekstrakt i ddH2O, og fyll opp løsningen til 500 ml. Autoklaver oppløsningen på væskesyklus i 20 min ved 121 °C, og oppbevar den ved 4 °C.
- Forbered 100 ml 1,5% (w / v) LB-agar medium ved å legge til 1 g trypton, 1 g NaCl, 0,5 g gjærekstrakt og 1,5 g agar i ddH2O og fyll opp løsningen til 100 ml. Autoklaver oppløsningen på væskesyklus i 20 min ved 121 °C. Overfør mediet til et 50 °C vannbad for å hindre at agaren størkner.
- Når LB-agar medium kolbe er behagelig å holde, tilsett 20 ml LB-agar medium i en Petri-tallerken (10 cm i diameter) ved hjelp av en 25 ml pipette. La platen stå ved romtemperatur over natten, og oppbevar LB-agarplaten ved 4 °C.
- Ta lagerkulturer lagret ved -80 °C, strek E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 og P. aeruginosa PAO1-YdeH stammer på LB-agar Petri retter ved hjelp av engangs inokuleringsløkker. Inkuber Petri-rettene invertert over natten ved 37 °C.
- Plukk enkeltkolonier for forskjellige stammer fra Petri-rettene, inokuler hver koloni i 5 ml LB-medium, og inkuber kulturen ved 37 °C i en laboratoriebane shaker satt til 220 rpm.
- Når kulturtettheten når OD600nm ~ 1.0, fjern kulturen fra shakeren og plasser den ved romtemperatur. Juster kulturtettheten til OD600nm = 1,0, som beskrevet i trinn 3.2.1.
3. Inokulering og inkubasjon av gradient svermplater
- Utarbeidelse av inokulasjonsbrønner
MERK: 3D-utskriftsdekselmodeller som kan generere brønner atskilt med standardavstand, kan brukes i stedet for metoden som er beskrevet nedenfor (Tilleggsfigur S1).- Merk brønnposisjonene på A4-papiret som vist i figur 1C. Sett tre testkonsentrasjoner i en firkantet Petri-tallerken med to eller tre repliker.
- Plasser det merkede A4-papiret under en størknet graderingsplate. Skyv den bredere siden av en pipettespiss på 100 μL inn i den halvsolide mellomstore overflaten i merket posisjon. Trykk pipettespissen til den når bunnen av det øvre lagmediet.
- Når spissen berører bunnen, bruk ingen vertikal kraft på spissen; roter forsiktig spissen for å isolere innholdet i den sylindriske brønnen.
- Beveg pipettespissene horisontalt langs en svært liten avstand for å tillate luftstrøm inn i det smale stedet som er satt til side. Trykk spissen med pekefingeren for å blokkere gassstrømmen inne i spissen mens du holder pipetten ved hjelp av tommelen og langfingeren.
- Trekk spissen ut vertikalt, og hold brønninnholdet i spissen mens du trekker det ut.
MERK: Hvis brønninnholdet glir, påfør litt mer trykk med pekefingeren for å tette spissen helt. - Gjenta trinn 3.1.2 til 3.1.5 i alle markerte posisjoner. Dekk svermplaten før inokulering.
- Gradient plate inokulering og inkubasjon
- Juster vekstkulturtettheten over natten til OD600nm = 1,0.
- Pipette 80 μL av vekstkulturen over natten til hver brønn. Ikke søl bakteriekulturen utenfor brønnene.
- Pakk platene med tetningsfilm. For langsiktig observasjon (3-5 dager), pakk platene med sterilt laboratoriegummibånd.
MERK: Gummitape er mindre sannsynlig å gå i stykker. - Plasser et beger fylt med ddH2O i inkubatoren for å opprettholde fuktighet inne i inkubatoren. Inkuber gradientsvermplatene ved 37 °C.
MERK: Ikke inkuber sværmplatene opp-ned; Dette vil føre til at bakteriekulturen lekker fra brønnene. - Bilde svermplaten umiddelbart etter inokulering, og ta opp dette som 0 h-tidspunktet.
4. Avbildning av bakteriell overflate swarming
- Ta ut sværmeplatene, en om gangen, fra inkubatoren hver 12.
MERK: Ikke legg fingeravtrykk på overflaten av platene; hold siden av sværmeplaten med rene hansker. - Velg gelavbildningsmodus ; eksponere sværmeplaten for hvitt lys; og juster brennvidden for å gi den klareste utsikten over sværmer.
MERK: Bruk samme brennvidde for alle plater i en gitt batch. - Forbedre lysstyrken på sværmene for klar observasjon ved å justere eksponeringstiden til 300 ms. Juster terskelen for å minimere interferens fra bakgrunnslyset.
MERK: Terskelen justeres på betjeningsgrensesnittet til gelavbildningssystemet. Øk verdiene til venstre for å minimere forstyrrelser fra bakgrunnslyset. redusere verdier til høyre for å forbedre lysstyrken på sværmene. I denne protokollen er regionen vanligvis mellom 6 000 og 50 000. - Lagre bildefilen for videre analyse. Registrer bildetid, indusertype, graderingsretning og belastninger i en .txt fil.
5. Kvantifisere svermområdet ved hjelp av ImageJ-programvare
- Importer bildefilen som er anskaffet ved hjelp av gelavbildningssystemet.
- Angi skalalinjen ved hjelp av ImageJ-programvare og bruk den på alle bildene.
- Opprett et linjesegment som markerer lengden på brettet ved å klikke på linjeverktøyet.
- Klikk Analyser | Angi skala for å åpne Angi skala-vinduet .
- Skriv inn den faktiske lengden i Kjent avstand og Lengdeenhet.
MERK: Fordi 13 x 13 cm firkantede Petri-retter ble brukt i dette arbeidet, er den faktiske lengden '130', og lengdeenheten er 'mm'. - Merk av for Global .
- Sette inn en skaleringslinje ved å klikke Analyser | Verktøy | Skalalinje, skriv inn Bredde i mm, Høyde i piksler, Skriftstørrelse og velg Farge, Bakgrunn og Plassering på rullegardinmenyen. Du kan også velge Fet tekst, Skjul tekst, Serif-skrift og Overlegg ved å merke av i avmerkingsboksene.
MERK: Valget av disse parametrene bestemmes av brukere og egenskapene til bildene. I denne protokollen ble Bredde i mm satt til 25, Høyde i piksler til 20, Skriftstørrelse til 80, og skalalinjen ble plassert i nedre høyre hjørne ved å velge Plassering | Nederst til høyre. Andre parametere kan velges av brukeren.
- Klikk behandle | Skygger for å forbedre skarpheten i bildet, spesielt grensene (Tilleggsfigur S2A). Klikk Behandle | Bunke for å behandle bilder.
MERK: Formålet med dette trinnet er å gi mer presis grenseavgrensning.- Behandle et bilde som referanse ved å klikke på Behandle | Skygger | Sørover.
- Klikk Behandle | Satsvis | Makro for å åpne Bunkeprosess-vinduet . Se etter følgende kommandoer som vises i vinduet:
run("Sør");
kjør("Lagre");
lukk (); - Skriv inn mappeadressen til de opprinnelige bildene og utdatafiladressen ved å klikke Behandle i vinduet Gruppeprosess .
MERK: Det anbefales å eksportere bilder med skygger til en annen mappe og beholde en kopi av de originale bildene.
- Bruk tryllestavverktøyet (sporing) til å velge svermer individuelt og justere toleransen (dobbeltklikk på tryllestavverktøyet (sporing) til den genererte linjen passer riktig til svermgrensen (tilleggsfigur S2B).
MERK: Klikk først på Tryllestavverktøy (sporing) og velg en sverm på ett bilde. Hvis grensene ikke er riktig avbildet, dobbeltklikker du stavverktøyet (sporingsverktøyet) for å åpne wand-verktøyvinduene , der toleransen kan justeres. - Klikk på Analyser | Mål for å eksportere områdeverdien.
- Gjenta trinn 5.1.1-5.1.5 til alle svermer er målt, lagre resultatene i en .csv fil for videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbeidsflyten som består av fremstilling av gradientsvermplater, inokulering og inkubasjon er vist i figur 1B. For å generere gradient svømte plater helles bunnlagsmediet i propped-up retter ved ~ 4,3 ° fra horisontalplanet (Tilleggsfigur S3), etterfulgt av å helle det øvre lagmediet etter at bunnlaget er helt størknet. Sammensetningen av dobbeltlagsmediet er vist i tabell 1. Deretter pipettes bakteriekulturen over natten inn i testbrønnene og inkuberes ved 37 °C, og opprettholder passende fuktighetsnivåer. Flere testkonsentrasjoner er satt i en gradient svermplate med to eller tre replikeringer (figur 1C). Alternativet for en 3D-utskriftsmodell av deksellokket med kolonneutstikket på testpunktene er vist i supplerende figur S1.
To konstruerte arter, E. coli K12-YdeH og P. aeruginosa PAO1-YdeH, ble testet på arabinose gradientplater. Figur 2A viser overflatesvermprosesstesten i fem brønner, med overlapping mellom tilstøtende brønner. Tre testbrønner ble satt i en plate, som vist i figur 2B,C, som gjorde det mulig å danne ikke-overlappingsgrenser. Bakteriell svermende bevegelighet ble fremmet med en økning i arabinosekonsentrasjonen fra den laveste konsentrasjonen, men ble gradvis begrenset med høyere arabinosekonsentrasjoner. E. coli K12 villtypestamme ble testet på resveratrol gradientplater (figur 2C), innenfor konsentrasjonsområdet 0-400 μM. En beskjeden begrensning av den swarming motility ble observert med økende resveratrol konsentrasjon. Svermområder ble kvantifisert av ImageJ-programvare (Supplemental Figure S2). De svermende kurvene viser flere konsentrasjonsresponser (figur 3).
Figur 1: Skjematisk for induser gradient svermplateforberedelse, inokulasjon og inkubasjon. (A) Over natten vekst av bakteriekultur ved 37 °C. (B) Arbeidsflyt av dobbeltlags induser gradient svermplate. i) Prop opp firkantede Petri retter. ii) Hell bunnlagsmediet og størkne ved romtemperatur. iii) Legg de firkantede Petri-rettene flatt, og hell overlagsmediet. iv) Plateherding. v) Gjøre brønner tilsvarende de markerte posisjonene. vi) Pipette bakteriekultur i brønner. vii) Pakk platene med tetningsfilm eller gummitape. viii) Plasser svermplater i en inkubator på 37 °C. C) Skissere kart over brønner på A4-papir eller 3D-utskriftsmodell. Tre brønner med I) tre replikerer og II) to replikerer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Overflatesvermprosesser på indusergraderingsplater. Bakterielle overflatesvermprosesser fanges ved hjelp av et gelavbildningssystem innen 5 dager etter inokulering. (A) Arabinose indusert overflate swarming prosess av E. coli K12-YdeH. (B) Arabinose indusert overflate swarming prosess av P. aeruginosa PAO1-YdeH. (C) Overflate swarming prosess av E. coli K12 wild-type belastning på resveratrol gradient plate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Overflatesvervekurver representerer flere konsentrasjonsresponser på indusergraderingsplater. Hvert kvantifiserbare datapunkt består av tre replikeringer. (A) Arabinose-indusert svermende motilitet av P. aeruginosa PAO1-YdeH; omtrentlige konsentrasjoner i testbrønner er 0,17 % (m/v), 0,25 % (w/v) og 0,42 % (m/v). (B) E. coli K12 vill-type belastning swarming på resveratrol gradient swarm plate; omtrentlige konsentrasjoner i testbrønner er 67 μM, 200 μM og 335 μM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Øvre lag medium/lysogenibuljongmedium (per 100 ml) | ||
| Tryptone: 1 g | ||
| Natriumklorid: 1 g | ||
| Gjær ekstrakt: 0,5 g | ||
| Agar: 0,7 g | ||
| Middels/induserholdig medium på nederste lag (per 100 ml) | ||
| Tryptone: 1 g | Arbeidskonsentrasjon: | Konsentrasjon av lagerløsning: |
| Natriumklorid: 1 g | ||
| Gjær ekstrakt: 0,5 g | - Resveratrol: 400 μM | - Resveratrol: 100 mM |
| Agar: 0,7 g | ||
| Induser: | - Arabinose: 0,5% (m/v) | Arabinose: 20% (m/v) |
| - Resveratrol lagerløsning: 400 μL | eller 1 % (m/v) | |
| - Arabinose lagerløsning: 2,5 ml eller 5 ml | ||
Tabell 1: Dobbeltlags sverm medium spesifikasjoner.
Supplerende figur S1: 3D-printing modeller av swarm plate lokk. (A) 3 x 3 brønner inkludert tre brønner og tre repliker. (B) 3 x 2 brønner inkludert tre brønner og to repliker. (C) Lag brønner med 3D-utskriftsmodeller. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: Kvantifisering av overflatesvermområde ved hjelp av ImageJ-programvare. (A) Legg til "skygger" i originale bilder (Behandle | Skygger) for å generere kvantifiserbare sværmer med klare grenser. (B) Angi skalalinje (Analyser | Angi skala), velg svermer ved hjelp av Wand (sporing) Verktøy, og eksporter svermområde (Analyser | mål). Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S3: Propped-up firkantet Petri-tallerken for helling av bunnlagsmedium. Hellingsvinkelen er ~ 4,3 °. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Undersøkelse av bakteriell swarming motility på semisolid gradient plater kan være en utfordrende oppgave18,19,20, da det innebærer flere faktorer som substrat viskositet, fuktighet og mellomstore komponenter. Blant disse faktorene spiller agarkonsentrasjon en avgjørende rolle i å bestemme mikrobiell tilbakevending til enten svømming eller swarming motilitet. Etter hvert som agarkonsentrasjonen øker fra 0,3 % (w/v) til 1 % (m/v), vil bakteriell svømmemotilitet begrenses og gradvis skifte til overflatesverm, og agarkonsentrasjon over 1 % (w/v) vil forby både svømming og svermende bevegelighet7. Agarkonsentrasjonen ble fastsatt til 0,7% (w / v) basert på foreløpige eksperimenter, da den viste bedre ytelse enn andre konsentrasjoner.
Denne agarkonsentrasjonen ble også tidligere brukt til å studere mikrobiell chemotaxis21. Redusert agarkonsentrasjon resulterer i et større svermområde, ledsaget av overlappinger mellom tilstøtende brønner, noe som øker vanskeligheten med å kvantifisere sværmområdet på grunn av uklar grenseavgrensning. Relativt høy agarkonsentrasjon resulterer i et lite sværmområde, og reduserer muligheten for overlappinger. Imidlertid kan overdreven agar (>1,0%) forhindre bakteriell overflatesverm. Derfor er det viktig å velge en passende agarkonsentrasjon som kan brukes på alle testarter for å generere sammenlignbare resultater med en standard viskositet.
Isometrisk arrangerte brønner gir lik og passende plass for bakterier å svømme. Arrangementet av brønner kan være forskjellig avhengig av behovene til gradientsvermplater. Overflatesverm kan overlappe på grunn av utilstrekkelig avstand mellom testbrønner (figur 2A), noe som hindrer kvantifiseringen av sværmområdet, spesielt i en langvarig studie. Tre testbrønner ble satt innenfor en svermplate for å teste flere konsentrasjonsresponser samtidig som kolonioverlappingen forhindres (figur 2B, C).
Sammenlignet med en inokulerende nål22, gir holdebrønner fremstilt i disse halvsolide platene et standardisert inokulasjonsvolum. Det ble også funnet holdebrønner for å opprettholde bakteriekulturen, noe som forhindret bakteriell spredning observert i andre metoder som pipettering 23. Hold-brønner gjort ved å sette inn 3D-utskriftsmodeller presenterer klarere og standardiserte inokulasjonsstartsteder. Selv om disse brønnene krever ytterligere forberedelser, reduserer de avviket mellom testpunktene ved å markere inokulasjonsposisjoner på malen. I tillegg kan de eksakte bakterietallene i hver hold-brønn beregnes, noe som forbedrer reproduserbarheten av dataene. Som en forholdsregel kan fort og uforsiktig forberedelse av brønner føre til sprekkdannelse av brønnene, noe som resulterer i variasjon av overflaten som svermer under migrasjon, da mikroberene er tilbøyelige til å bevege seg gjennom sprekkene.
Det må tas hensyn til å unngå splattering av den mikrobielle startkulturen under utarbeidelsen av lastebrønnen og prøvebelastningen, spesielt i svermplater med lav viskositet. Videre må volumet av bakteriekulturen som lastes inn optimaliseres for å minimere tiden som trengs for mikrober for å skalere de indre veggene i hver hold-brønn samtidig som muligheten for søl under platetransport (for bildebehandlingsformål). I dette arbeidet reduserte vi lastevolumet for bakteriekulturen for å minimere muligheten for søl, noe som resulterer i en forsinkelse i bakteriell migrasjon som ofte forveksles med sværmlag24.
Det er nødvendig å tilpasse mediumformuleringen på grunn av forskjellene i viskositet og nødvendige næringskilder mellom motile arter. For noen arter (f.eks. Bacillus subtilis25) kan overflatesverming være rask; Bildeintervallet bør derfor forkortes. Dataassistert sværmområde kvantifisering gir mer presis informasjon enn avstandsmåling av radius26. For å generere klare grenser for beregning av svermområde av ImageJ-programvare, ble en innebygd metode brukt i denne protokollen som legger skygger til de opprinnelige bildene som er anskaffet ved hjelp av gelavbildningssystemet. Hvis en grense av sværmen smelter sammen med den tilstøtende, vil migrasjon mot grensen bli hemmet, hvor disse samfunnene foretrekker å migrere mot de ubebodde områdene på de swarming platene (figur 2A). Disse begrensende faktorene som følge av de overlappende grensene utgjør en betydelig utfordring i å bestemme trekkavstanden til overflaten som svermer, der disse verdiene ikke kan integreres i den frie swarming-prosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Utviklingen av denne teknikken ble støttet av midlene fra Vitenskaps- og teknologidepartementets National Key FoU-plan (2018YF0902604), National Natural Science Foundation of China's Research Fund for International Young Scientists (22050410270) og Shenzhen Institutes of Advanced Technology External Funds (DWKF20190001). Vi vil gjerne gi vår oppriktige takknemlighet til Miss Chen Xinyi for hennes hjelp til å korrekturlese dokumentet og laboratorieledelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P.
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. Brahmachari, P. V., et al. , Springer. Singapore. 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, Pt 10 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
