Summary
प्रोटोकॉल तेजी से गोल्गी विधि के एक संशोधन का वर्णन करता है, जिसे हिप्पोकैम्पस में न्यूरॉन्स और चूहे के औसत दर्जे के प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स में न्यूरॉन्स को धुंधला करने के लिए तंत्रिका तंत्र के किसी भी हिस्से के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Abstract
गोल्गी गर्भाधान, मामूली अनुकूलन के साथ गोल्गी स्टेनिंग किट का उपयोग करके, चूहे हिप्पोकैम्पस और औसत दर्जे के प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स में डेंड्राइटिक स्पाइन को गर्भवती करने के लिए उपयोग किया जाता है। यह तकनीक गोल्गी गर्भाधान के पिछले तरीकों पर एक उल्लेखनीय सुधार है क्योंकि प्रीमिक्स्ड रसायनों का उपयोग करना सुरक्षित है, न्यूरॉन्स लगातार अच्छी तरह से गर्भवती हैं, बहुत कम पृष्ठभूमि मलबे हैं, और किसी दिए गए क्षेत्र के लिए, प्रयोगों के बीच रीढ़ की हड्डी के घनत्व में बेहद छोटे विचलन हैं। इसके अलावा, मस्तिष्क को एक निश्चित बिंदु के बाद जमा किया जा सकता है और आगे के प्रसंस्करण तक जमे हुए रखा जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके ब्याज के किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र का अध्ययन किया जा सकता है। एक बार दाग और कवर फिसल जाने के बाद, डेंड्राइटिक स्पाइन घनत्व डेंड्राइट की लंबाई के लिए स्पाइन की संख्या की गिनती करके निर्धारित किया जाता है और प्रति 10 μm डेंड्राइट प्रति रीढ़ के घनत्व के रूप में व्यक्त किया जाता है।
Introduction
न्यूरॉन्स को लेबल करने के लिए पोटेशियम डाइक्रोमेट और सिल्वर नाइट्रेट का उपयोग करने की विधि को पहले कैमिलो गोल्गी 1,2 द्वारा वर्णित किया गया था और बाद में सैंटियागो रेमन वाई कैजल द्वारा न्यूरोनल और ग्लियाल उपप्रकारों को अलग करने वाले काम के एक विशाल शरीर का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया गया था। उनके चित्रों के साथ हाल ही में प्रकाशित एक पुस्तक अब उपलब्ध है3. रेमन वाई कैजल के अध्ययन के बाद, जो 100 से अधिक साल पहले प्रकाशित हुए थे, बहुत कम गोल्गी गर्भाधान का उपयोग किया गया था। गोल्गी गर्भाधान एक श्रमसाध्य प्रक्रिया है जो प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ न्यूरॉन्स के तीन आयामी विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है। विधि को आसान बनाने और धुंधला अधिक सुसंगत 4 बनाने के लिए वर्षों से गोल्गी विधि के कई संशोधन किए गएहैं। 1984 में, Gabbott और Somogyi5 ने एकल अनुभाग गोल्गी गर्भाधान प्रक्रिया का वर्णन किया जो अधिक तेजी से प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है। इस गोल्गी गर्भाधान विधि को 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड और 1.5% पिक्रिक एसिड के साथ परफ्यूजन की आवश्यकता होती है, पोस्ट-फिक्सेशन के बाद 3% पोटेशियम डाइक्रोमेट के स्नान में वाइब्रेट सेक्शनिंग होता है। अनुभागों को कांच की स्लाइड पर लगाया जाता है, कवरस्लिप के चार कोनों को चिपकाया जाता है ताकि जब चांदी के नाइट्रेट में डुबोया जाए, तो प्रसार क्रमिक हो। Coverslips तो बंद popped कर रहे हैं, वर्गों निर्जलित कर रहे हैं, और अंततः कवर स्थायी रूप से बढ़ते माध्यम के साथ फिसल गया. इस तकनीक का सफलतापूर्वक हिप्पोकैम्पस में न्यूरॉन्स और ग्लिया 6,7,8 लेबल करने के लिए उपयोग किया गया था। यहां वर्णित तेजी से गोल्गी विधि एक सुधार है क्योंकि पोटेशियम डाइक्रोमेट और सिल्वर नाइट्रेट दोनों के लिए बहुत कम जोखिम है और कोई पैराफॉर्मेल्डिहाइड और पिक्रिक एसिड का उपयोग नहीं किया जाता है। इसके अलावा, हालांकि गैबोट और सोमोगी5 विधि के संशोधनों का उपयोग करके गर्भवती कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा सकता है, अक्सर वर्गों को निर्जलीकरण चरण के दौरान स्लाइड से अधिक या कम उजागर या गिर गया था और आम तौर पर, विश्लेषण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं के लिए कई प्रयोगों को पूल किया जाना था।
वर्तमान प्रोटोकॉल गोल्गी स्टेनिंग किट के उपयोग का वर्णन करता है (सामग्री की तालिका देखें) हिप्पोकैम्पस में डेंड्राइट्स और डेंड्राइटिक स्पाइन्स को लेबल करने के लिए और चूहे के औसत दर्जे का प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (एमपीएफसी)। पिछले लोगों पर इस विधि के फायदे यह हैं कि यह तेजी से है, शोधकर्ता के लिए हानिकारक रसायनों के लिए कम जोखिम है और न्यूरॉन्स का लगातार धुंधला है। नीचे वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कई अध्ययनों में चूहे के हिप्पोकैम्पस और एमपीएफसी में डेंड्रिटिक स्पाइन घनत्व का आकलन करने के लिए मामूली संशोधनों के साथ किया गयाहै 9,10,11,12,13,14,15।
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Protocol
सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को पवित्र हृदय विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया जाता है और जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड के अनुसार हैं।
1. अलगाव और मस्तिष्क के ऊतकों की घुसपैठ
- Premix समाधान गोल्गी स्टेनिंग किट के ए और बी का उपयोग करने से पहले 24 घंटे पहले और अंधेरे की बोतलों और / या अंधेरे में रखें। लगभग 80 मिली लीटर का घोल A और B मिश्रण करें जो 24 घंटे के बाद समाधान को बदलने के लिए पर्याप्त है। एयरटाइट बोतलों में स्टोर करें।
नोट: या तो खारा या paraformaldehyde के साथ परफ्यूजन आवश्यक नहीं है. - कार्बन डाइऑक्साइड इच्छामृत्यु के बाद गिलोटिन द्वारा चूहों की बलि दें और सेकंड के भीतर दिमाग को हटा दें। यदि आवश्यक हो तो खारा में दिमाग कुल्ला लेकिन आवश्यक नहीं है।
- मस्तिष्क, कॉर्टेक्स को नीचे रखें ताकि हाइपोथैलेमस दिखाई दे क्योंकि कटौती एक गैर-झरझरा सतह पर पूर्वकाल और पीछे की ओर की जाती है। एक पूर्वकाल में कटौती (प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स होता है) और पीछे (हिप्पोकैम्पस होता है) ब्लॉक जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है।
- ए और बी के प्रीमिक्स्ड समाधानों में ब्लॉक रखें, यह सुनिश्चित करें कि वे समाधान में अच्छी तरह से डूबे हुए हैं। सुनिश्चित करें कि समाधान A और B की मात्रा ब्लॉकों को विसर्जित करने के लिए पर्याप्त है। कमरे के तापमान पर अंधेरे में या तो भूरे रंग की बोतलों या पन्नी के साथ कवर की गई स्पष्ट बोतलों (प्रकाश को बाहर रखने के लिए) में ब्लॉक स्टोर करें।
- 24 घंटे के बाद समाधान बदलें और कमरे के तापमान पर एक और 13 दिनों के लिए अंधेरे में रखें।
नोट: यदि माउस दिमाग के साथ उपयोग किया जाता है, तो ब्लॉक करने की कोई आवश्यकता नहीं है, और पूरे मस्तिष्क को समाधान में रखा जा सकता है। यदि मस्तिष्क के क्षेत्रों को धुंधला करना, जो आकार में अलग-अलग हैं, तो समाधान ए और बी में समय परीक्षण और त्रुटि द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। - दो सप्ताह के बाद ऊतक को समाधान ए और बी के साथ अच्छी तरह से घुसपैठ किया जाता है, ब्लॉकों को क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान (गोल्गी स्टेनिंग किट में समाधान सी) में स्थानांतरित करें, और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 48-72 घंटे के लिए छोड़ दें।
नोट:: क्रायोप्रोटेक्शन के बाद, ब्लॉक आगे की प्रक्रिया तक जमे हुए हो सकता है। इसके अलावा, ध्यान दें कि किट से सभी समाधान एकत्र किए जाते हैं और खतरनाक कचरे के रूप में निपटाए जाते हैं। - सूखी बर्फ पर एक ग्लास स्लाइड पर, मस्तिष्क, कॉर्टेक्स को नीचे फ्रीज करें। एक बार जमे हुए या तो क्रायोस्टेट पर कटौती करें या क्रायोस्टेट का उपयोग करके सेक्शनिंग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: तरल नाइट्रोजन में फ्रीज न करें क्योंकि यह ऊतक में दरारें पैदा करता है।
2. मस्तिष्क के ऊतकों का विभाजन
- एक पूर्व ठंडा क्रायोस्टेट चक पर ऊतक माध्यम की एक छोटी राशि रखें। क्रायोस्टेट चक पर माउंट ब्लॉक के एक तरफ थोड़ा हाथ में पिघलाकर (gloved) और इसे ऊतक माध्यम पर रखने के द्वारा ब्लॉक।
नोट: ऊतक को एम्बेड करना आवश्यक नहीं है। हिप्पोकैम्पस युक्त ब्लॉक प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स के साथ ब्लॉक की तुलना में कटौती करना कुछ हद तक आसान है क्योंकि उत्तरार्द्ध कॉर्पस कैलोसम के पूर्वकाल में है और दो हिस्से अलग-अलग हैं। - -22 डिग्री सेल्सियस पर एक क्रायोस्टेट पर 100 μm वर्गों में कटौती करें और सबबेड स्लाइड पर माउंट करें। मोटाई के 150 μm तक के वर्गों का उपयोग किया जा सकता है। प्रति स्लाइड 3-4 कोरोनल अनुभागों को माउंट करने का प्रयास करें क्योंकि यह उन स्लाइड्स की संख्या को कम कर देता है जिन्हें प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है। अनुभागों को तब तक जमे रहने के लिए निम्न तकनीकों में से किसी एक का उपयोग करें जब तक कि वे स्लाइड पर न आ जाएं।
नोट: ये अनुभाग सामान्य तरीके से तय नहीं हैं और इसलिए वे जल्दी से पिघलते हैं। अनुभागों को स्लाइड पर पिघलने की अनुमति दें. यदि वे स्लाइड पर रखे जाने से पहले पिघलना शुरू करते हैं, तो उन्हें स्लाइड पर फ्लैट होना असंभव है। ऐसा करने के लिए कई तकनीकें हैं।- चाकू और ब्लॉक पर एक ठंड स्प्रे का उपयोग करें। कमरे में तापमान और आर्द्रता के आधार पर यह हर खंड के लिए आवश्यक हो सकता है। काटने के दौरान अनुभाग को सपाट रखने के लिए या तो एंटीरोल प्लेट या ब्रश का उपयोग करें।
नोट: पर्याप्त ठंड स्प्रे करने के लिए सुनिश्चित करें। 20 ब्लॉक काटते समय कई डिब्बे का उपयोग किया जा सकता है। - Thaw माउंट, यदि संभव हो, एक कमरे के तापमान स्लाइड का उपयोग करके और जल्दी से इसे अनुभाग के लिए appose. अभ्यास के साथ, कोई एक बार में कई वर्गों को माउंट कर सकता है। यदि यह काम नहीं करता है, तो क्रायोस्टेट में स्लाइड रखें ताकि वे बहुत ठंडे हों और ठंडे संदंश या ठंडे पेंटब्रश के साथ अनुभाग को स्थानांतरित करें और फिर माउंट को पिघलाएं।
- चाकू और ब्लॉक पर एक ठंड स्प्रे का उपयोग करें। कमरे में तापमान और आर्द्रता के आधार पर यह हर खंड के लिए आवश्यक हो सकता है। काटने के दौरान अनुभाग को सपाट रखने के लिए या तो एंटीरोल प्लेट या ब्रश का उपयोग करें।
- स्लाइस के बीच पेपर वाइप्स के साथ चाकू को साफ करें। यदि चाकू को अधिक सफाई की आवश्यकता होती है, तो 100% इथेनॉल (ईटीओएच) का उपयोग करें, और अगले स्लाइस को काटने से पहले इसे सूखने दें।
- एक बार स्लाइड पर घुड़सवार होने के बाद, स्लाइड को कार्डबोर्ड स्लाइड ट्रे पर फ्लैट रखें और वर्गों को कमरे के तापमान पर सूखने की अनुमति दें (कई घंटों के लिए अधिकतम 48 घंटे तक) अंधेरे में। स्लाइड ट्रे को कवर न करें। सुनिश्चित करें कि गोल्गी गर्भाधान से पहले अनुभाग पूरी तरह से सूखे हैं। स्टोर फ्लैट, अंधेरे में, स्लाइड ट्रे पर जब तक गोल्गी गर्भाधान.
नोट:: अनुभागों को सुखाने से कोई नुकसान नहीं होता है।
3. धुंधला और मस्तिष्क के ऊतकों के निर्जलीकरण
- कांच धुंधला व्यंजन में धुंधला प्रदर्शन. धुंधला करने से ठीक पहले समाधान डी और ई मिलाएं। प्रोटोकॉल के अनुसार, समाधान डी का एक हिस्सा, समाधान ई का एक हिस्सा और आसुत पानी के दो हिस्से जोड़ें। ग्लास स्टेनिंग व्यंजनों के लिए, वर्गों को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए 200 मिलीलीटर समाधान बनाएं। कोप्लिन जार के लिए, इसके लिए कम मात्रा की आवश्यकता होती है।
- रैक में स्लाइड्स रखें जो अनुभागों तक समाधान पहुंच की अनुमति देने के लिए काफी दूर हैं।
- 4 मिनट (2x) के लिए आसुत पानी में वर्गों को रखें, उन्हें 10 मिनट के लिए गोल्गी गर्भाधान धुंधला समाधान में रखने से पहले। हर 70 वर्गों में धुंधला समाधान बदलें। आसुत जल को पीले रंग में बदलने पर बदल दें।
नोट:: धुंधला चरण के लिए समय महत्वपूर्ण है। बहुत कम पर्याप्त धुंधला और धुंधला होने पर बहुत लंबे कारणों की अनुमति नहीं देता है, जिससे विश्लेषण करते समय डेंड्राइट्स को अलग करना मुश्किल हो जाता है। एक बार धुंधला समाधान से बाहर समय कम महत्वपूर्ण है. - अनुभागों को निम्नानुसार निर्जलित करें: 70% EtOH (5 मिनट), 95% EtOH (5 मिनट; 2x), 100% EtOH (5 मिनट; 2x), समाशोधन एजेंट (5 मिनट; 3x)। सभी समाधानों को अक्सर बदलें, विशेष रूप से 100% EtOH और समाशोधन एजेंट यह सुनिश्चित करने के लिए कि अनुभाग निर्जल रहें।
नोट: यह एक 50% EtOH चरण के माध्यम से जाने के लिए आवश्यक नहीं है। सेल विज़ुअलाइज़ेशन के लिए काउंटरस्टेनिंग की आवश्यकता नहीं है क्योंकि गोल्गी इंप्रेगनेशन पर्याप्त कंट्रास्ट प्रदान करता है। अन्य समाशोधन एजेंटों के उपयोग के रूप में अच्छी तरह से यहाँ इस्तेमाल किया के रूप में अच्छी तरह से काम नहीं किया है ( सामग्री की तालिका देखें). - ग्लास coverslips कि बढ़ते माध्यम की एक उदार राशि के साथ 60 मिमी लंबे हैं के साथ coverslip. सुनिश्चित करें कि वहाँ कर रहे हैं, के रूप में संभव के रूप में कुछ हवा के बुलबुले. यदि आवश्यक हो, तो ध्यान से हटा दें, और कवरस्लिप को फिर से करें (हफ्तों बाद भी किया जा सकता है)। अनुभाग को नुकसान न पहुंचाने के लिए इसे बहुत धीरे-धीरे करें (बढ़ते माध्यम की बड़ी मात्रा के कारण किया जा सकता है)।
नोट: बढ़ते माध्यम की एक बड़ी राशि कुछ हद तक गन्दा है, लेकिन अभी भी आवश्यक है क्योंकि मोटे 100 μm वर्गों को कवर करने के लिए पर्याप्त बढ़ते माध्यम का उपयोग किया जाना चाहिए। - यह सुनिश्चित करने के लिए कि वर्गों पर केवल एक कवरस्लिप रखा गया है, प्रक्रिया से पहले कवरलिप्स को अलग करें।
- एक बार कवर फिसल जाने के बाद, 3-5 दिनों के लिए किसी भी गैर-झरझरा कागज पर सूखी स्लाइड फ्लैट हो जाती है, उन्हें थोड़ा आगे बढ़ाती है, खासकर पहले दिन के बाद, चिपकने से बचने के लिए। 3-5 दिनों के बाद स्लाइड धारकों को स्लाइड स्थानांतरित करें और, आदर्श रूप से, उनकी जांच करने से पहले कम से कम 3 सप्ताह के लिए सूखी स्लाइड। हवा के बुलबुले बनने की संभावना को कम करने के लिए स्लाइड को सपाट रखें।
4. डेंड्राइटिक रीढ़ की हड्डी घनत्व का निर्धारण
- एमपीएफसी और हिप्पोकैम्पस के सीए 1 क्षेत्र दोनों के पिरामिड न्यूरॉन्स में डेंड्रिटिक स्पाइन घनत्व के विश्लेषण के लिए, चरण 4.1.1 (चित्रा 2) में वर्णित सबसे पार्श्व माध्यमिक बेसल डेंड्राइट्स और सबसे पार्श्व तृतीयक एपिकल डेंड्राइट्स की जांच करें।
- एक डेंड्राइट चुनें, एक छवि विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग करके डेंड्राइट की लंबाई को मापें, हाथ काउंटर का उपयोग करके डेंड्राइट्स पर रीढ़ की हड्डी की गिनती करें, और रीढ़ की लंबाई और संख्या दोनों को रिकॉर्ड करें।
- अध्ययन और प्रति मस्तिष्क प्रति क्षेत्र (एमपीएफसी, सीए 1) प्रति छह कोशिकाओं का विश्लेषण करें। प्रति समूह कम से कम छह दिमागों को मापें जैसा कि पहलेवर्णित 7,8 था। न्यूरॉन्स चुनें जो विश्लेषण के लिए निम्नलिखित मानदंडों को पूरा करते हैं: सेल निकायों और डेंड्राइट्स को अच्छी तरह से गर्भवती किया जाता है; डेंड्राइट्स आसन्न कोशिकाओं से अलग होते हैं और निरंतर होते हैं।
- एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ हाथ की गिनती करके 1000x (तेल-विसर्जन) पर रीढ़ की हड्डी की गणना करें और एक छवि विश्लेषण कार्यक्रम का उपयोग करके डेंड्राइटिक लंबाई को मापें। डेंड्राइट की लंबाई से रीढ़ की हड्डी की संख्या को विभाजित करके रीढ़ के घनत्व की गणना करें और डेटा को स्पाइन की संख्या / 10 μm डेंड्राइट के रूप में व्यक्त करें।
नोट: रीढ़ के उपप्रकारों और डेंड्राइटिक आर्किटेक्चर को अलग करने के लिए कहीं अधिक परिष्कृत तरीके हैं जिनका उपयोग किया जा सकता है, लेकिन 1000x पर प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ हाथ की गिनती एक तेजी से परिणाम दे सकती है जो तब यह निर्धारित कर सकती है कि आगे की जांच आवश्यक है या नहीं। यद्यपि लगातार समान डेंड्राइट्स का नमूना लेने के लिए हर संभव प्रयास किया जाता है, लेकिन मोटाई में भिन्नताएं हैं जो गिनती को प्रभावित कर सकती हैं।
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Representative Results
तेजी से गोल्गी विधि का उपयोग करते हुए, कोशिकाओं को लगातार अच्छी तरह से गर्भवती किया जाता है ताकि विश्लेषण करने के लिए बहुत सारी कोशिकाएं हों। यह पूर्व विधियों पर एक उल्लेखनीय सुधार है जहां प्रयोगों को विश्लेषण के लिए पर्याप्त डेटा रखने के लिए पूल किया जाना था। इसलिए, अधिक नमूनों को एक बार में संसाधित किया जा सकता है और प्रसंस्करण तक दिमाग को जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है। हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र में गोल्गी गर्भवती कोशिकाओं के उदाहरण चित्र 3 में कम और उच्च शक्ति पर दिखाए गए हैं। किसी दिए गए क्षेत्र में स्पाइन की गिनती छोटे मानक त्रुटियों के साथ लगातार परिणाम देती है। यह इसलिए भी महत्वपूर्ण है क्योंकि कोई प्रयोगों के बीच तुलना कर सकता है। चित्रा 4 एक प्रयोग को दर्शाता है जिसमें बेसल डेंड्राइटिक स्पाइन घनत्व सीए 1 और एमपीएफसी दोनों में पर्यावरण संवर्धन (ईई) के बाद किशोर पुरुष और महिला चूहों में पिरामिड कोशिकाओं पर बढ़ गया था। संक्षेप में, नर और मादा चूहों को प्रसवोत्तर दिन (पीएनडी) 21 में वीन किया गया था और नियंत्रित या समृद्ध समूहों को सौंपा गया था। ईई समूह ने पीएनडी 24-42 से समृद्ध आवास में 2 घंटे / दिन बिताए, जबकि नियंत्रण समूह को इस समय के दौरान सामान्य पिंजरों में रखा गया था। ईई प्रेरित, दोनों लिंगों के किशोरों में, CA1 और mPFC दोनों में बेसल डेंड्राइटिक रीढ़ की हड्डी के घनत्व में वृद्धि। सभी डेंड्राइटिक स्पाइन मानों में माध्य (SEM) की छोटी मानक त्रुटि पर ध्यान दें।
चित्रा 1: चूहे के मस्तिष्क की वेंट्रल सतह। एक ताजा चूहे के मस्तिष्क की वेंट्रल सतह की तस्वीर जो इंगित करती है कि प्रारंभिक समाधानों में ब्लॉकों को डुबोने से पहले पूर्वकाल और पीछे के ब्लॉकों में कहां कटौती की जाए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: ठेठ पिरामिड सेल. एक पिरामिड सेल की योजनाबद्ध, एपिकल और बेसल डेंड्राइट्स को चित्रित करती है जो डेंड्राइटिक स्पाइन घनत्व के लिए विश्लेषण की जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: गोल्गी गर्भवती न्यूरॉन. चूहे हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र में गोल्गी गर्भवती न्यूरॉन्स के उदाहरण। बाएँ: कई गर्भवती पिरामिड कोशिकाओं. स्केल बार = 25 μm. ऊपरी दाईं ओर: बेसल डेंड्राइट्स। स्केल बार = 12.5 μm. निचले दाएं: एक माध्यमिक बेसल डेंड्राइट का उदाहरण। तीर रीढ़ की हड्डी को निरूपित करते हैं। स्केल बार = 5 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
चित्रा 4: रीढ़ की हड्डी घनत्व. नर (एम) और मादा चूहों (एफ) में नियंत्रण (कॉन) की तुलना में पर्यावरण संवर्धन (ईई) के बाद हिप्पोकैम्पस (सीए 1) के एमपीएफसी और सीए 1 क्षेत्र में बेसल और एपिकल डेंड्राइटिक स्पाइन घनत्व को दर्शाने वाला एक डेटा सेट। हिस्टोग्राम स्पाइन की औसत संख्या/10 μm डेंड्राइट + SEM को दर्शाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। समूह मतभेदों के लिए परीक्षण करने के लिए दो-तरफ़ा (सेक्स एक्स ईई) एनोवा का उपयोग किया गया था और फिशर के एलएसडी परीक्षणों का उपयोग पोस्ट-हॉक विश्लेषण के लिए किया गया था। महत्वपूर्ण प्रभाव p<0.05 हैं। टी एक महत्वपूर्ण अंतर को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल गोल्गी गर्भाधान की एक विधि का वर्णन करता है जो कई वर्गों के तेजी से एक साथ प्रसंस्करण की अनुमति देता है। यह पहलेसे वर्णित 5 अधिक श्रम-गहन तरीकों पर एक सुधार है और लगातार विश्लेषण के लिए गर्भवती न्यूरॉन्स की पैदावार करता है। इसके अलावा, गोल्गी गर्भाधान में उपयोग किए जाने वाले जहरीले रसायनों के संपर्क में कम है। प्रक्रिया का सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा अनुभागों को स्लाइड पर फ्लैट होने के लिए प्राप्त कर रहा है, जो काफी अभ्यास लेता है। ठंड स्प्रे के उपयोग के साथ जितना संभव हो उतना ठंडा रखना आवश्यक है।
एक बार जब स्लाइड सूखी हो जाती हैं और विश्लेषण किया जा सकता है, तो उन कोशिकाओं का चयन करने में सुसंगत होना बहुत महत्वपूर्ण है जिन्हें गिना जाता है। हिप्पोकैम्पस पिरामिड कोशिकाओं को CA1 से चुना जाता है। एमपीएफसी के लिए, जिसमें कई उप-भाग होते हैं, इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स से पिरामिड कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। उन कारणों के लिए जो स्पष्ट नहीं हैं, एमपीएफसी में कम कोशिकाएं हिप्पोकैम्पस के सीए 1 क्षेत्र की तुलना में दागदार होती हैं। इसके अलावा, प्रयोगों को संयोजित करना संभव है जब सभी वर्गों को लॉजिस्टिक कारणों से एक साथ संसाधित नहीं किया जा सकता है। स्थिरता के लिए, एक ही व्यक्ति को कोशिकाओं के दिए गए सेट की गणना करनी चाहिए।
इस विधि की सीमाएं सभी गोल्गी गर्भाधान विधियों के समान हैं। तथ्य यह है कि कोशिकाओं की केवल एक छोटी संख्या दाग कर रहे हैं एक लाभ है. संक्रमित कोशिकाओं की छोटी संख्या तीन आयामों में पूरे सेल के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अनुमति देती है। गोल्गी विधि का नुकसान यह है कि यह स्पष्ट नहीं है कि कोशिकाओं के किस सबसेट को लेबल किया गया है। इसलिए, प्रयोगों में, किसी को यह मानना चाहिए कि नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों दोनों के लिए गर्भवती कोशिकाएं समान हैं। भले ही इस विधि के परिणामस्वरूप पिछले तरीकों की तुलना में कहीं बेहतर धुंधला हो जाता है, लेकिन हमेशा ऐसी कोशिकाएं होती हैं जिनका विश्लेषण नहीं किया जा सकता है क्योंकि वे मलबे, एक हवा के बुलबुले से ढके हुए हैं, या टूटे हुए डेंड्राइट्स हैं।
अंत में, यहां वर्णित तेजी से गोल्गी विधि न्यूरॉन्स के सुसंगत और पुन: प्रस्तुत करने योग्य लेबलिंग के लिए एक तेज, सुरक्षित विधि है जिसका उपयोग किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र के लिए किया जा सकता है। प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स17,18 और हिप्पोकैम्पस10,12,19 में कोशिकाओं को लेबल करने के अलावा, इसका उपयोग अमिगडाला 20, सेरिबैलम21 और कॉर्टेक्स 22 में भी किया गया है। यह मानते हुए कि कोई शरीर रचना विज्ञान से परिचित है और जल्दी से कोशिकाओं की पहचान कर सकता है, रीढ़ की हड्डी के घनत्व की हाथ की गिनती एक त्वरित परिणाम प्रदान कर सकती है, लेकिन यह डेंड्राइटिक उपप्रकारों पर जानकारी प्रदान नहीं करती है जिसके लिए विश्लेषण के अधिक परिष्कृत तरीकों की आवश्यकता होती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को सेक्रेड हार्ट यूनिवर्सिटी अंडरग्रेजुएट रिसर्च इनिशिएटिवग्रेंट्स द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
References
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