Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En etiketfri segmenteringsmetode til intravital billeddannelse af brysttumormikromiljø

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63413
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

Summary

Den intravitale billeddannelsesmetode, der er beskrevet her, anvender kollagen anden harmonisk generation og endogen fluorescens fra den metaboliske co-faktor NAD (P) H til ikke-invasivt at segmentere et umærket tumormikromiljø i tumor-, stromal- og vaskulære rum til dybdegående analyse af 4D-intravitale billeder.

Abstract

Evnen til at visualisere komplekse og dynamiske fysiologiske interaktioner mellem adskillige celletyper og den ekstracellulære matrix (ECM) inden for et levende tumormikromiljø er et vigtigt skridt i retning af at forstå mekanismer, der regulerer tumorprogression. Selvom dette kan opnås gennem nuværende intravitale billeddannelsesteknikker, er det stadig udfordrende på grund af vævets heterogene karakter og behovet for rumlig kontekst inden for den eksperimentelle observation. Til dette formål har vi udviklet en intravital billeddannelsesarbejdsgang, der parrer kollagen anden harmonisk generationsbilleddannelse, endogen fluorescens fra den metaboliske co-faktor NAD (P) H og fluorescens levetidsbilleddannelsesmikroskopi (FLIM) som et middel til ikke-invasivt at opdele tumormikromiljøet i grundlæggende domæner af tumorreden, den omgivende stroma eller ECM og vaskulaturen. Denne ikke-invasive protokol beskriver den trinvise proces, der spænder fra erhvervelse af time-lapse-billeder af brysttumormodeller til efterbehandlingsanalyse og billedsegmentering. Den primære fordel ved denne arbejdsgang er, at den udnytter metaboliske signaturer til at kontekstualisere det dynamisk skiftende levende tumormikromiljø uden brug af eksogene fluorescerende etiketter, hvilket gør det fordelagtigt for humane patientafledte xenograft (PDX) modeller og fremtidig klinisk brug, hvor ydre fluoroforer ikke er let anvendelige.

Introduction

Den ekstracellulære matrix (ECM) i tumormikromiljøet er kendt for at være dynamisk deponeret og ombygget af flere celletyper for yderligere at lette sygdomsprogression 1,2,3. Disse matrixændringer giver både mekaniske og biologiske signaler, der ændrer celleadfærd og ofte resulterer i en fortsat cyklus af matrixombygning4. Undersøgelse af det dynamiske, gensidige samspil mellem tumorceller og den ekstracellulære matrix udføres ofte ved hjælp af tredimensionel (3D) in vitro-kultur eller mikrofluidiske systemer. Mens disse bottom-up-tilgange har vist mekanismer til ECM-ombygning 5,6,7, øget proliferation8, epitel til mesenkym overgang 9,10,11,12 og tumorcellemigration og invasion 7,13,14,15,16 , har deres fokus primært været på nogle få celletyper (f.eks. Tumorceller eller fibroblaster) inden for en homogen 3D-matrix sammenlignet med mangfoldigheden og heterogeniteten af interaktioner, der er til stede i et fysiologisk væv. Ud over in vitro-systemer kan ex vivo tumor histologi også give en vis indsigt i disse celle-celle og celle-ECM-interaktioner17. Immunohistokemi har den fordel, at den er i stand til at analysere flere celletyper med hensyn til ECM's rumligt heterogene sammensætning og arkitektur, men de statiske endepunkter for fast væv fanger ikke den dynamiske karakter af interaktioner mellem celler og mikromiljøet. Intravital billeddannelse har åbnet døren for at forhøre forskellige og dynamiske interaktioner inden for den fysiologiske kontekst af det oprindelige tumormikromiljø.

Mulighederne for intravital tumorbilleddannelse skrider hurtigt frem. Forbedringer i designet af billeddannelsesvinduer og kirurgiske teknikker til implantering af vinduerne har muliggjort langsigtet langsgående tumorbilleddannelse på en række anatomiske steder (dvs. primær tumor, lymfeknuder, metastatiske steder 18,19,20). Desuden bliver optisk instrumenterings kapacitet til at visualisere og indsamle data i flere dimensioner (dvs. spektral, rumlig fluorescensintensitet og levetid) og ved høj opløsning og hastighed (videohastighed) bredt tilgængelig. Den forbedrede teknologi giver mulighed for at udforske hurtige ændringer i cellesignalering og fænotypisk dynamik inden for et fysiologisk miljø. Endelig giver udvidelsen af optogenetiske værktøjer og den brede vifte af genetiske fluorescerende konstruktioner mulighed for mærkning af specifikke celletyper for at fange cellemigration i tumormikromiljø- eller celleafstamningssporing under udvikling eller sygdomsprogression21,22. Brugen af disse værktøjer i kombination med CRISPR/Cas9-teknologien giver forskerne mulighed for at generere unikke dyremodeller i tide.

Mens alle disse fremskridt gør intravital billeddannelse til en stadig mere kraftfuld metode til at udforske dynamiske og fysiologiske cellulære interaktioner, er der stadig et vigtigt behov for at udvikle strategier, der giver rumlig, tidsmæssig og strukturel kontekst på vævsniveau til disse biologiske interaktioner. I øjeblikket kompenserer mange intravitale billeddannelsesundersøgelser for manglen på visuelle landemærker såsom blodkar ved at injicere fluorescerende farvestoffer i vaskulaturen eller anvende musemodeller, der eksogent udtrykker fluorescerende proteiner for at afgrænse fysiske træk. Injicerbare farvestoffer og substrater som fluorescerende dextrans anvendes bredt til med succes at mærke vaskulaturen i intravitale samlinger19, 23, 24. Denne tilgang er imidlertid ikke uden begrænsninger. For det første kræver det yderligere musemanipulationer, og dets anvendelighed er begrænset til kortsigtede eksperimenter. Til langsgående undersøgelser kan fluorescerende dextran være problematisk, da vi observerer akkumuleringen af dextran i fagocytiske celler eller diffusion i det omgivende væv over tid25. Eksogen fluorescerende proteininkorporering i musemodellen er blevet præsenteret som et alternativ til fluorescerende dextrans, men præsenterer sine egne begrænsninger. Tilgængeligheden og mangfoldigheden af eksogene fluoroforer i musemodeller er stadig begrænset og dyr at skabe. Derudover er genetiske manipulationer i specifikke modeller, såsom PDX-modeller, ikke ønskelige eller mulige. Det har også vist sig, at tilstedeværelsen af fluorescerende eller bioluminescerende proteiner i celler anerkendes som fremmede i musen, og inden for immunkompetente musemodeller reducerer dette mængden af metastase på grund af værtsimmunsystemets respons26,27. Endelig optager eksogene fluorescerende proteiner eller fluorescerende farvestoffer, der anvendes til rumlig kontekst eller til at segmentere efterfølgende data, ofte primære områder af lysspektret, der ellers kunne bruges til at undersøge de fysiologiske interaktioner af interesse.

Anvendelsen af det indre signal fra ECM eller endogen fluorescens fra celler i vævet repræsenterer et potentielt universelt etiketfrit middel til at segmentere intravitale data til mere dybtgående cellulær og rumlig analyse. Anden harmoniske generation (SHG) har længe været brugt til at visualisere ECM28. Med den efterfølgende udvikling af vigtige værktøjer til at hjælpe med karakteriseringen af fiberorganisation 29,30,31 er det muligt at karakterisere celleadfærd i forhold til lokal ECM-struktur. Derudover giver autofluorescens fra den endogene metabolit, NAD (P) H, et andet etiketfrit værktøj til at opdele tumormikromiljøet in vivo. NAD(P)H fluorescerer kraftigt i tumorceller og kan bruges til at skelne grænserne for den voksende tumorrede fra den omgivende stroma21,32. Endelig er vaskulaturen en vigtig fysiologisk struktur i tumormikromiljøet og stedet for nøglecelletypespecifikke interaktioner 33,34,35. Excitationen af røde blodlegemer (RBC) eller blodplasma er blevet brugt til at visualisere tumorvaskulaturen, og ved hjælp af to- eller tre-foton-excitation (2P; 3P) har målingen af blodgennemstrømningshastigheder vist sig at være mulig36. Men mens større blodkar let kan identificeres ved deres endogene fluorescenssignaturer, kræver identifikationen af subtile, variable og mindre fluorescerende små blodkar mere ekspertise. Disse iboende vanskeligheder hindrer optimal billedsegmentering. Heldigvis kan disse kilder til endogen fluorescens (dvs. røde blodlegemer og blodplasma) også måles ved fluorescenslevetidsbilleddannelse 37, som udnytter vaskulaturens unikke fotofysiske egenskaber og repræsenterer en nyttig tilføjelse til den voksende intravitale værktøjskasse.

I denne protokol beskrives en arbejdsgang til segmentering af firedimensionel (4D) intravital billeddannelse eksplicit ved hjælp af iboende signaler som endogen fluorescens og SHG fra erhvervelse til analyse. Denne protokol er især relevant for langsgående undersøgelser gennem et brystbilleddannelsesvindue, hvor eksogen fluorescens muligvis ikke er praktisk eller mulig, som det er tilfældet med PDX-modeller. De segmenteringsprincipper, der er skitseret her, er imidlertid bredt anvendelige for intravitale brugere, der undersøger tumorbiologi, vævsudvikling eller endda normal vævsfysiologi. Den rapporterede pakke af analysemetoder vil give brugerne mulighed for at differentiere cellulær adfærd mellem regioner med justerede eller tilfældige kollagenfiberkonfigurationer, sammenligne tal eller adfærd af celler, der er bosiddende i bestemte regioner i tumormikromiljøet, og kortlægge vaskulaturen til tumormikromiljøet ved kun at bruge etiketfrit eller iboende signal. Sammen skaber disse metoder en operationel ramme for at maksimere dybden af information opnået ved 4D intravital billeddannelse af brystkirtlen, samtidig med at behovet for yderligere eksogene etiketter minimeres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle beskrevne eksperimenter blev godkendt af University of Wisconsin-Madisons Institutional Animal Care and Use Committee. Trivsel og smertebehandling i alle dyreforsøg er altafgørende. Således gøres alt for at sikre, at dyret er behageligt og velplejet på hvert trin i proceduren.

1. Generering af brystbilleddannelsesvinduet (MIW)

  1. For at konstruere brystbilleddannelsesvinduet skal du fremstille en 14 mm ring af rustfrit stål af kirurgisk kvalitet.
  2. Rengør den bearbejdede vinduesramme med en varm opløsning af 5% rengøringsmiddel, skyl i 10 minutter under rindende deioniseret vand (DI), blød i 100% ethanol i 10 minutter og tør derefter under en varmelampe. Autoklave den tørrede MIW-ramme og opbevar den til senere brug.
  3. Forbered MIW-dækglas som følger: Blødgør det runde dækglas nr. 1,5 12 mm i 100% ethanol i 10 minutter, tør under en varmelampe, og fastgør derefter til MEW-rammen af metal ved hjælp af cyanoacrylatklæbemiddel. Hærd klæbemidlet natten over.
  4. Rengør den samlede MIW for overskydende klæbemiddel ved hjælp af en acetone gennemblødt vatpind, og rens ved at nedsænke den i 70% ethanol i 10 minutter. Lad det rensede vindue tørre. Forbered MIW på forhånd og opbevar den i en steril petriskål inden kirurgisk implantation.

2. Kirurgisk implantation af MIW

  1. Autoklave kirurgiske værktøjer og desinficere overflader med 70% ethanol, inden operationen for vinduesimplantation påbegyndes.
  2. Udfør kirurgi på en desinficeret bordplade ved hjælp af et varmetæppe dækket af et sterilt felt. Varmetæppet indstilles således, at temperaturen målt oven på det sterile felt er 40 °C.
  3. Brug ekstra kold belysning for at forhindre vævstørring. Brug forstørrelsesglas til at lette den kirurgiske procedure. Brug personlige værnemidler bestående af en steril laboratoriefrakke til engangsbrug, kirurgiske ærmer, handsker, øjenbeskyttelse og ansigtsmaske som anbefalet af den kirurgiske bedste praksis.
  4. Bedøve musen ved hjælp af en anæstesifordampermaskine med en isofluranindstilling på 2,0% og en iltstrømningshastighed på 2,0 l / min. Indfør smertestillende (10 mg/kg meloxicam) ved subkutan injektion.
    BEMÆRK: Giv yderligere doser inden for de første 24 timer, helst hver 8-12 timer i de første 2 dage efter operationen.
  5. Når du er anæstesi (bekræftet af ingen reaktion på tå-klemme), skal du anvende en fugtgivende øjengel for at forhindre tørring af øjnene. Brug en hårfjerningscreme til at fjerne pels på operationsstedet (4. lyskebrystkirtel) efterfulgt af skylning med sterilt vandgennemblødt gasbind.
  6. Forbered det depilerede kirurgiske sted til kirurgi ved at desinficere hudoverfladen med 3 skiftevis betadin og ethanol skrubber.
  7. For at starte operationen skal du forsigtigt løfte huden over den 4. brystkirtel nummer 4 ved hjælp af tang. Når huden er trukket væk fra kropsvæggen, skal du fjerne en ~ 1 mm sektion af det dermale lag ved spidsen af tangen med kirurgisk mikrosaks. Hvis der opstår blødning, skal du anvende blidt tryk med sterilt gasbind, indtil blødningen stopper.
    BEMÆRK: Generelt har større tumorer et større potentiale for at bløde end mindre tumorer eller normalt væv.
  8. Fjern brystkirtlen fra det dermale lag med blide bevægelser af tangen ved den kirurgiske åbning for at undgå at skære den underliggende kirtel.
  9. Opret et 10 mm snit og frigør brystkirtlen fra det dermale lag i periferien, så suturer kan placeres uden at trænge ind i brystkirtlen. Tilsæt PBS for at dække den udsatte kirtel / tumor og for at forhindre tørring.
  10. Opret en pungstrengsutur langs periferien af åbningen ved hjælp af 5-0 silkeflettet sutur. Indsæt en kant af MIW'en, så det dermale lag går i indgreb i MIW'ens modtagende hak.
  11. Stræk forsigtigt epitelet på den modsatte side af MIW'en, og skub metalMIW på plads, så det dermale lag fuldt ud engagerer det modtagende hak omkring hele MIW-omkredsen. Klem pungen stramt for at trække det dermale lag ind i hakket og binde det af for fuldt ud at sikre MIW.
  12. Tilføj et aktuelt antibiotikum til det dermale lag ved MIW, og overvåg kontinuerligt musen, indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal liggende. Hus den MIW-implanterede mus separat på blødt strøelse med en iglo placeret i buret, og lad musen komme sig i 48 timer før billeddannelse.

3. Placering og vedligeholdelse af musen på mikroskopstadiet til billeddannelse

  1. Opsæt varmekammeret på mikroskoptrinnet. Brug et tvungen luftsystem, der er indstillet til 30 °C, eller et andet lignende system. Brug en objektiv varmelegeme for at undgå drift i z-fokus. Lad systemet komme i ligevægt i mindst 1 time før billeddannelse.
    BEMÆRK: Anæstesiiserede mus er ude af stand til korrekt at opretholde deres kropstemperatur, og derfor er det nødvendigt at have et opvarmet miljø for enhver time-lapse erhvervelse . Den objektive varmelegeme hjælper med at bekæmpe virkningerne af termisk ekspansion, et fænomen, der forårsager drift i z-fokus, da objektivlinsen og vævet, der afbildes, kommer til termisk ligevægt.
  2. Når varmekammeret på mikroskopet er stabiliseret ved 30 °C, bedøves modtagermusen med anæstesimaskinindstillinger på 2 % isofluran og iltgennemstrømningshastighed på 2 L/min.
  3. Når musen er bedøvet (bekræftet af manglende reaktion på tåklemme), skal du rengøre ydersiden af MIW-glasset med en bomuldsapplikator og glasrenser, tilsætte øjensalve for at forhindre tørring og om nødvendigt indsætte et halevenekateter.
  4. For at opretholde korrekt hydrering skal du give en indledende injektion på 0,5 ml PBS subkutant eller 100 μL gennem halevenekateteret. Gentag hver 2. time i løbet af billedbehandlingen.
  5. Når musen er blevet ordentligt forberedt, skal du konfigurere mikroskopet til billeddannelse. For at reducere fordampningen under time-lapse-målinger skal du bruge en vandbaseret gel i stedet for vand til nedsænkningsmediet. Dette skal gøres, før musen placeres på scenen. Se tabellen over materialer for detaljer om de optiske komponenter.
  6. Læg musen på mikroskoptrinnet, monter isofluranslangen, og tryk MIW'ens krave ind i et 14 mm modtagehul i sceneindsatsen for at stabilisere billederne. Bring billeddannelsesfeltet i fokus ved hjælp af mikroskopets kikkert og brug lysfeltbelysning til at observere vaskulaturen med blodgennemstrømning.
  7. Kontroller stabiliteten af synsfeltet. Hvis der er vejrtrækningsbevægelsesartefakter til stede, skal du anvende blid kompression på bagsiden af kirtlen med en lille skumblok og et cincture-lignende stykke klæbebånd. Når kompression er påført, skal du kontrollere, at blodgennemstrømningen opretholdes i hele synsfeltet.
  8. Juster regelmæssigt isofluranniveauerne i trin på 0,25 % under billeddannelsessessionen for at opretholde et korrekt niveau af sedation ved manuelt at tælle dyrets åndedræt.
  9. Oprethold en hastighed på 36-40 åndedræt pr. Minut (o / min) for at forbedre dyrets levetid og optisk billeddannelse. Lavere respirationshastigheder kan resultere i, at musen ikke overlever eksperimentet, mens respirationshastigheder over 60 o / min kan resultere i dårlig sedation, hvilket kan øge vejrtrækning og bevægelsesartefakter i billeddataene.

4. Opsætning til 4D, intensitetsbaseret, etiketfri intravital billeddannelse af dynamisk celleadfærd

  1. Når musen er bedøvet og sikkert placeret på det omvendte mikroskopstadium, skal du begynde at lokalisere områder af interesse.
  2. Brug en lyskilde rettet mod MIW til at bruge mikroskopets kikkert til at identificere potentielle områder til undersøgelse. Tilføj og gem x, y-positionerne i softwaren for at vende tilbage til disse positioner.
    BEMÆRK: De fine detaljer i tumoren vil ikke være let synlige med denne type belysning. Målet er simpelthen at identificere regioner til yderligere undersøgelse. Fokus er på at se vaskulatur og blodgennemstrømning.
  3. Når flere positioner er gemt i softwaren, kan du se en forhåndsvisning af de valgte synsfelter ved hjælp af 890 nm excitation og FAD/SHG-filterkuben. Brug en maksimal opholdstid på 4 μs med lavere effekt og høj PMT-indstilling. Målet er at forhåndsvise synsfelterne uden at overeksponere vævet for overdreven laserlys.
  4. Når passende effektniveauer er indstillet, skal du konfigurere z-stakkene. Overhold udseendet af rigelige kollagenfibre (SHG) ved 20-50 μm under MIW's glasoverflade. Kollagen vil blive mindre udbredt, da mikroskopet sektioner dybere ind i tumoren (figur 1B). Hulrum i SHG afslører placeringen af tumormasser.
  5. Sæt den øverste z-skive under laget af ensomme celler, hvor de første kollagenfibre vises ved ~ 50-100 μm. Sæt den nederste z-skive til ~ 250 μm, hvor fibrene falmer ud, og det dårlige signal dominerer. Gentag dette for alle gemte x-y-positioner.
  6. Når z-stack-området er indstillet, skal du øge opholdstiden (op til 8 μs) og optimere effekt- og detektorindstillingerne. Optimer effektniveauerne efter behov for at ophidse vævet til hvert eksperiment. Brug af kræfter op til 90 mW ved 750 nm eller 70 mW ved 890 nm ved målets bageste blænde er inden for et acceptabelt område.
    BEMÆRK: Billeddannelsesdybden, mængden af spredning i vævet, objektive egenskaber og detektorfølsomhed vil alle påvirke den mængde strøm, der er nødvendig for at få et billede, betydeligt.
  7. Juster tidsintervallerne i henhold til eksperimentelle mål. Start med 10 minutters intervaller mellem indsamlingsstederne for de fleste intravitale migrationsfilm.
  8. Selvom 2P-excitation er skånsom mod celler og væv, skal du være opmærksom på tegn på fototoksicitet, som celleblebbing eller hurtigt stigende autofluorescens og overdreven fotoblegning. Reducer lasereffekten, eller øg timelapse-intervallerne, som forholdene indikerer.

5. Fluorescens levetidsbilleddannelse (FLIM) af NAD(P)H

  1. Mens du bevarer x-y-positionerne fra timelapse-erhvervelserne, skal du konfigurere mikroskopet til at indsamle en FLIM-stak. Indsæt et 440/80-filter i en filterholder foran GaAsP-detektoren, og indstil GaAsP-detektorspændingen til 800 i softwaren. Sluk for rumlysene, når detektorerne er tændt.
  2. I softwaren skal du skifte fra den galvanometerbaserede intensitetsbilleddannelse til en FLIM-billeddannelsestilstand.
  3. Med henblik på at identificere og maskere vaskulaturen skal du indstille opløsningen til 512 x 512 pixels. For at indsamle supplerende metabolisk information skal du indstille opløsningen til 256 x 256 pixels for at øge den tidsmæssige opløsning af levetidssignaturen. Indstil opholdstiden til 4 μs, og indstil laseren til 750 nm.
  4. Start scanning af forhåndsvisning, og begynd at justere lasereffekten. Juster lasereffekten, indtil udlæsningen for den konstante fraktionsdiskriminator (CFD) er mellem 1 x 105 og 1 x 106. Overskrid ikke 1 x 106, da dette vil resultere i fotonbunke og dårlige samlede resultater.
  5. Når effektniveauet er indstillet, skal du indstille integrationstiden mellem 90 s og 120 s og starte FLIM-samlingen. Det vil erhverve fotoner fra synsfeltet for den tildelte tid.
  6. Valgfrit: Når alle nødvendige samlinger er foretaget, og musen er fjernet fra scenen, skal du indsamle en instrumentresponsfunktion (IRF). Mål IRF ved at afbilde overfladen af kommercielt tilgængelige urinstofkrystaller i en glasbundsskål med de samme parametre og opsættes, der bruges til billeddannelse af vævet.
    BEMÆRK: IRF tager højde for eventuelle forsinkelser eller refleksioner på grund af den elektroniske eller optiske opsætning. IRF er indviklet i alle FLIM-erhvervelser, og dekonvolvering af det fra dataene kan forbedre nøjagtigheden af beregnede fluorescenshenfaldskurver. Når det er sagt, kan de beregnede IRF'er ofte med rimelighed replikere kvaliteten af fluorescenshenfaldskurverne fra målt IRF. Det er god praksis at måle IRF, indtil det er fastslået, at den beregnede IRF vil give tilsvarende tilpasninger af henfaldskurverne og i tilstrækkelig grad tilnærme resultaterne fra den målte IRF.

6. Analyse af NADH Lifetime-billeder

  1. Åbn FLIM-softwaren, og importer NAD(P)H-levetidsbilledet fra datasættet. For flere detaljer om, hvordan du bruger softwaren korrekt, henvises til de fluorescerende levetidshåndbøger (se tabel over materialer).
  2. Til at begynde med skal du definere modelparametrene i softwaren. Klik på Indstillinger > Model på menulinjen. Markér følgende felter: Indstillinger > Multi-Exponential Decay, Fit Method > MLE, Spatial Binning > Square, Threshold > Peak, og marker Fix Shift før beregning af billede.
  3. Klik på Farve > A1 % på menulinjen i rullemenuen. På højre side af vinduet skal du definere det som en tre-komponent pasform. Indstil papirkurvens størrelse > 3.
  4. Juster tærsklen > ~10. Revurdere tærskelnøjagtigheden, efter at henfaldsmatrixen er beregnet for første gang.
  5. Fix τ1 til 200 ps. Dette repræsenterer den korte levetid for røde blodlegemer. Prøv at finde den værdi, der bedst matcher flere pletter i det større blodkar, hvilket kan ses på intensitetsbilledet. Fix τ2 til 1200 ps. Dette repræsenterer den lange levetid for røde blodlegemer.
    BEMÆRK: De indstillede værdier er kun udgangspunktet. Værdierne skal optimeres for at få vaskulaturen mere frem. I de fleste tilfælde, men ikke altid, vil disse værdier falde.
  6. Vælg Henfaldsmatrix under Beregn på menulinjen. Dette vil generere en indledende A1% levetid billeder med vaskulaturen har høje værdier. Brug markøren (trådkors) til at svæve over vaskulaturen. Systematisk og en ad gangen skal du flyde (fjern markeringen i afkrydsningsfeltet Fix) τ1 og τ2. Optag disse værdier, da de hjælper med at optimere de faste parametre.
    BEMÆRK: Målet er ikke nødvendigvis at få de mest nøjagtige værdier i billedet, men snarere at maksimere forskellen mellem vaskulaturen og vævet uden dramatisk at reducere det område, der er identificeret som vaskulatur.
  7. Når de relevante parametre for τ1 og τ2 er identificeret, skal du vælge Beregn > Batchbehandling på menulinjen. Sørg for, at de fleste indstillinger er ens mellem z-skiver.
  8. Sørg for at kontrollere, at der ikke er nogen indstilling, der er groft anderledes end de andre. I så fald skal du justere skiftet først og prøve igen. Hvis problemet fortsætter, skal du ombygge ved hjælp af nye parametre. Et forkert skift kan være en stor årsag til støj i pasformerne og kan øge A1% værdierne i de tilstødende tumorområder.
  9. På menufanen skal du gemme filerne og derefter eksportere A1% filer. Upload disse filer i ImageJ til maskering og segmentering.

7. Billedsegmentering af vaskulaturen

  1. Åbn ImageJ, og importer A1% -billedet som et tekstbillede. Gentag dette for alle billeder i stakken.
  2. Når alle A1%-billederne er åbnet, skal du vælge Billede > Stack > Z-Project. Brug Max Intensity Projection , og gem billederne. Se Supplerende data 1 for et repræsentativt billede.
  3. Gå til Plugins > Segmentering. Vælg det WEKA-segmenteringsplugin, der kan trænes, 38.
  4. Når WEKA-vinduet åbnes, skal du bruge standardindstillingerne og begynde at træne softwaren ved at oprette to klasser og sporingslinjer over vaskulaturen (høj A1% regioner) og ikke-vaskulatur (lav A1% regioner).
  5. Fortsæt med at tilføje nye spor til de to klasser, indtil softwaren konsekvent identificerer de høje A1% regioner i vaskulaturen, samtidig med at eventuelle højere områder af baggrundsstøj elimineres. Se Supplerende model for repræsentativ klassifikatormodel.
  6. Når det klassificerede billede er produceret, skal du klikke på Billede > Type > 8 Bit. Tærskel billedet og opret en maske. Hvis det tærskelbillede stadig skal ryddes yderligere op, skal du bruge funktionen Analysér partikler .
  7. Juster størrelsen og cirkulariteten, indtil eventuelle mindre og cirkulære områder af det tærskelformede billede er udelukket. En ren maske med kun vaskulaturen og meget lidt baggrund opnås.
  8. Klik på Rediger > selection > Opret markering. Overfør markeringen til ROI-manageren ved at klikke på Analysér > værktøjer > ROI-manager.
  9. Dupliker det klassificerede billede. Fortsæt til Proces > binær. Hvis du vil udvide masken og definere afstanden fra vaskulaturen, der skal medtages i billedsegmenteringen, skal du vælge Udvid. Gentag, indtil masken er udvidet til det ønskede område. Optag dette interesseområde (ROI) i ROI-manageren.
    BEMÆRK: Målet med dette trin er at kvantificere mængden eller adfærden inden for en bestemt nærhed af blodkarret (for eksempel antallet af celler, der er til stede i X μm af blodkarrene). Mængden af udvidelse, der kræves, bestemmes helt af det videnskabelige spørgsmål.
  10. Hvis du vil kvantificere antallet af celler i de restriktive områder, skal du vælge det vindue (billede/kanal), der er af interesse. Dette kan være ethvert vindue, der deler det samme synsfelt som den vaskulære maske. Anvend begge ROI'er ved hjælp af XOR-funktionen fra rullemenuen.
    BEMÆRK: Denne operation måler emnerne inden for den ønskede afstand fra vaskulaturen, undtagen selve vaskulaturen. Denne kombinerede ROI-tilgang kan derefter bruges til at måle en lang række parametre, f.eks. intensitet, celletal eller migrering.

8. Billedsegmentering af tumorreden

  1. Åbn NADH-billedet fra enten en scanning med høj opløsning eller FLIM-samlingen i ImageJ.
    BEMÆRK: Dette kan gøres på individuelle z-skiver, fulde stakke eller anvendes på z-fremskrivninger af et par skiver.
  2. Gå til Plugins > Segmentering. Vælg det WEKA-segmenteringsplugin, der kan trænes.
  3. Når WEKA-vinduet åbnes, skal du bruge standardindstillingerne og begynde at træne softwaren i to klasser af NADH-høje regioner og NADH-lave regioner. De NADH-høje regioner vil have et meget mærkbart mønster af celler med kerner, og softwaren vil let identificere det.
  4. Fortsæt med at skifte frem og tilbage med overlejringen for at forfine algoritmen med yderligere træning, indtil den genkender alle områder af tumoren som bestemt af øjet og forudgående viden om tumormorfologi. Dette er en iterativ proces.
  5. Når algoritmen genkender alle tumorens regioner, skal du vælge knappen Opret resultat . Dette vil producere et nyt billede. Dupliker dette billede.
  6. Vælg det første duplikerede billede, og konverter det til et 8 bit billede ved at vælge Billede > Type > 8 Bit. Tærskel dette billede for at oprette en binær maske. Opret derefter et valg, og overfør det til ROI-manageren. Disse ROI'er definerer stroma.
  7. Vælg det andet af det duplikerede billede, og konverter det til et 8 bit billede. Inverter dette billede ved at vælge Billede > Rediger > Inverter, og tærskel derefter dette billede for at oprette en binær maske. Opret igen et valg og overfør det til ROI-manageren. Denne ROI vil definere tumorreden.

9. Billedsegmentering efter fiberorganisation eller justering

  1. Til at begynde med skal du åbne SHG-billederne, forberede enhver z-projektion og vurdere behovet for enhver forbehandling. For gode resultater kræves billeder i høj kvalitet med mærkbare fibre og lav støj.
  2. Valgfrit: For forbehandling i ImageJ for at øge signal-til-støj (SNR) for SHG-kanalen skal du trække baggrunden fra ved hjælp af en rullende kuglesubtraktion. Til de fleste applikationer skal du bruge en rullekuglesubtraktion mellem 20 pixels og 50 pixels. Udjævn derefter billedet og gem det.
  3. Åbn OrientationJ-pluginet, og indstil behandlingsparametrene. I vinduet OrientationJ skal du definere størrelsen på det lokale tensorvindue. For et 20x billede af denne fibertæthed skal du indstille 10 pixels til 15 pixels som udgangspunkt.
  4. Vælg Kubikspline som gradientmodel, og marker afkrydsningsfeltet Farveundersøgelse. Definer farveundersøgelsen. Indstil både farvetone og mætning som sammenhæng, og definer derefter lysstyrken som originalt billede, tryk på Kør.
  5. Pluginets outputfil er RGB-colormap. Juster værdien af det lokale tensorvindue, indtil justerede områder, som bestemt af øjet, er korrekt fremhævet med blå og magenta nuancer.
  6. Når outputbilledet er tilfredsstillende, skal du adskille dette RGB-billede i 3 kanaler. Vælg Billede > Farve > Delt kanal.
  7. For at forbedre udseendet af justerede områder med henblik på maskering skal du bruge billedberegneren ved at vælge Proces > billedberegner. Brug denne operator til at trække det grønne billede fra det blå billede. For en mere restriktiv maske skal du trække det grønne billede fra det røde billede. For tilfældige områder skal du trække den blå kanal fra den grønne kanal.
  8. Tærskel det resulterende billede ved hjælp af Moments-algoritmen . I de fleste tilfælde bør dette ikke kræve yderligere justeringer. Juster dog, hvis det er nødvendigt. Dette vil producere et binært billede.
  9. Når det binære billede er lavet, skal du udfylde hullerne ved at vælge Proces > binær > Fyld huller mellem fibre og afrunde maskens grænser ved hjælp af et medianfilter. Et medianfilter på 10 er et godt udgangspunkt, juster det for at passe godt til dataene. Kontroller masken manuelt for aftale, og fjern eventuelle ROI'er, der er fejlagtige.
  10. Når masken er tilfredsstillende, skal du oprette en markering ved at vælge Rediger > Markering > Opret markering. Overfør dette valg til ROI-manageren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Installationen af MIW og grundlæggende eksperimentel planlægning er de første skridt i denne proces. Dette særlige MIW-design og -protokol er mere modtagelige for langsgående undersøgelser19 og er blevet brugt med succes med både opretstående og omvendte mikroskoper. I dette tilfælde blev der anvendt et omvendt mikroskop, da det har resulteret i større billedstabilitet i brystkirtlen med færre vejrtrækningsartefakter. I figur 1A giver vi dimensionerne af den stive MIW og et grafisk overblik over implantationsprocessen.

Et typisk synsfelt inden for en etiketfri MMTV-PyMT39 brysttumor (figur 1B-E, figur 3A) er meget heterogen og består af kollagenfibre, talrige stromalceller, masser af tumorceller og vaskulatur (figur 3A). Generelt er kollagenfibre mere rigelige nær vinduet og falder i overflod dybere ind i tumoren (figur 1B-E) Organiseringen af fibrene omkring tumormasserne kan også være ret varieret, ofte med regioner med mere tilfældig organisation i samme synsfelt som regioner med højere justering (figur 2D, H og figur 3I).

For at udvikle en analysepipeline, der kan segmentere intravitale data i perivaskulære regioner, tumor og stroma, fokuserede denne protokol på at bruge signalet fra endogen NAD (P) H og SHG. Mens identifikation af tumor og stroma kan være ligetil, kan identifikationen af perivaskulære regioner i tumormikromiljøet være udfordrende. Vaskulaturen befinder sig ofte inden for de smalle bånd af reduceret NAD (P) H-signal mellem de lyse NAD (P) H + kræftcellemasser. Det er vigtigt at bemærke, at ikke alle mørke grænser har vaskulatur; snarere er nogle mørke områder simpelthen tumorfolder eller stødende op af tilstødende tumorlober (gul pil, figur 2G). Desuden, mens et krydret øje kan udtrække blodkarrene med større diameter fra tumoren, da de har et særpræg, er denne sondring ikke altid triviel. Dette gælder især for fartøjer med mindre diameter, hvor deres udseende kan være mere subtilt og variabelt. I dette tilfælde kan anvendelsen af FLUORESCENSLEVETID FOR NAD(P)H hjælpe med positiv identifikation af vaskulaturen (figur 2B,F). Fluorescenslevetid (FLIM) måler ikke overflod eller intensitet af fotoner på et sted, men den tid det tager for de ophidsede molekyler at udsende en foton og henfalde til deres grundtilstand. Røde blodlegemer (RBC) og blodplasma har vist sig at have en karakteristisk kort og karakteristisk fluorescenslevetid32,37, der kan udnyttes til identifikation og segmentering af kar i væv.

For at bestemme, hvor godt fluorescenslevetiden for NAD (P) H identificerer vaskulaturen intravitalt, blev en 100 μL bolus af en rhodaminmærket dextran injiceret i halevenen efter indsamling af FLIM-billedet. Sammenligninger af maksimale intensitetsfremskrivninger af NAD(P)H FLIM afspejler nøje de beholdere, der er mærket med en fluorescerende mærket dextran (figur 2I-J). Gentagelse af denne fremgangsmåde i flere mus viste, at det gennemsnitlige maskeområde fra FLIM-billedet over området med dextran-masken var 78,6% ± 12,3% (figur 2L). Mens overlejringen ikke var 100%, kortlagde denne teknik nøjagtigt hele det vaskulære netværk. De konstaterede forskelle i de rapporterede områder kan ofte tilskrives problemer med intravital afdrift eller registrering, tyndere beholderdiametre som følge af modelmontering eller tab af fine beholdere som følge af RBC-udelukkelse på grund af trykket fra vækstmassen. Det er vigtigt, at denne teknik fungerer lige så godt i nærvær af både genetisk kodede fluoroforer som GFP eller etiketfri tumormodeller (figur 2D,H), hvilket giver et meget robust og bredt anvendeligt middel til at identificere vaskulaturen til billedsegmentering.

For at afgrænse grænserne for etiketfrie tumormasser blev NAD (P) H autofluorescens (figur 1C) anvendt. Dette kan fanges ved enten uafhængigt at indsamle et NAD (P) H -billede eller opsummere NAD (P) H FLIM -dataene for at generere et intensitetsbillede. Begge veje giver mulighed for passende segmentering af tumormikromiljøet. Som en generel observation fremkalder to-foton-excitation af NAD (P) H i kræftceller lys autofluorescens, der producerer et billede, der viser skarpe individuelle celler med mørkede kerner (figur 2E, G). Dette mønster kan bruges til at definere omfanget af den voksende masse. Mens simpel intensitetsbaseret tærskel for NAD (P) H er mulig for at definere grænsen for tumorrummet, fungerer et trænbart segmenteringsværktøj ofte bedre (figur 3B,E). Nogle andre almindelige udlæsninger, som cellemigration eller cellulær fremspringende analyse, kan drage fordel af genetisk kodet eksogen fluorescens inden for musemodellen eller implantation af fluorescerende mærkede cellelinjer (figur 2A). I disse tilfælde kan opgaven med at afgrænse massens grænse udføres med simpel tærskel for det fluorescerende protein. Nogle gange kan ekspressionen af fluoroforen blive ret heterogen efter implantation. Dette bør ikke forårsage segmenteringsproblemer. Det er også ofte blevet observeret, at tumorer skabt af fluorescerende allografter eller xenografts har mindre opdelte områder af kollagenfibre end tumorer skabt af genetiske tumormodeller som MMTV-PyMT16.

Stromalrummet omfatter regionerne uden for den voksende masse eller mellem voksende masser, og en maske til stroma opnås ved at invertere tumorens ROI (figur 3B-F). Stromalrummet kan derefter opdeles yderligere i sub-ROI'er baseret på kollagenfiberarkitektur. Kollagenfibre er et væsentligt træk i stroma og har en stor mangfoldighed af fiberorganisationer, som er kendt for at modulere celleadfærd40,41. Ofte findes der talrige lokale (<100 μm) regioner med justerede eller tilfældige fibre i billedet16. Derfor blev regioner med relativt justerede (røde / blå nuancer) eller tilfældige (grønne nuancer) fiberorganisation (figur 3I) identificeret med OrientationJ-pluginet. Ved hjælp af OrientationJ-sammenhængende farvekort kan masker baseret på den lokale fiberorganisation oprettes til segmenteringsformål (figur 3J). Disse masker kan derefter overlejres for at analysere differentiel dynamisk stromal celleadfærd (figur 3K) på grund af virkningerne af specifik fiberorganisation (figur 3H, I).

Nu hvor ROI'er for de forskellige rum i tumormikromiljøet er blevet defineret, kan de anvendes på de enkelte rammer eller kanaler i den intravitale timelapse-film. På dette tidspunkt er det vigtigt at understrege, at alle de signaler, der er vist i figur 3A, udelukkende stammer fra endogene kilder. Dette billede demonstrerer det rige potentiale af rumlige og kontekstuelle signaler, der kan komme fra rent endogene, allestedsnærværende og etiketfrie kilder. Her brugte vi MMTV-PyMT-tumormodellen som et eksempel til at illustrere metodens anvendelighed til at kvantificere antallet og egenskaberne af makrofager inden for bestemte steder i tumormikromiljøet (TME). En tidligere intravital undersøgelse42 har vist, at celler, der udsender høje niveauer af FAD-autofluorescens (figur 3A, magentaceller, gule pile), pletter positivt med F4/80-antistoffer og repræsenterer en population af makrofager inden for TME. Ved hjælp af denne arbejdsgang til at segmentere billedet er det muligt effektivt og præcist at undersøge antallet, overvåge celle-celle-interaktioner over tid eller endda observere de metaboliske egenskaber ved denne delmængde af makrofager (magenta) inden for forskellige rum i TME (figur 3A, gule pile). For eksempel kan opførelsen af FAD-høje makrofager, der specifikt befinder sig i NAD (P) H-høj tumor reden, karakteriseres (figur 3E). Tilsvarende kan makrofagernes adfærd med hensyn til den lokale organisering af fibrene i stroma-regionen undersøges. Nogle nylige rapporter har vist, at makrofager og andre migrerende celler i stroma reagerer på mekaniske signaler fra deres lokale mikromiljø 16,43,44. Ved hjælp af fiberjusteringsmaskerne produceret ved denne metode er det muligt at undersøge deres differentielle adfærd mellem regioner i tilfældige og justerede kollagenorganisationer. Endelig kan den samme fokuserede analyse også anvendes til at bestemme antallet og opførelsen af makrofager lokaliseret inden for en defineret nærhed til vaskulaturen. I figur 3G kan vaskulaturen ses med rødt, og makrofager kan igen ses i magenta. En maske til vaskulaturen ved hjælp af NAD (P) H FLIM blev oprettet og derefter udvidet gennem udvidelse af 10 pixels. Den valgte afstand var vilkårlig til demonstrationsformål, men kan optimeres til det enkelte eksperiments særlige behov. Det er vigtigt, at selvom dette billede er af en enkelt z-skive, kan denne procedure let ekstrapoleres til 3D-stakke for at observere adfærd omkring hele fartøjets volumen.

Figure 1
Figur 1: Grafisk abstrakt af brystvinduesimplantation og den underliggende organisering af en MMTV-PyMT-tumor. (A) Dimensionerne af brystbilleddannelsesvinduet og skematisk for den generelle implantationsproces. (B-E) Dette er en montage fra en umærket MMTV-PyMT tumorrepræsentant startende fra 50 μm under overfladen af MIW og fortsætter til en dybde på 80 μm. Dybdeværdierne er angivet under hvert billede. Kollagenfibre (grå) er mere udbredt på overfladen af tumoren (NAD (P) H, blå) end på større dybder. Skalabjælke 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Repræsentativt intravitalt billede af en GFP-mærket og etiketfri PyMT-tumor og validering af NAD (P) H FLIM som markør for vaskulaturen. Et sammensat billede (A) af en typisk allograft af GFP-4T1-celler i brystfedtpuden og en repræsentativ brysttumor fra en MMTV-PyMT-tumormodel (E). NAD(P)H FLIM kortlægger vaskulaturen i begge modeller (B,F). GFP fluorescens (C) og NAD (P) H autofluorescens (G) blev anvendt til at identificere tumoren. Kollagen blev visualiseret af SHG (D,H). Et sammensat billede ved hjælp af NAD (P) H FLIM til at identificere vaskulatur blev valideret ved at sammenligne maksimale intensitetsfremskrivninger af den intravitale stak før og efter haleveneinjektion af fluorescerende dextran (I, J, K). Kvantificeringen af forholdet mellem det område, der bestemmes af NAD(P)H FLIM over det område, der er identificeret ved dextran-injektion i fire mus (farve identificerer individuelle mus) og flere synsfelter (individuelle prikker i grafen) er vist i (L). Skalabjælker 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentativ billedsegmentering ved hjælp af endogen fluorescens inden for etiketfri PyMT-tumor. Et sammensat billede (A) af en enkelt z-skive fra en typisk PyMT-brysttumor blev kun indsamlet ved hjælp af iboende signaler. SHG (grå) visualiserer tumorens kollagenfibre. Fluorescens levetid billeddannelse af NAD (P) H autofluorescens (Tau (τ) middelværdi) rapporterer de metaboliske signaturer af cellerne (grønne til orange nuancer) og placeringen af blodkar (rød). FAD autofluorescens (magenta) identificerer makrofager. Ved hjælp af segmenteringsskemaet, der er skitseret i denne protokol, blev den etiketfrie tumor segmenteret i rum til tumorreden (B,E), stroma (C,F) og vaskulatur (D,G) ved kun at anvende SHG og NAD (P)H autofluorescens. Stroma- og kollagenfibrene (H) kan også klassificeres i lokale regioner af justerede fibre ((vist i magenta / blå), J,K). Skalabjælker 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende data 1: Repræsentativt datasæt af monteret A1 % fra NAD(P)H FLIM. Dette er en maksimal intensitetsprojektion af en monteret A1% fra et typisk datasæt. Det er en repræsentant for kvaliteten af den mulige identifikation og et typisk baggrundsniveau, inden den togbare klassifikator anvendes. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende model: Repræsentativ klassifikator anvendt på monteret A1% til identifikation af vaskulaturen. Dette er en prøveklassifikatormodel til brug i det trænbare WEKA-segmenteringsplugin i ImageJ. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

4D intravital billeddannelse er et kraftfuldt værktøj til at undersøge dynamiske fysiologiske interaktioner inden for den rumlige og tidsmæssige kontekst af det oprindelige tumormikromiljø. Dette manuskript giver en meget grundlæggende og tilpasningsdygtig operationel ramme til opdeling af dynamiske celleinteraktioner inden for tumormassen, den tilstødende stroma eller i nærheden af det vaskulære netværk ved kun at bruge endogene signaler fra anden harmonisk generation eller NAD (P) H autofluorescens. Denne protokol giver en omfattende, trinvis metode fra implantation af billedvinduet til billedoptagelse, analyse og segmentering. Vi mener, at denne teknik vil bidrage til en nødvendig analyseramme til segmentering og kvantificering af 4D intravitale data.

Denne protokol blev udviklet til at være bredt kompatibel med adskillige intravitale musemodeller, herunder umærkede PDX-modeller. PDX'er er en utrolig informativ model45, men udgør en udfordring for intravital billeddannelse, fordi PDX-modellens natur ikke er velegnet til genetisk manipulation. Derfor ville det være en ganske fordelagtigt at have en metode, der kan visualisere og opdele dynamiske interaktioner inden for deres umærkede fysiologiske miljø ved udelukkende at bruge endogene metabolitter som NAD (P) H og anden harmonisk generation (SHG). Ud over at være fordelagtig for PDX-modeller kan denne flerdimensionelle tilgang teoretisk anvendes på enhver intravital undersøgelse i kræft eller normalt væv, der har brug for rumlig og strukturel kontekst for at løse et fysiologisk spørgsmål. NAD (P) H autofluorescens og SHG fra kollagenfibre er allestedsnærværende for alle væv og repræsenterer en universel og gratis ressource i intravitale samlinger. Denne FLIM-tilgang er også robust, da den kan identificere vaskulaturen i nærvær af fluorescens fra eksogene kilder som GFP. Denne tilgang er også fordelagtig, fordi SHG- og NAD(P)H-emission kan visualiseres i det blå spektrum og derved befinder sig i en bølgelængde, der typisk ikke anvendes til billeddannelse af fluorescerende fusionskonstruktioner, der ellers kan være nødvendige for undersøgelsen.

Det aspekt af denne tilgang, der er nyt og har særlig merværdi, er den etiketfri identifikation af vaskulaturen. Mens andre tilgange kan fungere, giver brugen af NAD(P)H's fluorescenslevetid let en klar signatur uden behov for yderligere mærkning. Dataene viser, at de livstidsdefinerede kar afspejler vaskulaturen mærket fra haleveneinjektion af fluorescerende dextran, guldstandarden for vaskulaturbilleddannelse. Vores teknik udmærker sig ved at visualisere mindre blodkar sammenlignet med simpel to-foton eller tre-foton excitation, hvor større kar let visualiseres, men mindre kræver mere ekspertise at identificere. Livstidssignaturen er entydig for alle fartøjer, uanset størrelse. Desuden kan denne yderligere NAD (P) H FLIM-erhvervelse let kombineres med andre markører til segmentering af tumormikromiljøet. Gennem en enkelt FLIM-erhvervelse af NAD (P) H er kravene til definition af vaskulatur, tumorrede og stroma opnåelige. FLIM-kollektionen kan indarbejdes i det eksisterende eksperimentelle design ved at indsamle en enkelt erhvervelse i slutningen eller begyndelsen af en tidsserie eller sammenflette samlingerne gennem hele 4D-erhvervelsen. Bestemmelse af den passende mængde FLIM-billeder afhænger af specifikke eksperimentelle behov og begrænsninger, såsom anskaffelsesintervaller, eksperimentel varighed eller billedstabilitet, men der kræves mindst en FLIM-samling pr. 4D-serie til denne metode.

Denne proces med at anvende NAD(P)H FLIM til identifikation af vaskulaturen kræver matematisk tilpasning af FLIM-dataene til en eksponentiel funktion af formen

Equation 1

med A1+A2+A3=1. Mens de fleste livstidsbilleder af NAD(P)H, der er rapporteret i litteraturen, er monteret som en bi-eksponentiel, blev NAD(P)H i denne applikation monteret som en tri-eksponentiel, hvor τ1 og τ2 er indstillet til de rapporterede værdier af RBC'er, og τ3 får lov til at flyde. Det er vigtigt, at målet ikke er at opnå den mest nøjagtige levetidsværdi, men snarere at give et optimalt billede til segmentering. Når τ1- og τ2-værdierne oprindeligt fastsættes til de rapporterede værdier af RBC's32,46, og matrixen beregnes, vil blodkarrene skille sig ud med A1% værdier større end 60% i blodkarrene og A1% værdier generelt mindre end 40% i den tilstødende tumor. Det næste skridt er at forsøge at maksimere A1% i blodkarrene, samtidig med at A1% minimeres i den tilstødende tumor. Dette er en iterativ proces, og ved afslutningen af den vil A1% -værdierne af blodkarrene være større end 90% med A1% -værdierne af tumoren mindre end 10%. Når A1% -værdierne for blodkarrene er ensartet høje, og baggrunden er ensartet lav, skal du eksportere disse A1% -filer til et trænbart segmenteringsværktøj. Dette vil hurtigt fjerne eventuel resterende støj og definere ROI for vaskulaturen.

Da brystfedtpuden er placeret uden for kropshulrummet, er operationen minimalt invasiv, og de bedste resultater opnås ved at implantere MIW over den 4. lyskebrystkirtel. Tidspunktet for vinduesimplantation, og hvornår eksperimentet skal udføres, er kritisk. Det er bedst at tillade 24 - 48 timers heling efter operationen før det fysiologiske tidspunkt, der vil blive undersøgt. Mens selve proceduren kun kræver et lille snit (≈ 10 mm) for at indsætte vinduet (figur 1A), vil helingstiden efter operationen tillade enhver betændelse og væsker, der akkumuleres på grund af implantationsprocessen, at rydde. Desuden vil det også gøre det muligt for tumoren at fortsætte med at vokse ind i vinduet. Begge faktorer vil forbedre den samlede billedkvalitet ved at mindske opacitet/spredning og øge billedstabiliteten. Den næste ting at overveje er den planlagte samlede varighed af eksperimentet. Mens disse vinduer blev designet til langsgående undersøgelser, medfører vinduets stive karakter en frist på 2 til 3 uger. Efter denne tidsperiode har vinduet en tendens til at løsne sig fra det dermale lag og derved forurene og afslutte eksperimentet. Hvis en longitudinel undersøgelse af brystkirtlen ikke er påkrævet, kan andre intravitale metoder som en terminal hudklapprocedure22 , der eliminerer den kirurgiske implantation af en MIW, være en bedre løsning. Hudklapproceduren giver bedre adgang til hele kirtlen, da den ikke er begrænset af MIW'ens placering og dimensioner, og det kan give større billedstabilitet, da kirtlen trækkes væk fra kropshulrummet. Uanset den intravitale billeddannelsesmetode er segmenteringen af mikromiljøet ved hjælp af endogen fluorescens stadig bredt anvendelig til efterfølgende billedanalyse. Den sidste ting at overveje er varigheden af det enkelte billeddannelseseksperiment. Det er ikke urimeligt at erhverve film, der varer 6-8 timer. Under de længere samlinger bliver hydrering imidlertid et problem, og der kræves nøje overvågning af musens helbred.

En væsentlig fordel ved denne metode er, at de forskellige billeder af endogen fluorescens, der kræves til segmentering af tumormikromiljøet, kan indsamles med relativ lethed og uden yderligere manipulationer til musen. Med filter/dichroic-kombinationen, der er rapporteret her (Table of Materials), kan både SHG- og NADH-billeder erhverves med det samme filtersæt ved at skifte bølgelængder fra 890 nm til 750 nm. Selvom dette skaber en anskaffelsesforsinkelse, påvirker det ikke efterfølgende billedsegmentering. Det er også vigtigt at huske, at denne metode blot udgør et udgangspunkt for en segmenteringsteknik ved hjælp af endogen fluorescens, og mere avancerede optiske konfigurationer kan muliggøre samtidige erhvervelser, hvis det er nødvendigt.

Der er begrænsninger ved at bruge FLIM til at identificere vaskulaturen. FLIM-tilgangen kræver specialiseret elektronik, instrumentering og ekspertise til at indsamle. Imidlertid er alle disse krav i stigende grad integreret i moderne mikroskoper og mere tilgængelige ved brug af billedbehandlingskernefaciliteter. FLIM er blevet en moden teknologi, og at erhverve gode data kræver ikke meget træning. En anden begrænsning er, at FLIM-opkøb er tidskrævende. Mens billedhastigheden for et billede indsamlet med fluorescerende dextran er omkring et sekund eller mindre, kan den gennemsnitlige FLIM-samling variere fra 60 s til 120 s, hvilket kan være uoverkommeligt, hvis de fysiologiske tidspunkter er kortere end det. FLIM-identifikation af vaskulaturen er ikke beregnet til at erstatte al haleveneindsprøjtet fluorescerende dextran eller multifoton-excitation af vaskulaturen; snarere er det endnu en tilgang i den voksende værktøjskasse til intravital billeddannelse. Desuden forventer vi, at længere opkøbstider vil blive gjort dramatisk kortere i de kommende år. Detektorerne og elektronikken forbedres hurtigt, hvilket reducerer detektorens dødtid og dermed kræver kortere anskaffelsesperioder for at fange det samme antal fotoner. En anden grund til at være optimistisk med hensyn til kortere anskaffelsestider er fremkomsten af maskinlæringssoftware eller billedgendannelsesalgoritme som CSBDeep47. Disse algoritmer kan potentielt trænes til at arbejde med kortere eksponeringstider og derved reducere antallet af fotoner, der er nødvendige for nøjagtigt at identificere strukturer til segmenteringsformål. Tilsammen kan dette hurtigt reducere de tidsrammer, der er nødvendige for disse flerdimensionelle erhvervelser.

Brugen af intravital billeddannelse vil kun blive vigtigere, da forskere forsøger at opklare de mange komplekse celle-celle- og cellematrixinteraktioner, der forekommer inden for det fysiologiske tumormikromiljø. Derfor er der behov for fortsat udvikling inden for opkøbs-, segmenterings- og analysekapaciteten. Med henblik herpå er det vigtigt ikke at overse potentialet i endogen fluorescens til segmentering af mikromiljø. I denne protokol blev det endogene signal fra SHG- og fluorescensmetabolitter, herunder NAD(P)H-intensitet og FLIM, anvendt til segmenteringsformål under intravital billeddannelse af bryst-TME. Andre endogene metabolitter eller iboende egenskaber kan give yderligere signaler for at afsløre den dynamiske gensidighed af tumorceller og mikromiljø. For eksempel kan FAD bruges til at overvåge bevægelsen af immunpopulationer42, 3P-generation kan fremhæve strukturelle træk som plasmamembraner eller fedt36, og elastinfluorescens kan bruges til at adskille arterier fra vener46. Derfor vil endogen fluorescens fortsat give en rig flerdimensionel platform, der bør udnyttes fuldt ud, da forskningssamfundet fortsætter med at opbygge værktøjskassen til intravital mikromiljøsegmentering og analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende NCI R01 CA216248, CA206458 og CA179556 tilskud til finansiering af dette arbejde. Vi vil også gerne anerkende Dr. Kevin Eliceiri og hans billedbehandlingsgruppe for deres tekniske ekspertise i den tidlige udvikling af vores intravitale program. Vi takker også Dr. Ben Cox og andre medlemmer af Eliceiri Fabrication Group ved Morgridge Institute for Research for deres væsentlige tekniske design i de tidlige faser af MIW. Dr. Ellen Dobson hjalp med nyttige samtaler om ImageJ-træningsværktøjet WEKA-segmenteringsværktøj. Derudover vil vi gerne takke Dr. Melissa Skala og Dr. Alexa Barres-Heaton for rettidig brug af deres mikroskop. Til sidst vil vi gerne takke Dr. Brigitte Raabe, D.V.M, for alle de tankevækkende diskussioner og råd om vores musehåndtering og -pleje.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 12mm round cover glass Warner Instruments # 64-0712 MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection BD 309659 Syringe
20x objective Zeiss 421452-988 Water immersion
27G needle for SQ injection Covidien 1188827012 Needle
40x objective Nikon MRD77410 Water immersion
5-0 silk braided suture Ethicon K870 Suture for MIW implantation
Artificial tears gel Akorn NDC 59399-162-35 Eye gel
Betadine solution, 5% Fisher Scientific NC1558063 Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator Fisher Scientific 23-400-101
Cyanoacrylate adhesive Loctite 1365882 MIW construction
fluorescent dextran Sigma T1287-50mg intravenous labelling of vasculature
forceps Mckesson.com Miltex #18-782 stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube Hamamatsu 
heating blanket CARA 72 heating pad  038056000729 Temperature selectable
heating chamber home built
Fluorescent lifetime handbook Becker and Hickl https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base Nikon
Isoflurane Akorn NDC 59399-106-01 Anesthesia
Liqui-Nox Fisher Scientific 16-000-125 MIW cleaning
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10 Analgesic
Micro Hose Scientific Commodities INC.  BB31695-PE/1
multiphoton scan head Bruker Ultima II Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter Chroma 284994 ET 440/80 m-2P
Nair CVS 339826 Depilatory cream
objective heater Tokai Hit STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter Chroma 320740 ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner Amazon.com B00814ME24 Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board Becker and Hickl
surgical light FAJ B06XV1VQVZ Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors Excelta 366 stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment Actavis Pharma NDC 0472-0179-34 Antibiotic
TV catheter Custom BD 30G needle: 305106 Catheter for TV injection
Two photon filter Chroma 320282 ET585/65m-2P
two-photon laser Coherent charmeleon Tunable multiphoton laser
ultrasound gel Parker PKR-03-02 Water immersion gel
Urea crystals Sigma U5128-5G Optional: FLIM IRF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
  2. Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
  3. Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
  4. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120 (2020).
  5. Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
  6. Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
  7. Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173 (2020).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
  9. Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
  10. Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
  11. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  12. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
  13. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
  14. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
  15. Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
  16. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  17. Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
  18. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  19. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490 (2019).
  22. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  23. Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
  24. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  25. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  26. Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
  27. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  28. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  29. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007 (2014).
  30. Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  31. Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
  32. Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
  33. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  34. von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), New York, N.Y. 925-938 (2013).
  35. Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
  36. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125 (2018).
  37. Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
  38. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), Oxford, England. 2424-2426 (2017).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  41. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  42. Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086 (2016).
  43. Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787 (2020).
  44. Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850 (2019).
  45. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
  46. Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171 (2017).
  47. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).

Tags

Kræftforskning nummer 183
En etiketfri segmenteringsmetode til intravital billeddannelse af brysttumormikromiljø
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burkel, B. M., Inman, D. R.,… More

Burkel, B. M., Inman, D. R., Virumbrales-Muñoz, M., Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (183), e63413, doi:10.3791/63413 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter