Summary
כאן, אנו מתארים את השימוש בלוחות הדרגתיים ממריצים כדי להעריך את תנועתיות נחיל החיידקים ובו זמנית להשיג תגובות ריכוז מרובות.
Abstract
תנועתיות נוהרת חיידקית היא פנוטיפ מיקרוביולוגי נפוץ שקהילות חיידקים משתמשות בו כדי לנדוד על פני משטחים חצי-קוליים. בחקירות של תנועתיות נחיל המושרה, ריכוז ספציפי של ממריץ לא יוכל לדווח על אירועים המתרחשים בטווח הריכוז האופטימלי כדי לעורר את התגובות הרצויות ממין. לוחות semisolid המכילים ריכוזים מרובים משמשים בדרך כלל כדי לחקור את התגובה בתוך טווח ריכוז ממריץ. עם זאת, לוחות חצי-סוליד נפרדים מגבירים את הווריאציות בצמיגות בינונית ובתכולת לחות בתוך כל צלחת עקב זמן התגבשות לא יוניפורמי.
מאמר זה מתאר שיטה חד-שלבית לבדיקת תנועתיות נוהרת משטח בו זמנית על צלחת הדרגתית אחת, שבה בארות הבדיקה המסודרות באופן איזומטרי מאפשרות רכישה סימולטנית של תגובות רב-מרכזיות. בעבודה הנוכחית, נחיל פני השטח של Escherichia coli K12 ו Pseudomonas aeruginosa PAO1 הוערכו בתגובה שיפוע ריכוז של ממריצים כגון רזברטרול ו arabinose. מעת לעת, המורפולוגיות של הנחיל צולמו באמצעות מערכת הדמיה כדי ללכוד את כל תהליך נחיל פני השטח.
המדידה הכמותית של מורפולוגיות הנחיל נרכשה באמצעות תוכנת ImageJ, המספקת מידע ניתן לניתוח של אזור הנחיל. מאמר זה מציג שיטת לוח נחיל שיפוע פשוט המספקת מידע איכותי וכמותי על ההשפעות של הממריצים על נחיל פני השטח, אשר ניתן להרחיב כדי ללמוד את ההשפעות של ממריצים אחרים על מגוון רחב יותר של מינים חיידקיים רגש.
Introduction
תנועתיות נוהרת חיידקית מתייחסת להגירה קולקטיבית של תאים חיידקיים על פני השטח של חומר. בנוסף לוחות אגר semisolid שהוכנו במיוחד במעבדה1, פנוטיפ זה נצפה גם על כמה מצעים רכים כגון רקמות בעלי חיים2, משטחים hydrated3, ושורשי צמחים4. בעוד משטח חצי-סוליד נחשב לאחד התנאים הבסיסיים עבור נחיל חיידקים, מינים מסוימים דורשים גם מדיום עשיר באנרגיה כדי לתמוך תנועתיות הנוהרת שלהם5. סיבוב פלאגלה מפעיל הן שחייה והן שחיית תנועתיות שורצת מתאר את תנועתיות חד-תאית בתוך סביבה נוזלית, ואילו נחיל הוא תנועה סינכרונית של אוכלוסייה מיקרוביאלית על פני משטחים חצי-קוליים.
צמיגות מצע משפיעה על תנועתיות חיידקים; מחקרים של חיידקים פתוגניים, כגון הליקובקטר פילורי, הראו כי תנועתיות הפתוגן משתנה בהתאם לצמיגות שכבת המוצין, המושפעת מהחמצה סביבתית במארח האנושי6. כדי לשכפל סביבות אלה, מחקרים קודמים באמצעות ריכוז אגר מעל 0.3% (w / v) להגביל תנועתיות שחייה חיידקית כדי לבצע שינוי הדרגתי לתוך נחיל פני השטח. השימוש בריכוז אגר מעל 1% (w / v) מונע את תנועתיות נחיל של מינים רבים7. דפוסי המושבה הנוצרים על פני השטח הם מגוונים, כולל mat8 ללא תכונות, עין שור9, dendrites10, ו מערבולת11.
למרות הרלוונטיות של דפוסים כאלה עדיין לא ברור, דפוסים אלה נראים תלויים רמזים סביבתיים וכימיים12. רמזים סביבתיים מכסים היבטים שונים, כולל טמפרטורה, מליחות, אור ו- pH, ואילו רמזים כימיים כוללים נוכחות של מולקולות חישת מניין מיקרוביאלי, תוצרי לוואי ביוכימיים וחומרים מזינים. מולקולות איתות של מניין Autoinducer כגון AHL (לקטון הומוסרין N-hexanoyl-L) יכול להשפיע על נחיל פני השטח על ידי ויסות הייצור של פעילי שטח13,14. רזברטרול, תרכובת פיטואלקסין, יכול להגביל תנועתיות נחיל חיידקים15.
בעבודה הנוכחית, אנו חוקרים את ההשפעה של ריכוזים הדרגתיים של רזברטרול על סוג בר Escherichia coli K12 זן ולחקור תנועתיות נחיל arabinose-inducable של מהונדס E. coli K12-YdeH ו Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH מינים. הייצור של האנזים YdeH מושרה על ידי arabinose באמצעות מקדם araBAD, וכתוצאה מכך הפרעה c-di-GMP הסלולר והשפעה על תנועתיות נוהר חיידקים16,17. התנהגות נחיל בלתי ניתנת לחינוך זו נחקרת באמצעות לוחות נחיל הדרגתיים arabinose עם E. coli K12-YdeH ו P. aeruginosa PAO1-YdeH זנים.
לוחות הנחיל ההדרגתיים מוכנים על-ידי מיצוק רציף של מדיום דו-שכבתי (איור 1B). השכבה התחתונה כוללת את המדיום שנוסף עם הממריץ, שנמזג על צד אחד של צלחת פטרי. עם התגבשות השכבה התחתונה, צלחת הפטרי מוחזרת למשטח שטוח, שם מוסיפים את השכבה העליונה המכילה את המדיום ללא הממריץ מהצד השני של הצלחת. לאחר שליחות הנחיל מתגמצמים לחלוטין, בארות ההחזקה המסודרות באופן איזומטרי מיוצרות על ידי חורים משעממים בלוחות הנחיל לאחר פריסה קבועה (איור 1C) או על ידי הטבעת הבארות באמצעות דגם מודפס תלת-ממדי של כיסוי הלוח המכיל יתדות במהלך תהליך הריפוי הבינוני (איור S1 משלים). מערכת דימות ג'ל משמשת ללכידת המורפולוגיות הנוהרות בנקודות זמן שונות (איור 2). ניתוח נחיל פני השטח באמצעות תוכנת ImageJ (איור S2 משלים) מספק תוצאות כמותיות של תהליך נחיל פני השטח (איור 3).
לכן, אנו מציעים שיטה פשוטה כדי לבדוק את תנועתיות נחיל פני השטח בתוך טווח ריכוז של ממריצים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבדוק תגובות ריכוז מרובות של ממריצים אחרים על ידי ערבוב הממריץ למדיום השכבה התחתונה והוא יכול להיות מיושם על מינים אחרים של רגש (למשל, Bacillus subtilis, סלמונלה enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). גישה זו יכולה לספק תוצאות איכותיות וכמותיות אמינות להקרנת ממריץ כימי יחיד, וניתן להשתמש בלוחות נפרדים כדי להעריך יותר ממריצים כימיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת לוחות נחיל הדרגתיים
- הכנת מדיום נחיל
הערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת השוואה קצרה של צמיגות בינונית שונה; 0.7% (w / v) ריכוז אגר של מדיום נחיל שימש בפרוטוקול זה.- להכין אבקת מרק Lysogeny (LB) עם אגר בשני בקבוקונים חרוטיים; כל בקבוק מכיל 2 גרם טריפטון, 2 גרם של נתרן כלורי, 1 גרם של תמצית שמרים, ו 1.4 גרם של אגר. מוסיפים מים מזוקקים כפול (ddH2O) ומערבבים את המתלה באמצעות מוט ערבוב מגנטי. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 200 מ"ל על-ידי הוספת ddH2O נוסף.
- Autoclave את הפתרון ב 121 °C (50 °F) במשך 20 דקות. השתמשו בכובע חדיר לאוויר או בסרט איטום בקבוקים עם פתח אוורור.
הערה: אגר יתמוסס כאשר מחומם ב autoclave. - כאשר הטמפרטורה יורדת ל 65 °C (65 °F), לערבב את הפתרון כדי להבטיח הומוגניות, ולהעביר את המדיום לחממה 65 °C (65 °F) או אמבט מים לשימוש לטווח קצר.
- הכנת מדיום נחיל השכבה התחתונה
הערה: המדיום בשכבה התחתונה הוא התערובת של פתרונות מלאי בינוניים וממריצים של נחיל. הניסוח של לוחות נחיל הדרגתיים ממריץ מוצג בטבלה 1.- הכן פתרון מלאי רזברטרול 100 mM על ידי המסת 114.12 מ"ג של אבקת רזברטרול lyophilized לתוך 5 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO), ולאחסן את הפתרון ב -20 °C (60 °F).
- הכן פתרון 20% (w / v) מניית arabinose על ידי המסת 6 גרם של אבקת arabinose ב 30 מ"ל של ddH2O; לחכות 10-15 דקות כדי לאפשר arabinose להתמוסס; ולאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר.
- להוציא את המדיום מן האינקובטור 65 °C (65 °F) ומניחים אותו בטמפרטורת החדר; אפשר למדיום הנחיל להתקרר עד שבקבוק ארלנמייר יהיה קריר מספיק כדי להחזיק (~ 50 מעלות צלזיוס). אין למקם את מדיום הנחיל בטמפרטורת החדר לתקופות ארוכות, שכן זה יגרום להתגבשות אגר.
- הוסף את הנפח הנדרש של פתרון מלאי הממריץ למדיום הנחיל בטמפרטורה של 50 °C (טבלה 1). השתמש פיפטה כדי לחלק את התמיסה הממריץ במקום לשפוך אותו. מערבבים בעדינות כדי לערבב את הממריץ עם מדיום הנחיל.
הערה: שלב זה מיועד ממריצים שלא ניתן לשעבד באופן אוטומטי. היזהר לא להכניס בועות למדיום.
- הכנת לוחות נחיל הדרגתיים דו-שכבתיים
הערה: המדיום בשכבה העליונה הוא בינוני LB המכיל 0.7% (w/v) אגר.- סמן 13 x 13 ס"מ מרובע פטרי מנות עם שם וזנים ממריצים, והצמד את הכלים מעל קצה המכסים (איור 1B).
- יש להוסיף 40 מ"ל חום בשכבה התחתונה בינונית (50°C) באמצעות פיפטה של 50 מ"ל או צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
הערה: לחלופין, עבור 13 x 13 ס"מ מרובע פטרי מנות, 40 מ"ל שכבה תחתונה בינוני שכבה עליונה מתאימה; עבור 10 x 10 ס"מ מרובע פטרי מנות, 25 מ"ל שכבה תחתונה מדיום שכבה עליונה מתאים. - אפשר למדיום השכבה התחתונה לרפא שנחשף במשך 1 שעות בתוך מכסה מנוע זרימה למינארי. אל תפריעו למנות פטרי המרובעות בזמן שהמדיום מתמצק.
הערה: בעת ריפוי השכבה התחתונה, מדיום נחיל לא מכיל ממריצים צריך להישמר בחממה של 65 מעלות צלזיוס או באמבט מים. - ברגע שהשכבה התחתונה מתגבשת לחלוטין, הסירו את המכסים והניחו את צלחות הפטרי המרובעות בתוך מכסה מנוע זרימה למינארי.
- יש להוסיף 40 מ"ל של מדיום חם מהשכבה העליונה (50°C) באמצעות פיפטה של 50 מ"ל או צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
הערה: מדיום השכבה העליונה אינו מכיל ממריצים. - לרפא את הלוחות הדו שכבתיים על הספסל מכוסה וללא הפרעה במשך 1 שעות. יש לאחסן את הצלחות המוכנות בטמפרטורה של 4 °C (65 °F) למשך עד 24 שעות.
הערה: זמני ריפוי ארוכים יותר יפחיתו את תכולת הלחות ויגבילו את תנועתיות הנחיל.
2. צמיחה של E. coli K12 ו - P. aeruginosa PAO1
- הכן 500 מ"ל של בינוני LB על ידי הוספת 5 גרם של טריפטון, 5 גרם של NaCl, ו 2.5 גרם של תמצית שמרים לתוך ddH2O, ולמעלה את הפתרון ל 500 מ"ל. Autoclave את הפתרון על מחזור נוזלי במשך 20 דקות ב 121 °C (65 °F), ולאחסן אותו ב 4 °C (65 °F).
- הכן 100 מ"ל של 1.5% (w / v) LB-אגר בינוני על ידי הוספת 1 גרם של טריפטון, 1 גרם של NaCl, 0.5 גרם של תמצית שמרים, ו 1.5 גרם אגר לתוך ddH2O ולהעלות את הפתרון ל 100 מ"ל. Autoclave את הפתרון על מחזור נוזלי במשך 20 דקות ב 121 °C (50 °F). מעבירים את המדיום לאמבט מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס כדי למנוע את ההתמצקות של אגר.
- כאשר הבקבוקון הבינוני LB-אגר נוח לאחיזה, מוסיפים 20 מ"ל של מדיום LB-אגר לצלחת פטרי (בקוטר 10 ס"מ) באמצעות פיפטה של 25 מ"ל. השאירו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך הלילה, ואחסנו את צלחת ה-LB-אגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- קח תרביות מלאי המאוחסנות ב -80 °C (80 °F), פס E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1, ו P. aeruginosa PAO1-YdeH זנים על צלחות LB-אגר פטרי באמצעות לולאות חיסון חד פעמיות. דגירה מנות פטרי הפוך לילה ב 37 °C (50 °F).
- בחר מושבות בודדות עבור זנים שונים מן מנות פטרי, לחסן כל מושבה לתוך 5 מ"ל של LB בינוני, ודגר את התרבות ב 37 °C (50 °F) בשייקר מסלולית מעבדה להגדיר ב 220 סל"ד.
- כאשר צפיפות התרבות מגיעה OD600nm ~ 1.0, להסיר את התרבות מן השייקר ולמקם אותו בטמפרטורת החדר. התאם את צפיפות התרבות ל- OD600nm = 1.0, כמתואר בשלב 3.2.1.
3. חיסון ודירה של לוחות נחיל הדרגתיים
- הכנת בארות חיסון
הערה: ניתן להשתמש בדגמי כיסוי להדפסה בתלת-ממד המסוגלים ליצור בארות המופרדות על ידי מרחק סטנדרטי במקום בשיטה המתוארת להלן (איור S1 משלים).- סמנו את מיקומי הבאר על נייר A4 המוצג באיור 1C. הגדר שלושה ריכוזי בדיקה בצלחת פטרי מרובעת אחת עם שניים או שלושה העתקים.
- מניחים את נייר ה- A4 המסומן מתחת ללוח הדרגתי ממוצק. דחוף את הצד הרחב יותר של קצה פיפטה 100 μL לתוך המשטח הבינוני למחצה במיקום המסומן. הקש על קצה הפיפטה עד שתגיע לתחתית המדיום של השכבה העליונה.
- כאשר הקצה נוגע בתחתית, אין להפעיל כוח אנכי על הקצה; סובב בעדינות את הקצה כדי לבודד את התוכן של הבאר הגלילית.
- הזז אופקית את קצות הפיפטה לאורך מרחק קטן מאוד כדי לאפשר זרימת אוויר למקום הצר המוקצה בצד. לחץ על הקצה עם האצבע המורה כדי לחסום את זרימת הגז בתוך הקצה תוך החזקת פיפטה באמצעות האגודל והאצבע האמצעית.
- משוך את הקצה החוצה אנכית, שמירה על תוכן הבאר בקצה תוך משיכתו החוצה.
הערה: אם תוכן הבאר מחליק, יש להפעיל מעט יותר לחץ עם האצבע המורה כדי לאטום לחלוטין את הקצה. - חזור על שלבים 3.1.2 עד 3.1.5 בכל מיקום מסומן. לכסות את צלחת הנחיל לפני החיסון.
- חיסון ודגרה של צלחת הדרגתית
- התאם את צפיפות תרבות הצמיחה הלילית ל- OD600nm = 1.0.
- פיפטה 80 μL של תרבות הצמיחה הלילה לתוך כל באר. אין לשפוך את תרבית החיידקים מחוץ לבארות.
- לעטוף את הצלחות עם סרט איטום. לתצפית ארוכת טווח (3-5 ימים), לעטוף את הצלחות עם סרט גומי מעבדה סטרילי.
הערה: סרט גומי נוטים פחות להישבר. - מניחים מלאה ddH2O בחממה כדי לשמור על לחות בתוך האינקובטור. דגירה את לוחות נחיל שיפוע ב 37 °C (50 °F).
הערה: אין לדגור על לוחות הנחיל הפוך; זה יגרום לתרבות החיידקים לדלוף מהבארות. - דמיינו את לוחית הנחיל מיד לאחר החיסון, ורשמו את זה כנקודת הזמן של 0 שעות .
4. הדמיית משטח חיידקי נוהר
- מוציאים את לוחות הנחיל, אחד בכל פעם, מהחממה כל 12 שעות, מחזיקים את הצלחת אופקית, ומניחים אותם במערכת הדמיית הג'ל (ראו טבלת החומרים).
הערה: אין להשאיר טביעות אצבע על פני הלוחות; להחזיק את הצד של צלחת נחיל עם כפפות נקיות. - בחר מצב הדמיית ג'ל ; לחשוף את צלחת הנחיל לאור לבן; ולהתאים את אורך המוקד כדי לתת את התצוגה הברורה ביותר של נחילים.
הערה: השתמש באותו אורך מוקד עבור כל הלוחות באצווה נתונה. - שפר את הבהירות של הנחילים לתצפית ברורה על ידי התאמת זמן החשיפה ל-300 אלפיות השנייה. התאם את הסף כדי למזער הפרעות מנורית הרקע.
הערה: הסף מותאם בממשק ההפעלה של מערכת הדמיית הג'ל. הגדל ערכים משמאל כדי למזער הפרעות מאורות הרקע; הקטנת ערכים מימין כדי לשפר את הבהירות של הנחילים. בפרוטוקול זה, האזור הוא בדרך כלל בין 6,000 ל -50,000. - שמור את קובץ התמונה לניתוח נוסף. הקלט את זמן ההדמיה, סוג הממריץ, כיוון מעבר הצבע והזנים בקובץ .txt .
5. לכמת את אזור הנחיל באמצעות תוכנת ImageJ
- יבא את קובץ התמונה שנרכש באמצעות מערכת הדמיית הג'ל.
- הגדר את סרגל קנה המידה באמצעות תוכנת ImageJ והחל אותו על כל התמונות.
- צור מקטע קו המסמן את אורך הלוח על-ידי לחיצה על כלי הקו.
- לחץ על נתח | הגדר קנה מידה כדי לפתוח את החלון הגדרת קנה מידה .
- הקלד את האורך הממשי במרחק ידוע וביחידת אורך.
הערה: מכיוון שנעשה שימוש במנות פטרי בגודל 13 x 13 ס"מ מרובעות בעבודה זו, האורך בפועל הוא '130', ויחידת האורך היא 'מ"מ'. - סמן את התיבה כללי .
- הוסף סרגל קנה מידה על-ידי לחיצה על נתח | כלים | סרגל קנה מידה, הקלד רוחב במ"מ, גובה בפיקסלים, גודל גופן ובחר צבע, רקע ומיקום מהתפריט הנפתח. לחלופין, בחר טקסט מודגש, הסתר טקסט, גופן Serif ושכבת-על על-ידי סימון תיבות הסימון.
הערה: הבחירה של פרמטרים אלה נקבעת על-ידי המשתמשים ומאפייני התמונות. בפרוטוקול זה, רוחב במ"מ הוגדר ל - 25, גובה בפיקסלים ל - 20, גודל גופן ל - 80 וסרגל קנה המידה הוצב בפינה השמאלית התחתונה על-ידי בחירה באפשרות מיקום | ימינה למטה. משתמש יכול לבחור פרמטרים אחרים.
- לחץ על תהליך | צללים לשיפור חדות התמונה, במיוחד הגבולות (איור S2A משלים). לחץ על תהליך | אצווה לעיבוד תמונות.
הערה: מטרת שלב זה היא לספק תיחום גבולות מדויק יותר.- עבד תמונה כהפניה על-ידי לחיצה על תהליך | צללים | דרום.
- לחץ על תהליך | | אצווה מאקרו לפתיחת החלון תהליך אצווה . חפש את הפקודות הבאות המוצגות בחלון:
run("South");
להפעיל("שמור");
סגור(); - הקלד את כתובת התיקיה של התמונות המקוריות ואת כתובת קובץ הפלט על-ידי לחיצה על תהליך בחלון תהליך אצווה .
הערה: מומלץ לייצא תמונות עם צללים לתיקיה אחרת ולשמור עותק של התמונות המקוריות.
- השתמשו בכלי שרביט (עקיבה) כדי לבחור נחילים בנפרד ולהתאים את הסבילות (לחץ פעמיים על הכלי שרביט (עקיבה) עד שהקו שנוצר יתאים כראוי לגבול הנחיל (איור S2B משלים).
הערה: ראשית, לחץ על הכלי שרביט (מעקב) ובחר נחיל בתמונה אחת. אם הגבולות לא תוארו כראוי, לחץ פעמיים על הכלי שרביט (מעקב) כדי לפתוח את חלונות כלי השרביט , שם ניתן להתאים את הרגישות . - לחץ על נתח | מדוד כדי לייצא את ערך האזור.
- חזור על שלבים 5.1.1-5.1.5 עד שכל הנחילים יימדדו, שמור את התוצאות בקובץ .csv לניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זרימת העבודה המורכבת מהכנת לוחות נחיל הדרגתיים, חיסון ודגרה מוצגת באיור 1B. כדי ליצור לוחות שחייה הדרגתיים, המדיום של השכבה התחתונה נשפך לתוך כלים נפוחים ב~4.3° מהמישור האופקי (איור S3 משלים), ולאחר מכן שופך את המדיום של השכבה העליונה לאחר שהשכבה התחתונה מתגובקת לחלוטין. הרכב המדיום הדו-שכבתי מוצג בטבלה 1. לאחר מכן, תרבות חיידקים תרבית בן לילה הוא pipetted לתוך בארות הבדיקה, דגירה ב 37 °C (50 °F), שמירה על רמות מתאימות של לחות. ריכוזי בדיקה מרובים נקבעים בלוח נחיל הדרגתי אחד עם שניים או שלושה שכפולים (איור 1C). האפשרות החלופית של דגם הדפסה תלת-ממדי של מכסה הכיסוי עם בליטה טורית בנקודות הבדיקה מוצגת באיור S1 המשלים.
שני מינים מהונדסים, E. coli K12-YdeH ו- P. aeruginosa PAO1-YdeH, נבדקו על לוחות הדרגתיים של ערבינוז. איור 2A מציג את בדיקת תהליך נחיל פני השטח בחמש בארות, כאשר חפיפה מתרחשת בין בארות סמוכות. שלוש בארות בדיקה הוצבו בלוח אחד, כפי שניתן לראות באיור 2B,C, מה שאיפשר היווצרות של גבולות שאינם שולטים. תנועתיות נחיל חיידקים קודמה עם עלייה בריכוז arabinose מהריכוז הנמוך ביותר, אך הוגבלה בהדרגה עם ריכוזי ערבינוז גבוהים יותר. אי קולי זן מסוג K12 נבדק על לוחות הדרגתיים של רזברטרול (איור 2C), בטווח הריכוז של 0-400 מיקרומטר. הגבלה צנועה של תנועתיות נוהר נצפתה עם ריכוז רזברטרול גובר. אזורי נחילכו על ידי תוכנת ImageJ (איור S2 משלים). העקומות הנוהרות מציגות את תגובות הריכוז המרובות (איור 3).
איור 1: סכמטי של הכנת צלחת נחיל הדרגתית ממריץ, חיסון ודגרה. (A) צמיחה לילית של תרביות חיידקים ב-37 °C(B) זרימת עבודה של צלחת נחיל הדרגתית ממריץ דו-שכבתית. i) תוכלו ליהנות ממנות פטרי מרובעות. ii) יוצקים שכבה תחתונה בינונית ומתמצקים בטמפרטורת החדר. iii) מניחים את מנות הפטרי המרובעות שטוחות, ויוצקים את השכבה העליונה בינונית. iv) ריפוי צלחת. v) לעשות בארות המתאימות למיקומים המסומנים. vi) תרבות חיידקים פיפטה לתוך בארות. vii) עטפו צלחות באמצעות סרט איטום או סרט גומי. viii) מניחים צלחות נחיל בחממה של 37 מעלות צלזיוס. ג) מפת סקיצה של בארות על נייר A4 או דגם הדפסה תלת-ממדי. שלוש בארות עם I) שלוש שכפולים ו - II) שתי שכפולים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תהליכי נחיל פני השטח בלוחות הדרגתיים ממריצים. תהליכי נחיל משטח חיידקי נלכדים באמצעות מערכת הדמיית ג'ל בתוך 5 ימים של חיסון. (א) תהליך נחיל פני השטח המושרה על ידי Arabinose של E. coli K12-YdeH. (B) תהליך נחיל פני השטח המושרה על ידי Arabinose של P. aeruginosa PAO1-YdeH. (C) תהליך נחיל פני השטח של E. coli K12 זן פראי על צלחת שיפוע רזברטרול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עקומות נחיל פני השטח מייצגות תגובות ריכוז מרובות בלוחות הדרגתיים של ממריץ. כל נקודת נתונים הניתנת לכימות מורכבת משלושה שכפולים. (א) תנועתיות נחיל המושרה על ידי ערבינוז של P. aeruginosa PAO1-YdeH; ריכוזים משוערים בתוך בארות בדיקה הם 0.17% (w / v), 0.25% (w / v) ו 0.42% (w / v). (B) E. coli K12 סוג פראי זן שורץ על צלחת נחיל שיפוע רזברטרול; ריכוזים משוערים בתוך בארות בדיקה הם 67 מיקרומטר, 200 מיקרומטר ו 335 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| שכבה עליונה בינונית/ליסוגנית בינונית (לכל 100 מ"ל) | ||
| טריפטון: 1 גרם | ||
| נתרן כלורי: 1 גרם | ||
| תמצית שמרים: 0.5 גרם | ||
| אגר: 0.7 גרם | ||
| שכבה תחתונה בינונית/בינונית המכילה ממריץ (לכל 100 מ"ל) | ||
| טריפטון: 1 גרם | ריכוז עבודה: | ריכוז פתרון מלאי: |
| נתרן כלורי: 1 גרם | ||
| תמצית שמרים: 0.5 גרם | - רזברטרול: 400 מיקרומטר | - רזברטרול: 100 מ"ר |
| אגר: 0.7 גרם | ||
| ממריץ: | - Arabinose: 0.5% (w/v) | - Arabinose: 20% (w/v) |
| - פתרון מלאי רזברטרול: 400 μL | או 1% (w/v) | |
| - פתרון מלאי Arabinose: 2.5 מ"ל או 5 מ"ל | ||
טבלה 1: מפרטים בינוניים של נחיל שכבות כפולות.
איור S1 משלים: דגמי הדפסה תלת-ממדיים של מכסה צלחת נחיל. (A) 3 x 3 בארות כולל שלוש בארות ושלושה העתקים. (B) 3 x 2 בארות כולל שלוש בארות ושני שכפולים. (ג) הכינו בארות עם דגמי הדפסה בתלת-ממד. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור S2 משלים: כימות שטח נחיל פני השטח באמצעות תוכנת ImageJ. (א) הוספת 'צללים' לתמונות מקוריות (תהליך | צללים) כדי ליצור נחילים ניתנים לכימות עם גבולות ברורים. (ב) הגדרת סרגל קנה מידה (ניתוח | הגדר קנה מידה), בחר נחילים באמצעות כלי שרביט (מעקב) וייצא אזור נחיל (ניתוח | מידה). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור S3 משלים: צלחת פטרי מרובעת מוצעת למזיגה בינונית של השכבה התחתונה. זווית הנטייה היא ~ 4.3 °. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חקירה של תנועתיות נחיל חיידקים על לוחות הדרגתיים חצי-אולידים יכולה להיות משימה מאתגרת 18,19,20, שכן היא כוללת גורמים רבים כגון צמיגות מצע, לחות ורכיבים בינוניים. בין גורמים אלה, ריכוז אגר ממלא תפקיד מכריע בקביעת חזרה מיקרוביאלית לשחייה או תנועתיות נוהרת. ככל שריכוז אגר עולה מ-0.3% (w/v) ל-1% (w/v), תנועתיות השחייה החיידקית תוגבל ותעבור בהדרגה לנחילות פני השטח, וריכוז אגר מעל 1% (w/v) יאסור הן על שחייה והן על תנועתיות נוהרת7. ריכוז אגר היה קבוע ב 0.7% (w / v) בהתבסס על ניסויים ראשוניים, כפי שהוא הראה ביצועים טובים יותר מאשר ריכוזים אחרים.
ריכוז אגר זה הועסק גם בעבר כדי ללמוד כימוטקסיס מיקרוביאלי21. ירידה בריכוז אגר גורמת לאזור נחיל גדול יותר, מלווה בחפיפות בין בארות סמוכות, מה שמגביר את הקושי לכמת אזור נחיל עקב תיחום גבול לא ברור. ריכוז אגר גבוה יחסית גורם לאזור נחיל קטן, הפחתת האפשרות של חפיפה. עם זאת, אגר מוגזם (>1.0%) יכול למנוע נחיל משטח חיידקי. לפיכך, זה חיוני כדי לבחור ריכוז אגר מתאים שניתן להחיל על כל מיני הבדיקה כדי ליצור תוצאות דומות עם צמיגות סטנדרטית.
בארות המסודרות באופן איזומטרי מספקות מרחב שווה ומתאים לחיידקים לנחיל. סידור הבארות יכול להיות שונה בהתאם לצרכים של לוחות נחיל הדרגתי. נחיל פני השטח יכול לחפוף בשל מרחק לא מספיק בין בארות בדיקה (איור 2A), מה שמעכב את כימות אזור הנחיל, במיוחד במחקר ממושך. שלוש בארות בדיקה נקבעו בתוך צלחת נחיל אחת כדי לבדוק תגובות ריכוז מרובות תוך מניעת חפיפה במושבה (איור 2B, C).
בהשוואה למחט חיסון22, בארות אחזקה שהוכנו בלוחות חצי-סולידים אלה מספקות נפח חיסון מתוקנן. בארות ההחזקה נמצאו גם כדי לקיים את התרבות החיידקית, מניעת התפשטות חיידקים נצפתה בשיטות אחרות כגון צנרת 23. בארות אחיזה המיוצרות על-ידי הכנסת דגמי הדפסה תלת-ממדיים מציגות אתרי התחלת חיסון ברורים ומתוקננים יותר. למרות בארות אלה דורשים הכנה נוספת, הם מפחיתים את הסטייה בין נקודות הבדיקה על ידי סימון עמדות חיסון על התבנית. בנוסף, ניתן לחשב את ספירת החיידקים המדויקת בכל באר החזקה, ולשפר את יכולת הרבייה של הנתונים. כאמצעי זהירות, הכנה חפוזה או רשלנית של בארות עלולה לגרום לפיצוח הבארות, וכתוצאה מכך וריאציה של פני השטח שורצים במהלך הנדידה, כמו החיידקים נוטים לנוע דרך הסדקים.
יש להקפיד להימנע מהתזה של תרבות המתנע המיקרוביאלית במהלך הכנת באר הטעינה וטעינת הדגימה, במיוחד בלוחות נחיל צמיגות נמוכה. יתר על כן, יש לייעל את נפח תרבית החיידקים הטעונה כדי למזער את הזמן הדרוש לחיידקים כדי לטפס על הקירות הפנימיים של כל באר אחיזה תוך מניעת האפשרות של דליפה במהלך הובלת הלוחות (למטרות הדמיה). בעבודה זו, הורדנו את נפח הטעינה של תרבית החיידקים כדי למזער את האפשרות של שפיכה, וכתוצאה מכך עיכוב בנדידת חיידקים כי הוא טועה בדרך כלל עבור lag24 נחיל.
יש צורך להתאים את ניסוח בינוני בשל ההבדלים בצמיגות ומקורות תזונתיים נדרשים בין מינים מוטיבים. עבור מינים מסוימים (למשל, Bacillus subtilis25), נחיל פני השטח יכול להיות מהיר; לכן, יש לקצר את מרווח ההדמיה. כימות אזור נחיל בסיוע מחשב מספק מידע מדויק יותר מאשר מדידת מרחק של radius26. כדי ליצור גבולות ברורים לחישוב שטח נחיל על ידי תוכנת ImageJ, נעשה שימוש בשיטה מובנית בפרוטוקול זה המוסיפה צללים לתמונות המקוריות שנרכשו באמצעות מערכת הדמיית הג'ל. אם גבול הנחיל יתמזג עם הגבול הסמוך, תיעצר ההגירה לכיוון הגבול, שם קהילות אלה מעדיפות לנדוד לכיוון האזורים הפנויים של הלוחות הנוהרים (איור 2A). גורמים מגבילים אלה הנובעים מהגבולות החופפים מציבים אתגר משמעותי בקביעת מרחק הנדידה של נחיל פני השטח, שבו לא ניתן לשלב ערכים אלה בתהליך הנחיל החופשי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
פיתוח טכניקה זו נתמך על ידי הכספים מתוכנית המו"פ הלאומית של משרד המדע והטכנולוגיה (2018YF0902604), הקרן הלאומית למדעי הטבע של קרן המחקר של סין למדענים צעירים בינלאומיים (22050410270) ומכוני שנזן לקרנות חיצוניות טכנולוגיות מתקדמות (DWKF20190001). ברצוננו להביע את תודתנו הכנה למיס צ'ן שינאי על עזרתה בגיהיית המסמך וניהול המעבדה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | V900500 | 500 g |
| Ampicillin | Solarbio | A8180 | 25 g, ≥ 85% (GC) |
| Centrifuge tube | Corning | 430790 | 15 mL |
| Cryogenic vial | Corning | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Aladdin | D103272 | AR, > 99% (GC) |
| L(+)-Arabinose | Aladdin | A106195 | 98% (GC), 500 g |
| Petri dishes | Bkman | B-SLPYM90-15 | Plastic Petri dishes,circular,90 mm x 15 mm |
| Resveratrol | Aladdin | R107315 | 99% (GC), 25 g |
| Sodium chloride | Macklin | S805275 | AR, 99.5% (GC), 500 g |
| Square Petri dishes | Bkman | B-SLPYM130F | Plastic Petri dishes, square, 13 mm x 13 mm |
| Tryptone | Thermo Scientific Oxoid | LP0042 | 500 g |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021 | 500 g |
| Equipments | |||
| Biochemical incubator | Blue pard | LRH-70 | |
| Tanon 5200multi imaging system | Tanon | 5200CE | |
| Thermostatic water bath | Jinghong | DK-S28 |
References
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Kaiser, D. Bacterial swarming: a re-examination of cell-movement patterns. Current Biology. 17 (14), 561-570 (2007).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple environmental factors influence the importance of the phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), 02847 (2018).
- Venieraki, A., Tsalgatidou, P. C., Georgakopoulos, D. G., Dimou, M., Katinakis, P.
- Jones, H. E., Park, R. W. The influence of medium composition on the growth and swarming of Proteus. Journal of General Microbiology. 47 (3), 369-378 (1967).
- Su, C., et al. Influence of the viscosity of healthy and diseased human mucins on the motility of Helicobacter pylori. Scientific reports. 8 (1), 9710 (2018).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Funfhaus, A., et al. Swarming motility and biofilm formation of Paenibacillus larvae, the etiological agent of American Foulbrood of honey bees (Apis mellifera). Scientific Reports. 8 (1), 8840 (2018).
- Armbruster, C. E. Testing the ability of compounds to induce swarming. Methods in Molecular Biology. 2021, 27-34 (2019).
- Julkowska, D., Obuchowski, M., Holland, I. B., Seror, S. J. Comparative analysis of the development of swarming communities of Bacillus subtilis 168 and a natural wild type: critical effects of surfactin and the composition of the medium. Journal of Bacteriology. 187 (1), 65-76 (2005).
- Ingham, C. J., Ben Jacob, E. Swarming and complex pattern formation in Paenibacillus vortex studied by imaging and tracking cells. BMC Microbiology. 8, 36 (2008).
- Shimada, H., et al. Dependence of local cell density on concentric ring colony formation by bacterial species Bacillus subtilis. Journal of the Physical Society of Japan. 73 (4), 1082-1089 (2004).
- Brahmachari, P. V., et al. Quorum sensing regulated swarming motility and migratory behavior in bacteria. Implication of quorum sensing system in biofilm formation and virulence. Brahmachari, P. V., et al. , Springer. Singapore. 49-66 (2018).
- Lindum, P. W., et al. N-Acyl-L-homoserine lactone autoinducers control production of an extracellular lipopeptide biosurfactant required for swarming motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6384-6388 (1998).
- Wang, W. B., et al. Inhibition of swarming and virulence factor expression in Proteus mirabilis by resveratrol. Journal of Medical Microbiology. 55, Pt 10 1313-1321 (2006).
- Zahringer, F., Massa, C., Schirmer, T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylate cyclase YdeH from E. coli. Applied Biochemistry and Biotechnology. 163 (1), 71-79 (2011).
- Kuchma, S. L., et al. Cyclic di-GMP-mediated repression of swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14 requires the MotAB stator. Journal of Bacteriology. 197 (3), 420-430 (2015).
- Heering, J., Alvarado, A., Ringgaard, S. Induction of cellular differentiation and single cell imaging of Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55842 (2017).
- Bru, J. L., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse imaging of bacterial swarms and the collective stress response. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60915 (2020).
- Hölscher, T., et al. Monitoring spatial segregation in surface colonizing microbial populations. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54752 (2016).
- Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Delprato, A. M., Samadani, A., Kudrolli, A., Tsimring, L. S. Swarming ring patterns in bacterial colonies exposed to ultraviolet radiation. Physical Review Letters. 87 (15), 158102 (2001).
- Araujo Neto, L. A., Pereira, T. M., Silva, L. P. Evaluation of behavior, growth, and swarming formation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in culture medium modified with silver nanoparticles. Microbial Pathogenesis. 149, 104480 (2020).
- Kearns, D. B., Losick, R. Swarming motility in undomesticated Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 49 (3), 581-590 (2003).
- Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility. Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).
- Wang, S., et al. Coordination of swarming motility, biosurfactant synthesis, and biofilm matrix exopolysaccharide production in Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology. 80 (21), 6724-6732 (2014).
