Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

स्तन ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए एक लेबल-मुक्त विभाजन दृष्टिकोण

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63413
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

Summary

यहां वर्णित इंट्रावाइटल इमेजिंग विधि कोलेजन दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी और चयापचय सह-कारक एनएडी (पी) एच से अंतर्जात प्रतिदीप्ति का उपयोग करती है, जो 4 डी इंट्रावाइटल छवियों के गहन विश्लेषण के लिए ट्यूमर, स्ट्रोमल और संवहनी डिब्बों में एक अनलेबल ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को गैर-आक्रामक रूप से विभाजित करती है।

Abstract

एक जीवित ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर कई सेल प्रकारों और एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के बीच जटिल और गतिशील शारीरिक बातचीत की कल्पना करने की क्षमता ट्यूमर की प्रगति को विनियमित करने वाले तंत्र को समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है। हालांकि इसे वर्तमान इंट्रावाइटल इमेजिंग तकनीकों के माध्यम से पूरा किया जा सकता है, यह ऊतकों की विषम प्रकृति और प्रयोगात्मक अवलोकन के भीतर स्थानिक संदर्भ की आवश्यकता के कारण चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। इस अंत में, हमने एक इंट्रावाइटल इमेजिंग वर्कफ़्लो विकसित किया है जो कोलेजन दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी इमेजिंग, चयापचय सह-कारक एनएडी (पी) एच से अंतर्जात प्रतिदीप्ति, और प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (एफएलआईएम) को गैर-आक्रामक रूप से ट्यूमर घोंसले के मूल डोमेन में ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को विभाजित करने के साधन के रूप में जोड़ता है, आसपास के स्ट्रोमा या ईसीएम, और वास्कुलचर। यह गैर-इनवेसिव प्रोटोकॉल स्तन ट्यूमर मॉडल के समय-अंतराल छवियों के अधिग्रहण से लेकर पोस्ट-प्रोसेसिंग विश्लेषण और छवि विभाजन तक चरण-दर-चरण प्रक्रिया का विवरण देता है। इस वर्कफ़्लो का प्राथमिक लाभ यह है कि यह बहिर्जात फ्लोरोसेंट लेबल के उपयोग के बिना गतिशील रूप से बदलते लाइव ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को संदर्भित करने के लिए चयापचय हस्ताक्षरों का शोषण करता है, जिससे यह मानव रोगी-व्युत्पन्न (पीडीएक्स) मॉडल और भविष्य के नैदानिक उपयोग के लिए फायदेमंद हो जाता है जहां बाहरी फ्लोरोफोरस आसानी से लागू नहीं होते हैं।

Introduction

ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) को गतिशील रूप से जमा करने के लिए जाना जाता है और रोग की प्रगति को आगे बढ़ाने के लिए कई सेलप्रकारों द्वारा फिर से तैयार किया जाता है 1,2,3। ये मैट्रिक्स परिवर्तन यांत्रिक और जैविक दोनों संकेत प्रदान करते हैं जो सेल व्यवहार को बदलते हैं और अक्सर मैट्रिक्स रीमॉडलिंग 4 के निरंतर चक्र में परिणाम देतेहैं। ट्यूमर कोशिकाओं और बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स के बीच गतिशील, पारस्परिक इंटरप्ले में जांच अक्सर विट्रो संस्कृति या माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम में तीन आयामी (3 डी) का उपयोग करके आयोजित की जाती है। जबकि इन बॉटम-अप दृष्टिकोणों ने ईसीएम रीमॉडलिंग 5,6,7 के तंत्र का प्रदर्शन किया है, प्रसार8 में वृद्धि हुई है, मेसेनकाइमल संक्रमण के लिए उपकला 9,10,11,12, और ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण 7,13,14,15,16 , उनका ध्यान मुख्य रूप से एक सजातीय 3 डी मैट्रिक्स के भीतर कुछ सेल प्रकारों (जैसे, ट्यूमर कोशिकाओं या फाइब्रोब्लास्ट्स) पर एक शारीरिक ऊतक के भीतर मौजूद इंटरैक्शन की विविधता और विषमता की तुलना में रहा है। इन विट्रो सिस्टम के अलावा, पूर्व विवो ट्यूमर हिस्टोलॉजी भी इन सेल-सेल और सेल-ईसीएम इंटरैक्शन17 में कुछ अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में ईसीएम की स्थानिक रूप से विषम संरचना और वास्तुकला के संबंध में कई सेल प्रकारों का विश्लेषण करने में सक्षम होने का लाभ है, लेकिन निश्चित ऊतक के स्थिर समापन बिंदु कोशिकाओं और माइक्रोएन्वायरमेंट के बीच बातचीत की गतिशील प्रकृति पर कब्जा नहीं करते हैं। इंट्रावाइटल इमेजिंग ने देशी ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के शारीरिक संदर्भ के भीतर विविध और गतिशील इंटरैक्शन से पूछताछ करने के लिए दरवाजा खोल दिया है।

इंट्रावाइटल ट्यूमर इमेजिंग की क्षमताएं तेजी से आगे बढ़ रही हैं। खिड़कियों को प्रत्यारोपित करने के लिए इमेजिंग खिड़कियों और सर्जिकल तकनीकों के डिजाइन में सुधार ने विभिन्न प्रकार के शारीरिक स्थानों (यानी, प्राथमिक ट्यूमर, लिम्फ नोड्स, मेटास्टैटिक साइटों 18,19,20) पर दीर्घकालिक अनुदैर्ध्य ट्यूमर इमेजिंग को सक्षम किया है। इसके अलावा, ऑप्टिकल इंस्ट्रूमेंटेशन की क्षमता कई आयामों (यानी, वर्णक्रमीय, स्थानिक प्रतिदीप्ति तीव्रता, और जीवनकाल) में डेटा की कल्पना और एकत्र करने के लिए, और उच्च रिज़ॉल्यूशन और गति (वीडियो दर) पर व्यापक रूप से सुलभ हो रही है। बेहतर तकनीक एक शारीरिक वातावरण के भीतर सेल सिग्नलिंग और फेनोटाइपिक गतिशीलता में तेजी से परिवर्तन का पता लगाने का अवसर प्रदान करती है। अंत में, ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों का विस्तार और आनुवंशिक फ्लोरोसेंट निर्माणों की विस्तृत सरणी विशिष्ट सेल प्रकारों की टैगिंग के लिए ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट या सेल वंश अनुरेखण में सेल माइग्रेशन को कैप्चर करने की अनुमति देती है, जो विकास या रोग की प्रगतिके दौरान 21,22 है। CRISPR / Cas9 प्रौद्योगिकी के साथ संयोजन में इन उपकरणों का उपयोग शोधकर्ताओं को समय पर अद्वितीय पशु मॉडल उत्पन्न करने का अवसर प्रदान करता है।

हालांकि ये सभी प्रगति इंट्रावाइटल इमेजिंग को गतिशील और शारीरिक सेलुलर इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए एक तेजी से शक्तिशाली विधि बनाती हैं, फिर भी उन रणनीतियों को विकसित करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है जो इन जैविक इंटरैक्शन के लिए ऊतक स्तर पर स्थानिक, अस्थायी और संरचनात्मक संदर्भ प्रदान करती हैं। वर्तमान में, कई इंट्रावाइटल इमेजिंग अध्ययन दृश्य स्थलों की कमी के लिए क्षतिपूर्ति करते हैं जैसे कि रक्त वाहिकाएं वास्कुलचर में फ्लोरोसेंट रंजक इंजेक्ट करके या माउस मॉडल को नियोजित करके जो भौतिक विशेषताओं को चित्रित करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन को बहिर्जात रूप से व्यक्त करते हैं। इंजेक्टेबल रंजक और फ्लोरोसेंट डेक्सट्रांस जैसे सब्सट्रेट्स का उपयोग मोटे तौर पर इंट्रावाइटल संग्रह19, 23, 24 में वास्कुलचर को सफलतापूर्वक लेबल करने के लिए किया जाता है। हालांकि, यह दृष्टिकोण सीमाओं के बिना नहीं है। एक के लिए, इसके लिए अतिरिक्त माउस जोड़तोड़ की आवश्यकता होती है और इसकी उपयोगिता अल्पकालिक प्रयोगों तक सीमित है। अनुदैर्ध्य अध्ययनों के लिए, फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान समस्याग्रस्त हो सकता है क्योंकि हम फागोसाइटिक कोशिकाओं में डेक्सट्रान के संचय या समय के साथ आसपास केऊतकों में प्रसार का निरीक्षण करते हैं। माउस मॉडल में बहिर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन निगमन को फ्लोरोसेंट डेक्सट्रांस के विकल्प के रूप में प्रस्तुत किया गया है, लेकिन अपनी सीमाओं को प्रस्तुत करता है। माउस मॉडल के भीतर बहिर्जात फ्लोरोफोर की उपलब्धता और विविधता अभी भी सीमित और बनाने के लिए महंगी है। इसके अतिरिक्त, विशिष्ट मॉडलों में, जैसे कि पीडीएक्स मॉडल, आनुवंशिक जोड़तोड़ वांछनीय या संभव नहीं हैं। यह भी दिखाया गया है कि कोशिकाओं के भीतर फ्लोरोसेंट या बायोल्यूमिनेसेंट प्रोटीन की उपस्थिति को माउस के भीतर विदेशी के रूप में पहचाना जाता है, और इम्यूनोकॉम्पिटेंट माउस मॉडल के भीतर, यह मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली26,27 की प्रतिक्रिया के कारण मेटास्टेसिस की मात्रा को कम करता है। अंत में, बहिर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन या फ्लोरोसेंट रंजक स्थानिक संदर्भ के लिए उपयोग किए जाते हैं या बाद के डेटा को विभाजित करने के लिए अक्सर प्रकाश स्पेक्ट्रम की प्रमुख श्रेणियों पर कब्जा कर लेते हैं जो अन्यथा ब्याज की शारीरिक बातचीत की जांच करने के लिए उपयोग किए जा सकते हैं।

ईसीएम से आंतरिक संकेत का उपयोग या ऊतक के भीतर कोशिकाओं से अंतर्जात प्रतिदीप्ति अधिक गहराई से सेलुलर और स्थानिक विश्लेषण के लिए इंट्रावाइटल डेटा को विभाजित करने के लिए एक संभावित सार्वभौमिक लेबल-मुक्त साधन का प्रतिनिधित्व करता है। दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) का उपयोग लंबे समय से ईसीएम28 की कल्पना करने के लिए किया गया है। फाइबर संगठन 29,30,31 के लक्षण वर्णन में सहायता करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरणों के बाद के विकास के साथ, स्थानीय ईसीएम संरचना के सापेक्ष सेल व्यवहार को चिह्नित करना संभव है। इसके अलावा, अंतर्जात मेटाबोलाइट, एनएडी (पी) एच से ऑटोफ्लोरेसेंस, विवो में ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को विभाजित करने के लिए एक और लेबल-मुक्त उपकरण प्रदान करता है। एनएडी (पी) एच ट्यूमर कोशिकाओं में उज्ज्वल रूप से फ्लोरेसेस करता है और इसका उपयोग इसके आसपास के स्ट्रोमा21,32 से बढ़ते ट्यूमर घोंसले की सीमाओं को भेदभाव करने के लिए किया जा सकता है। अंत में, वास्कुलचर ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में एक महत्वपूर्ण शारीरिक संरचना है और प्रमुख सेल-प्रकार-विशिष्ट इंटरैक्शन 33,34,35 की साइट है। लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) या रक्त प्लाज्मा की उत्तेजना का उपयोग ट्यूमर वास्कुलचर की कल्पना करने के लिए किया गया है, और दो या तीन-फोटॉन उत्तेजना (2 पी; 3 पी) का उपयोग करके रक्त प्रवाह दरों का माप संभव दिखाया गया है। हालांकि, जबकि बड़ी रक्त वाहिकाओं को उनके अंतर्जात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षरों द्वारा आसानी से पहचाना जा सकता है, सूक्ष्म, चर और कम फ्लोरोसेंट छोटे रक्त वाहिकाओं की पहचान के लिए अधिक विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। ये अंतर्निहित कठिनाइयां इष्टतम छवि विभाजन में बाधा डालती हैं। सौभाग्य से, अंतर्जात प्रतिदीप्ति (यानी, लाल रक्त कोशिकाओं और रक्त प्लाज्मा) के इन स्रोतों को प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग37 द्वारा भी मापा जा सकता है, जो वास्कुलचर के अद्वितीय फोटोफिजिकल गुणों को भुनाता है और बढ़ते इंट्रावाइटल टूलबॉक्स के लिए एक उपयोगी अतिरिक्त का प्रतिनिधित्व करता है।

इस प्रोटोकॉल में, अंतर्जात प्रतिदीप्ति और एसएचजी जैसे आंतरिक संकेतों का उपयोग करके स्पष्ट रूप से चार-आयामी (4 डी) इंट्राविटल इमेजिंग के विभाजन के लिए एक वर्कफ़्लो अधिग्रहण से विश्लेषण तक वर्णित है। यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से एक स्तन इमेजिंग विंडो के माध्यम से अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए प्रासंगिक है जहां बहिर्जात प्रतिदीप्ति व्यावहारिक या संभव नहीं हो सकती है, जैसा कि पीडीएक्स मॉडल के मामले में है। हालांकि, यहां उल्लिखित विभाजन सिद्धांत मोटे तौर पर ट्यूमर जीव विज्ञान, ऊतक विकास, या यहां तक कि सामान्य ऊतक शरीर विज्ञान की जांच करने वाले इंट्रावाइटल उपयोगकर्ताओं पर लागू होते हैं। विश्लेषण दृष्टिकोण के रिपोर्ट किए गए सूट उपयोगकर्ताओं को संरेखित या यादृच्छिक कोलेजन फाइबर कॉन्फ़िगरेशन के क्षेत्रों के बीच सेलुलर व्यवहार को अलग करने की अनुमति देगा, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के विशिष्ट क्षेत्रों में रहने वाली कोशिकाओं की संख्या या व्यवहार की तुलना करेगा, और केवल लेबल-मुक्त या आंतरिक संकेत का उपयोग करके ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए वास्कुलचर को मैप करेगा। साथ में, ये विधियां अतिरिक्त बहिर्जात लेबल की आवश्यकता को कम करते हुए स्तन ग्रंथि के 4 डी इंट्रावाइटल इमेजिंग से प्राप्त जानकारी की गहराई को अधिकतम करने के लिए एक परिचालन रूपरेखा बनाती हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

वर्णित सभी प्रयोगों को विस्कॉन्सिन-मैडिसन विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी पशु प्रयोगों में कल्याण और दर्द प्रबंधन सर्वोपरि है। इस प्रकार, यह सुनिश्चित करने के लिए हर संभव प्रयास किया जाता है कि प्रक्रिया के प्रत्येक चरण में जानवर आरामदायक और अच्छी तरह से देखभाल करता है।

1. स्तन इमेजिंग विंडो की पीढ़ी (MIW)

  1. स्तन इमेजिंग विंडो का निर्माण करने के लिए, सर्जिकल ग्रेड स्टेनलेस स्टील से 14 मिमी की अंगूठी बनाएं।
  2. 5% सफाई डिटर्जेंट के एक गर्म समाधान का उपयोग करके मशीनी विंडो फ्रेम को साफ करें, चल रहे विआयनीकृत पानी (डीआई) के तहत 10 मिनट के लिए कुल्ला करें, 10 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में भिगोएं, और फिर हीट लैंप के नीचे सूख जाएं। सूखे MIW फ्रेम को आटोक्लेव करें और इसे बाद में उपयोग के लिए स्टोर करें।
  3. MIW कवर ग्लास को निम्नानुसार तैयार करें: 10 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में # 1.5 12 मिमी गोल कवर ग्लास को भिगोएं, गर्मी लैंप के नीचे सूखा, और फिर साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला का उपयोग करके धातु एमआईडब्ल्यू फ्रेम के लिए सुरक्षित करें। रात भर चिपकने वाला इलाज.
  4. एक एसीटोन भिगोए हुए स्वाब का उपयोग करके अतिरिक्त चिपकने वाले के इकट्ठे हुए एमआईडब्ल्यू को साफ करें, और इसे 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में डुबोकर शुद्ध करें। साफ की गई खिड़की को सूखने दें। एमआईडब्ल्यू को पहले से तैयार करें और सर्जिकल आरोपण से पहले इसे बाँझ पेट्री डिश में स्टोर करें।

2. MIW के सर्जिकल आरोपण

  1. आटोक्लेव सर्जिकल उपकरण और खिड़की के आरोपण के लिए सर्जरी शुरू करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ सतहों को साफ करें।
  2. एक बाँझ क्षेत्र के साथ कवर एक वार्मिंग कंबल का उपयोग करके एक साफ टेबलटॉप पर सर्जरी करें। वार्मिंग कंबल को इस तरह से सेट करें कि बाँझ क्षेत्र के शीर्ष पर मापा गया तापमान 40 डिग्री सेल्सियस है।
  3. ऊतक सुखाने को रोकने में मदद करने के लिए सहायक ठंडी रोशनी का उपयोग करें। सर्जिकल प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए आवर्धक चश्मे का उपयोग करें। पीपीई पहनें जिसमें एक बाँझ, एकल-उपयोग प्रयोगशाला कोट, सर्जिकल आस्तीन, दस्ताने, आंखों की सुरक्षा और चेहरे का मुखौटा शामिल है जैसा कि सर्जिकल सर्वोत्तम प्रथाओं द्वारा अनुशंसित है।
  4. 2.0% की आइसोफ्लुरेन सेटिंग और 2.0 एल / मिनट की ऑक्सीजन प्रवाह दर के साथ एक संज्ञाहरण vaporizer मशीन का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटिकाइज़ करें। चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा एनाल्जेसिक (10 मिलीग्राम / किग्रा मेलोक्सिकैम) का प्रशासन करें।
    नोट: पहले 24 घंटे के भीतर अतिरिक्त खुराक प्रदान करें, अधिमानतः सर्जरी के बाद पहले 2 दिनों के लिए हर 8-12 घंटे।
  5. एक बार anesthetized (पैर की अंगुली चुटकी के लिए कोई प्रतिक्रिया से पुष्टि), आंखों के सूखने को रोकने के लिए एक मॉइस्चराइजिंग आंख जेल लागू करें। सर्जरी साइट (4वें वंक्षण स्तन ग्रंथि) पर फर को हटाने के लिए एक डिपिलेटरी क्रीम का उपयोग करें, जिसके बाद बाँझ पानी से लथपथ धुंध के साथ कुल्ला किया जाता है।
  6. 3 वैकल्पिक betadine और इथेनॉल स्क्रब के साथ त्वचा की सतह को सैनिटाइज करके सर्जरी के लिए depilated सर्जिकल साइट तैयार करें।
  7. सर्जरी शुरू करने के लिए, संदंश का उपयोग करके त्वचा को धीरे से 4 वें स्तन ग्रंथि संख्या 4 पर उठाएं। एक बार जब त्वचा को शरीर की दीवार से दूर खींच लिया जाता है, तो सर्जिकल माइक्रो-कैंची के साथ संदंश की नोक पर त्वचीय परत के ~ 1 मिमी अनुभाग को हटा दें। यदि रक्तस्राव होता है, तो बाँझ धुंध के साथ कोमल दबाव लागू करें जब तक कि रक्तस्राव बंद न हो जाए।
    नोट: सामान्य तौर पर, बड़े ट्यूमर में छोटे ट्यूमर या सामान्य ऊतकों की तुलना में खून बहने की अधिक क्षमता होती है।
  8. अंतर्निहित ग्रंथि को काटने से बचने के लिए सर्जिकल उद्घाटन पर संदंश के कोमल आंदोलनों के साथ त्वचीय परत से स्तन ग्रंथि को अलग करें।
  9. एक 10 मिमी चीरा बनाएँ और परिधि पर त्वचीय परत से स्तन ग्रंथि को छोड़ दें ताकि स्तन ग्रंथि को भेदने के बिना टांके लगाए जा सकें। उजागर ग्रंथि / ट्यूमर को कवर करने और सूखने से रोकने के लिए पीबीएस जोड़ें।
  10. 5-0 रेशम चोटी टांका का उपयोग कर उद्घाटन की परिधि के साथ एक पर्स स्ट्रिंग टांका बनाएँ. MIW का एक किनारा सम्मिलित करें ताकि त्वचीय परत MIW के प्राप्त नॉच में संलग्न हो।
  11. धीरे से MIW के विपरीत पक्ष में उपकला खिंचाव और धातु MIW जगह में धक्का इस तरह है कि त्वचीय परत पूरी तरह से पूरे MIW परिधि के चारों ओर प्राप्त पायदान संलग्न है. पर्स स्ट्रिंग को पायदान में त्वचीय परत को आकर्षित करने के लिए तंग करें और एमआईडब्ल्यू को पूरी तरह से सुरक्षित करने के लिए इसे बांधें।
  12. MIW पर त्वचीय परत के लिए एक सामयिक एंटीबायोटिक जोड़ें, और लगातार माउस की निगरानी जब तक यह स्टर्नल recumbency बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त कर लिया है. एमआईडब्ल्यू-प्रत्यारोपित माउस को पिंजरे में रखे गए इग्लू के साथ नरम बिस्तर पर अलग से घर दें, और माउस को इमेजिंग से पहले 48 घंटे के लिए ठीक होने की अनुमति दें।

3. पोजिशनिंग और इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप मंच पर माउस को बनाए रखने

  1. माइक्रोस्कोप चरण पर हीटिंग कक्ष सेट करें। 30 डिग्री सेल्सियस या किसी अन्य समान प्रणाली के लिए सेट एक मजबूर हवा प्रणाली का उपयोग करें। जेड फोकस में बहाव से बचने के लिए एक उद्देश्य हीटर का उपयोग करें। इमेजिंग से पहले सिस्टम को कम से कम 1 घंटे के लिए संतुलन में आने की अनुमति दें।
    नोट: Anesthetized चूहों को ठीक से अपने शरीर के तापमान को बनाए रखने में असमर्थ हैं, और इसलिए, यह किसी भी समय चूक अधिग्रहण के लिए एक गर्म वातावरण के लिए आवश्यक है। उद्देश्य हीटर थर्मल विस्तार के प्रभावों का मुकाबला करने में मदद करता है, एक ऐसी घटना जो उद्देश्य लेंस के रूप में जेड फोकस में बहाव का कारण बनती है और ऊतक को चित्रित किया जा रहा है थर्मल संतुलन में आते हैं।
  2. एक बार माइक्रोस्कोप पर हीटिंग चैंबर 30 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर हो जाने के बाद, प्राप्तकर्ता माउस को 2% आइसोफ्लुरेन की संज्ञाहरण मशीन सेटिंग्स और 2 एल / मिनट की ऑक्सीजन प्रवाह दर के साथ एनेस्थेटिकाइज़ करें।
  3. माउस sedated है के बाद (पैर की अंगुली चुटकी के लिए कोई प्रतिक्रिया द्वारा पुष्टि की), एक कपास applicator और ग्लास क्लीनर के साथ MIW ग्लास के बाहर साफ, सूखने को रोकने के लिए आंख मरहम जोड़ें, और यदि आवश्यक हो तो एक पूंछ नस कैथेटर डालें।
  4. उचित जलयोजन बनाए रखने के लिए, पूंछ शिरा कैथेटर के माध्यम से 0.5 मिलीलीटर पीबीएस उप-त्वचीय या 100 μL का प्रारंभिक इंजेक्शन दें। इमेजिंग सत्र की अवधि के लिए हर 2 घंटे को दोहराएं।
  5. एक बार माउस को ठीक से तैयार करने के बाद, इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें। समय-अंतराल माप के दौरान वाष्पीकरण को कम करने के लिए, विसर्जन मीडिया के लिए पानी के बजाय पानी-आधारित जेल का उपयोग करें। यह मंच पर माउस रखने से पहले किया जाना चाहिए। कृपया ऑप्टिकल घटकों के विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  6. माइक्रोस्कोप चरण पर माउस रखें, आइसोफ्लुरेन नली को फिट करें और छवियों को स्थिर करने के लिए चरण डालने में 14 मिमी प्राप्त छेद में एमआईडब्ल्यू के कॉलर को दबाएं। माइक्रोस्कोप ओकुलर का उपयोग करके इमेजिंग क्षेत्र को ध्यान में लाएं और रक्त प्रवाह के साथ वास्कुलचर का निरीक्षण करने के लिए ब्राइटफील्ड रोशनी का उपयोग करें।
  7. दृश्य के क्षेत्र की स्थिरता की जाँच करें. यदि साँस लेने की गति कलाकृतियां मौजूद हैं, तो एक छोटे से फोम ब्लॉक और चिपकने वाले टेप के एक सिंक्चर जैसे टुकड़े के साथ ग्रंथि के पीछे कोमल संपीड़न लागू करें। संपीड़न लागू होने के बाद, सत्यापित करें कि दृश्य के पूरे क्षेत्र में रक्त प्रवाह बनाए रखा गया है।
  8. समय-समय पर इमेजिंग सत्र के दौरान 0.25% वेतन वृद्धि में आइसोफ्लुरेन के स्तर को समायोजित करें ताकि मैन्युअल रूप से पशु श्वसन की गिनती करके बेहोश करने की क्रिया का उचित स्तर बनाए रखा जा सके।
  9. पशु दीर्घायु और ऑप्टिकल इमेजिंग में सुधार करने के लिए प्रति मिनट (आरपीएम) 36-40 श्वसन की दर बनाए रखें। कम श्वसन दर के परिणामस्वरूप माउस प्रयोग से बच नहीं सकता है, जबकि 60 आरपीएम से अधिक श्वसन दर के परिणामस्वरूप खराब बेहोश करने की क्रिया हो सकती है, जो छवि डेटा में श्वास और गति कलाकृतियों को बढ़ा सकती है।

4. गतिशील सेल व्यवहार के 4 डी, तीव्रता-आधारित, लेबल-मुक्त इंट्राविटल इमेजिंग के लिए सेट अप करें

  1. एक बार माउस को बेहोश कर दिया जाता है और सुरक्षित रूप से उल्टे माइक्रोस्कोप चरण पर तैनात किया जाता है, तो ब्याज के क्षेत्रों का पता लगाना शुरू करें।
  2. MIW पर निर्देशित प्रकाश स्रोत का उपयोग करते हुए, जांच के लिए संभावित क्षेत्रों की पहचान करने के लिए माइक्रोस्कोप के ओकुलर का उपयोग करें। जोड़ें और इन पदों पर लौटने के लिए सॉफ़्टवेयर में x, y पदों को सहेजें।
    नोट: ट्यूमर का ठीक विवरण इस प्रकार की रोशनी के साथ आसानी से दिखाई नहीं देगा। लक्ष्य केवल आगे की जांच के लिए क्षेत्रों की पहचान करना है। ध्यान वास्कुलचर और रक्त प्रवाह को देखने पर है।
  3. सॉफ़्टवेयर में कई पदों को सहेजे जाने के बाद, 890 एनएम उत्तेजना और FAD/ SHG फ़िल्टर क्यूब का उपयोग करके दृश्य के चुने हुए फ़ील्ड का पूर्वावलोकन करें। कम शक्ति और उच्च पीएमटी सेटिंग के साथ 4 μs के अधिकतम निवास समय का उपयोग करें। लक्ष्य अत्यधिक लेजर प्रकाश के लिए ऊतक overexposing बिना देखने के क्षेत्रों का पूर्वावलोकन करने के लिए है।
  4. एक बार जब उपयुक्त शक्ति स्तर सेट हो जाते हैं, तो जेड-स्टैक सेट करें। MIW की कांच की सतह के नीचे 20-50 μm पर प्रचुर मात्रा में कोलेजन फाइबर (SHG) की उपस्थिति का निरीक्षण करें। कोलेजन ट्यूमर में गहरे माइक्रोस्कोप वर्गों के रूप में कम प्रचलित हो जाएगा (चित्रा 1 बी)। एसएचजी में voids ट्यूमर द्रव्यमान के स्थान को प्रकट करते हैं।
  5. एकान्त कोशिकाओं की परत के नीचे शीर्ष जेड-स्लाइस सेट करें जहां पहले कोलेजन फाइबर ~ 50-100 μm पर दिखाई देते हैं। ~ 250 μm पर नीचे z-स्लाइस सेट करें, जहां फाइबर फीका हो जाता है और खराब सिग्नल हावी होता है। सहेजे गए सभी x-y पदों के लिए इसे दोहराएं।
  6. एक बार जब जेड-स्टैक रेंज सेट हो जाती है, तो रहने का समय (8 μs तक) बढ़ाएं और पावर और डिटेक्टर सेटिंग्स को अनुकूलित करें। प्रत्येक प्रयोग के लिए ऊतक को उत्तेजित करने के लिए आवश्यक के रूप में शक्ति के स्तर को अनुकूलित करें। उद्देश्य के पीछे एपर्चर पर 750 एनएम पर 90 mW या 890 nm पर 70 mW तक की शक्तियों का उपयोग करना एक स्वीकार्य सीमा के भीतर है।
    नोट: इमेजिंग गहराई, ऊतक के भीतर बिखरने की मात्रा, उद्देश्य विशेषताओं, और डिटेक्टर संवेदनशीलता सभी एक छवि प्राप्त करने के लिए आवश्यक शक्ति की मात्रा को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करेगी।
  7. प्रयोगात्मक लक्ष्यों के अनुसार समय अंतराल को समायोजित करें। अधिकांश इंट्रावाइटल माइग्रेशन फिल्मों के लिए संग्रह बिंदुओं के बीच 10 मिनट के अंतराल के साथ शुरू करें।
  8. भले ही 2 पी उत्तेजना कोशिकाओं और ऊतकों पर कोमल है, फोटोटॉक्सिसिटी के संकेतों के बारे में जागरूक रहें, जैसे कि सेल ब्लेबिंग या तेजी से बढ़ते ऑटोफ्लोरेसेंस, और अत्यधिक फोटोब्लीचिंग। लेजर शक्ति को कम करें या समयबद्ध अंतराल को बढ़ाएं जैसा कि स्थितियां इंगित करती हैं।

5. प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग (FLIM) एनएडी (पी) एच के

  1. टाइमलैप्स अधिग्रहण से एक्स-वाई पदों को संरक्षित करते समय, एक एफएलआईएम स्टैक एकत्र करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें। GAAsP डिटेक्टर के सामने एक फ़िल्टर धारक में एक 440/80 फ़िल्टर डालें, और सॉफ्टवेयर में 800 करने के लिए GAAsP डिटेक्टर वोल्टेज सेट करें। डिटेक्टरों के चालू होने पर कमरे की रोशनी बंद कर दें।
  2. सॉफ़्टवेयर में, गैल्वेनोमीटर-आधारित तीव्रता इमेजिंग से एक FLIM इमेजिंग मोड पर स्विच करें।
  3. वास्कुलचर की पहचान करने और मास्किंग के उद्देश्य से, रिज़ॉल्यूशन को 512 x 512 पिक्सेल पर सेट करें। पूरक चयापचय जानकारी एकत्र करने के लिए, जीवनकाल हस्ताक्षर के अस्थायी रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाने के लिए रिज़ॉल्यूशन को 256 x 256 पिक्सेल पर सेट करें। रहने का समय 4 μs पर सेट करें और लेजर को 750 एनएम पर ट्यून करें।
  4. पूर्वावलोकन स्कैनिंग प्रारंभ करें और लेजर शक्ति को समायोजित करने के लिए शुरू करें। लेजर पावर को तब तक समायोजित करें जब तक कि स्थिर अंश विभेदक (CFD) के लिए रीडआउट 1 x 105 और 1 x 106 के बीच न हो। 1 x 106 से अधिक न करें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप फोटॉन पाइलअप और खराब समग्र परिणाम होंगे।
  5. एक बार पावर स्तर सेट होने के बाद, एकीकरण समय को 90 s और 120 s के बीच सेट करें और FLIM संग्रह प्रारंभ करें। यह आवंटित समय के लिए दृश्य के क्षेत्र से फोटॉन प्राप्त करेगा।
  6. वैकल्पिक: सभी आवश्यक संग्रह किए जाने के बाद और माउस को मंच से हटा दिया गया है, एक उपकरण प्रतिक्रिया फ़ंक्शन (आईआरएफ) एकत्र करें। एक ही पैरामीटर के साथ एक ग्लास-बॉटम डिश में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध यूरिया क्रिस्टल की सतह को इमेजिंग करके आईआरएफ को मापें और ऊतक को इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले सेट अप करें।
    नोट:: IRF इलेक्ट्रॉनिक या ऑप्टिकल सेटअप के कारण किसी भी देरी या प्रतिबिंब के लिए खाता है। आईआरएफ सभी एफएलआईएम अधिग्रहणों में शामिल है, और इसे डेटा से अलग करने से गणना की गई प्रतिदीप्ति क्षय घटता की सटीकता में सुधार हो सकता है। उस के साथ कहा, परिकलित IRFs अक्सर यथोचित रूप से मापा IRF से प्रतिदीप्ति क्षय घटता की गुणवत्ता को दोहरा सकते हैं. आईआरएफ को मापने के लिए यह अच्छा अभ्यास है जब तक कि यह निर्धारित नहीं किया गया है कि गणना की गई आईआरएफ क्षय वक्रों के बराबर फिट बैठती है और मापा आईआरएफ से परिणामों को पर्याप्त रूप से अनुमानित करती है।

6. NADH लाइफटाइम छवियों का विश्लेषण

  1. FLIM सॉफ़्टवेयर खोलें और डेटासेट से NAD(P)H जीवनकाल छवि आयात करें। सॉफ़्टवेयर का ठीक से उपयोग करने के तरीके के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया फ्लोरोसेंट लाइफटाइम हैंडबुक से परामर्श करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. प्रारंभ करने के लिए, सॉफ़्टवेयर में मॉडल पैरामीटर को परिभाषित करें. मेनू पट्टी में, मॉडल > विकल्प क्लिक करें. निम्न बक्सों का चयन करें: बहु-घातीय क्षय > सेटिंग्स, MLE > विधि फ़िट करें, स्थानिक बिनिंग > स्क्वायर, थ्रेशोल्ड > पीक, और छवि की गणना करने से पहले Shift ठीक करें चेक करें.
  3. मेनू पट्टी में, ड्रॉप-डाउन मेनू से रंग > 1% क्लिक करें. खिड़की के दाईं ओर, इसे तीन-घटक फिट के रूप में परिभाषित करें। बिन आकार > 3 सेट करें।
  4. थ्रेशोल्ड > ~ 10 समायोजित करें। पहली बार के लिए क्षय मैट्रिक्स की गणना की गई है के बाद दहलीज सटीकता का पुन: मूल्यांकन करें।
  5. π1 से 200 ps तक ठीक करें. यह लाल रक्त कोशिकाओं के छोटे जीवनकाल का प्रतिनिधित्व करता है। उस मूल्य को खोजने का प्रयास करें जो बड़ी रक्त वाहिका में कई धब्बों से सबसे अच्छा मेल खाता है, जिसे तीव्रता छवि में देखा जा सकता है। 1200 ps के लिए π2 ठीक करें। यह लाल रक्त कोशिकाओं के लंबे जीवनकाल का प्रतिनिधित्व करता है।
    नोट:: सेट मान केवल प्रारंभिक बिंदु हैं। मूल्यों को वास्कुलचर को और अधिक बाहर लाने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। ज्यादातर मामलों में, लेकिन हमेशा नहीं, ये मान कम हो जाएंगे।
  6. मेनू पट्टी में परिकलित करें के अंतर्गत, क्षय मैट्रिक्स का चयन करें. यह उच्च मूल्यों वाले वास्कुलचर के साथ एक प्रारंभिक ए1% आजीवन छवियां उत्पन्न करेगा। वास्कुलचर पर होवर करने के लिए कर्सर (क्रॉसहेयर) का उपयोग करें। व्यवस्थित रूप से और एक समय में एक, फ्लोट (फिक्स बॉक्स को अनचेक करें ) π1 और π2। इन मानों को रिकॉर्ड करें क्योंकि वे निश्चित पैरामीटर को अनुकूलित करने में मदद करेंगे।
    नोट: लक्ष्य आवश्यक रूप से छवि में सबसे सटीक मूल्यों को प्राप्त करने के लिए नहीं है, बल्कि वास्कुलचर के रूप में पहचाने गए क्षेत्र को नाटकीय रूप से कम किए बिना वास्कुलचर और ऊतक के बीच असमानता को अधिकतम करने के लिए है।
  7. एक बार जब π1 और π2 के लिए उपयुक्त पैरामीटर की पहचान की गई है, तो मेनू बार में बैच प्रोसेसिंग > गणना करें का चयन करें। सुनिश्चित करें कि अधिकांश सेटिंग्स z-स्लाइस के बीच समान हैं।
  8. सत्यापित करना सुनिश्चित करें कि कोई भी दूसरों की तुलना में पूरी तरह से अलग सेटिंग नहीं कर रहा है। यदि हां, तो पहले शिफ्ट को समायोजित करें और पुन: प्रयास करें. यदि समस्या बनी रहती है, तो नए पैरामीटर का उपयोग करके रीफ़िट करें। एक गलत बदलाव फिट बैठता है में शोर का एक बड़ा कारण हो सकता है और आसन्न ट्यूमर क्षेत्रों में ए1% मूल्यों में वृद्धि कर सकते हैं।
  9. मेनू टैब में, फ़ाइलों को सहेजें और फिरएक 1% फ़ाइलें निर्यात करें। मास्किंग और विभाजन के लिए ImageJ में इन फ़ाइलों को अपलोड करें।

7. वास्कुलचर की छवि विभाजन

  1. ImageJ खोलें और एक पाठ छवि के रूप में एक1% छवि आयात करें। स्टैक के भीतर सभी छवियों के लिए इसे दोहराएं।
  2. सभी ए1% छवियों को खोलने के साथ, Z-Project > स्टैक > छवि का चयन करें। अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का उपयोग करें और छवियों को सहेजें। प्रतिनिधि छवि के लिए पूरक डेटा 1 देखें.
  3. Plugins > Segmentation पर जाएं। ट्रेन करने योग्य WEKA विभाजन प्लगइन38 का चयन करें.
  4. एक बार WEKA विंडो खुलने के बाद, डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करें और वास्कुलचर (उच्च ए 1% क्षेत्रों) और गैर-वास्कुलचर (कम ए 1% क्षेत्रों) पर दो कक्षाएं और ट्रेसिंग लाइनों को बनाकर सॉफ़्टवेयर को प्रशिक्षित करना शुरू करें।
  5. दो वर्गों में नए निशान जोड़ना जारी रखें जब तक कि सॉफ़्टवेयर लगातार पृष्ठभूमि शोर के किसी भी उच्च क्षेत्रों को समाप्त करते हुए वास्कुलचर के उच्च ए1% क्षेत्रों की पहचान नहीं करता है। प्रतिनिधि क्लासिफायर मॉडल के लिए पूरक मॉडल देखें।
  6. एक बार वर्गीकृत छवि का उत्पादन होने के बाद, छवि > प्रकार > 8 बिट पर क्लिक करें। छवि थ्रेशोल्ड और एक मुखौटा बनाएँ। यदि थ्रेशोल्ड की गई छवि को अभी भी आगे साफ करने की आवश्यकता है, तो कणों का विश्लेषण करें फ़ंक्शन का उपयोग करें ।
  7. आकार और परिपत्रता को समायोजित करें जब तक कि थ्रेशोल्ड छवि के किसी भी छोटे और परिपत्र क्षेत्रों को बाहर नहीं रखा जाता है। केवल वास्कुलचर और बहुत कम पृष्ठभूमि के साथ एक साफ मुखौटा प्राप्त किया जाता है।
  8. Edit > Selection > Create Selection पर क्लिक करें। ROI प्रबंधक के > > उपकरण का विश्लेषण करें पर क्लिक करके ROI प्रबंधक के लिए चयन स्थानांतरित करें।
  9. वर्गीकृत छवि डुप्लिकेट करें. बाइनरी प्रक्रिया > लिए आगे बढ़ें। मुखौटा का विस्तार करने और वास्कुलचर से दूरी को परिभाषित करने के लिए जो छवि विभाजन में शामिल किया जाएगा, फैलाएं का चयन करें। तब तक दोहराएं जब तक कि मुखौटा वांछित सीमा तक विस्तारित न हो जाए। ROI प्रबंधक में ब्याज के इस क्षेत्र (ROI) को रिकॉर्ड करें।
    नोट: इस चरण का लक्ष्य रक्त वाहिका की एक निश्चित निकटता के भीतर मात्रा या व्यवहार को निर्धारित करना है (उदाहरण के लिए, रक्त वाहिकाओं के एक्स μm के भीतर मौजूद कोशिकाओं की संख्या)। आवश्यक फैलाव की मात्रा पूरी तरह से वैज्ञानिक प्रश्न द्वारा निर्धारित की जाती है।
  10. प्रतिबंधात्मक क्षेत्रों के भीतर कक्षों की संख्या निर्धारित करने के लिए, ब्याज की विंडो (छवि / चैनल) का चयन करें। यह कोई भी विंडो हो सकती है जो संवहनी मुखौटा के रूप में दृश्य के समान क्षेत्र को साझा करती है। ड्रॉप-डाउन मेनू से XOR फ़ंक्शन का उपयोग करके ROI दोनों को लागू करें।
    नोट: यह कार्रवाई वास्कुलचर से वांछित दूरी के भीतर आइटम को मापेगी, जिसमें वास्कुलचर को ही छोड़ दिया जाएगा। इस संयुक्त ROI दृष्टिकोण का उपयोग तब पैरामीटर की एक भीड़ को मापने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि तीव्रता, सेल नंबर, या माइग्रेशन।

8. ट्यूमर घोंसले की छवि विभाजन

  1. या तो एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन तीव्रता स्कैन या ImageJ में FLIM संग्रह से NADH छवि खोलें।
    नोट: यह अलग-अलग z-स्लाइस, पूर्ण स्टैक पर किया जा सकता है, या कुछ स्लाइस के z-अनुमानों पर लागू किया जा सकता है।
  2. Plugins > Segmentation पर जाएं। Trainable WEKA विभाजन प्लगइन का चयन करें.
  3. एक बार WEKA विंडो खुलने के बाद, डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करें और NADH उच्च क्षेत्रों और NADH कम क्षेत्रों के दो वर्गों में सॉफ़्टवेयर को प्रशिक्षित करना शुरू करें। एनएडीएच-उच्च क्षेत्रों में नाभिक के साथ कोशिकाओं का एक बहुत ही समझदार पैटर्न होगा और सॉफ्टवेयर आसानी से इसकी पहचान करेगा।
  4. अतिरिक्त प्रशिक्षण के साथ एल्गोरिथ्म को परिष्कृत करने के लिए ओवरले के साथ आगे और पीछे टॉगल करना जारी रखें जब तक कि यह ट्यूमर के सभी क्षेत्रों को आंख और ट्यूमर आकृति विज्ञान के पूर्व ज्ञान द्वारा निर्धारित नहीं करता है। यह एक पुनरावर्ती प्रक्रिया है।
  5. एक बार जब एल्गोरिथ्म ट्यूमर के सभी क्षेत्रों को पहचान लेता है, तो परिणाम बनाएँ बटन का चयन करें। इससे एक नई छवि बनेगी। इस छवि को डुप्लिकेट करें.
  6. पहले डुप्लिकेट की गई छवि का चयन करें और छवि > प्रकार > 8 बिट का चयन करके इसे 8 बिट छवि में कनवर्ट करें। बाइनरी मास्क बनाने के लिए इस छवि को थ्रेशोल्ड करें. फिर एक चयन बनाएँ और इसे ROI प्रबंधक को स्थानांतरित करें। ये आरओआई स्ट्रोमा को परिभाषित करेंगे।
  7. डुप्लिकेट छवि के दूसरे का चयन करें और इसे 8 बिट छवि में कनवर्ट करें। छवि > संपादित करें > उलटें का चयन करके इस छवि को उलटें, और तब बाइनरी मास्क बनाने के लिए इस छवि को थ्रेशोल्ड करें। एक बार फिर एक चयन बनाएँ और इसे ROI प्रबंधक को स्थानांतरित करें। यह ROI ट्यूमर घोंसले को परिभाषित करेगा।

9. फाइबर संगठन या संरेखण द्वारा छवि विभाजन

  1. शुरू करने के लिए, एसएचजी छवियों को खोलें, किसी भी जेड-प्रोजेक्शन को तैयार करें, और किसी भी पूर्व-प्रसंस्करण की आवश्यकता का आकलन करें। अच्छे परिणामों के लिए, समझदार फाइबर और कम शोर के साथ उच्च गुणवत्ता वाली छवियों की आवश्यकता होती है।
  2. वैकल्पिक: छविजे में प्रीप्रोसेसिंग के लिए एसएचजी चैनल के सिग्नल-टू-शोर (एसएनआर) को बढ़ाने के लिए, रोलिंग बॉल घटाव का उपयोग करके पृष्ठभूमि को घटाएं। अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए, 20 पिक्सेल और 50 पिक्सेल के बीच एक रोलिंग बॉल घटाव का उपयोग करें। फिर छवि को चिकना करें और इसे सहेजें।
  3. ओरिएंटेशनजे प्लगइन खोलें और प्रसंस्करण पैरामीटर सेट करें। ओरिएंटेशनजे विंडो में, स्थानीय टेंसर विंडो का आकार निर्धारित करें। इस फाइबर घनत्व की 20x छवि के लिए, एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में 10 पिक्सेल को 15 पिक्सेल पर सेट करें।
  4. ग्रेडिएंट मॉडल के रूप में क्यूबिक स्प्लाइन का चयन करें और रंग सर्वेक्षण बॉक्स की जाँच करें। रंग सर्वेक्षण को परिभाषित करें। ह्यू और संतृप्ति दोनों को Coherency के रूप में सेट करें, और उसके बाद मूल छवि के रूप में चमक को परिभाषित करें, चलाएँ हिट करें।
  5. प्लगइन की आउटपुट फ़ाइल RGB colormap है. स्थानीय टेंसर विंडो के मूल्य को समायोजित करें जब तक कि संरेखित क्षेत्र, जैसा कि आंख द्वारा निर्धारित किया जाता है, नीले और मैजेंटा रंगों के साथ ठीक से हाइलाइट नहीं किया जाता है।
  6. एक बार जब आउटपुट छवि संतोषजनक हो जाती है, तो इस आरजीबी छवि को 3 चैनलों में अलग करें। छवि > रंग > स्प्लिट चैनल का चयन करें.
  7. मास्किंग के उद्देश्य से संरेखित क्षेत्रों की उपस्थिति को बढ़ाने के लिए, प्रक्रिया > छवि कैलकुलेटर का चयन करके छवि कैलकुलेटर का उपयोग करें। इस ऑपरेटर का उपयोग करके, नीली छवि से हरे रंग की छवि को घटाएं। एक अधिक प्रतिबंधात्मक मुखौटा के लिए, लाल छवि से हरी छवि घटाएं। यादृच्छिक क्षेत्रों के लिए, हरे रंग के चैनल से नीले चैनल को घटाएं।
  8. Moments एल्गोरिथ्म का उपयोग करके परिणामी छवि थ्रेशोल्ड करें। ज्यादातर मामलों में, इसे आगे समायोजन की आवश्यकता नहीं होनी चाहिए। हालांकि, यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें। यह एक बाइनरी छवि का उत्पादन करेगा।
  9. एक बार बाइनरी छवि बन जाने के बाद, बाइनरी > फाइबर के बीच छेद भरने और एक माध्यिका फिल्टर का उपयोग करके मुखौटा की सीमाओं को गोल करने के लिए प्रक्रिया > बाइनरी का चयन करके छेद भरें। 10 का एक औसत फ़िल्टर एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है, डेटा के लिए एक अच्छा फिट बनाने के लिए इसे समायोजित करें। मैन्युअल रूप से समझौते के लिए मुखौटा का निरीक्षण करें और किसी भी ROIs है कि गलत हैं निकालें।
  10. एक बार मास्क संतोषजनक होने के बाद, चयन > संपादन > चयन बनाएँ का चयन करके एक चयन बनाएँ. इस चयन को ROI प्रबंधक को स्थानांतरित करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MIW की स्थापना और बुनियादी प्रयोगात्मक योजना इस प्रक्रिया में पहला कदम हैं। यह विशेष MIW डिजाइन और प्रोटोकॉल अनुदैर्ध्य अध्ययन19 के लिए अधिक अनुकूल हैं और इसे सीधे और उल्टे माइक्रोस्कोप दोनों के साथ सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। इस मामले में, एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था क्योंकि इसके परिणामस्वरूप कम साँस लेने वाली कलाकृतियों के साथ स्तन ग्रंथि की अधिक छवि स्थिरता हुई है। चित्रा 1A में, हम कठोर MIW के आयाम और आरोपण प्रक्रिया का एक ग्राफिकल अवलोकन प्रदान करते हैं।

एक लेबल-मुक्त MMTV-PyMT39 स्तन ट्यूमर (चित्रा 1B-E, चित्रा 3A) के भीतर देखने का एक विशिष्ट क्षेत्र बहुत विषम है, जिसमें कोलेजन फाइबर, कई स्ट्रोमल कोशिकाएं, ट्यूमर कोशिकाओं के द्रव्यमान और वास्कुलचर (चित्रा 3 ए) शामिल हैं। सामान्य तौर पर, कोलेजन फाइबर खिड़की के पास अधिक प्रचुर मात्रा में होते हैं और ट्यूमर में गहराई से बहुतायत में कमी होती है (चित्रा 1 बी-ई) ट्यूमर द्रव्यमान के आसपास के तंतुओं का संगठन भी काफी विविध हो सकता है, अक्सर उच्च संरेखण के क्षेत्रों के रूप में एक ही क्षेत्र में अधिक यादृच्छिक संगठन के क्षेत्रों के साथ (चित्रा 2 डी, एच और चित्रा 3 आई)।

एक विश्लेषण पाइपलाइन विकसित करने के लिए जो इंट्रावाइटल डेटा को पेरिवैस्कुलर क्षेत्रों, ट्यूमर और स्ट्रोमा में विभाजित कर सकती है, इस प्रोटोकॉल ने अंतर्जात एनएडी (पी) एच और एसएचजी से सिग्नल का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित किया। जबकि ट्यूमर और स्ट्रोमा की पहचान सीधी हो सकती है, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर पेरिवैस्कुलर क्षेत्रों की पहचान चुनौतीपूर्ण हो सकती है। वास्कुलचर अक्सर उज्ज्वल एनएडी (पी) एच + कैंसर सेल द्रव्यमान के बीच कम एनएडी (पी) एच सिग्नल के संकीर्ण रिबन के भीतर रहता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सभी अंधेरे सीमाएं वास्कुलचर को नहीं रखती हैं; बल्कि, कुछ अंधेरे क्षेत्रों बस ट्यूमर सिलवटों या आसन्न ट्यूमर लोब (पीला तीर, चित्रा 2 जी) के butting कर रहे हैं. इसके अलावा, जबकि एक अनुभवी आंख ट्यूमर से बड़े व्यास की रक्त वाहिकाओं को निकाल सकती है क्योंकि उनके पास एक विशिष्ट उपस्थिति होती है, यह अंतर हमेशा तुच्छ नहीं होता है। यह छोटे व्यास के जहाजों के लिए विशेष रूप से सच है जहां उनकी उपस्थिति अधिक सूक्ष्म और परिवर्तनशील हो सकती है। इस मामले में, एनएडी (पी) एच के प्रतिदीप्ति जीवनकाल का उपयोग वास्कुलचर (चित्रा 2 बी, एफ) की सकारात्मक पहचान में सहायता कर सकता है। प्रतिदीप्ति जीवनकाल (एफएलआईएम) एक स्थान पर फोटॉनों की बहुतायत या तीव्रता को मापता नहीं है, लेकिन उन उत्साहित अणुओं को फोटॉन का उत्सर्जन करने और उनकी जमीनी स्थिति में क्षय करने में लगने वाला समय। लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) और रक्त प्लाज्मा को एक विशिष्ट रूप से छोटे और विशिष्ट प्रतिदीप्ति जीवनकाल32,37 दिखाया गया है जिसे ऊतकों में वाहिकाओं की पहचान और विभाजन के लिए लाभ उठाया जा सकता है।

यह निर्धारित करने के लिए कि एनएडी (पी) एच का प्रतिदीप्ति जीवनकाल कितनी अच्छी तरह वास्कुलचर को इंट्राविटली पहचानता है, एफएलआईएम छवि एकत्र करने के बाद एक रोडामाइन-लेबल वाले डेक्सट्रान के 100 μL बोलस को पूंछ की नस में इंजेक्ट किया गया था। एनएडी (पी) एच एफएलआईएम के अधिकतम तीव्रता अनुमानों की तुलना उन जहाजों को बारीकी से दर्पण करती है जो एक फ्लोरोसेंटली लेबल वाले डेक्सट्रान (चित्रा 2 आई-जे) के साथ लेबल किए गए हैं। कई चूहों में इस दृष्टिकोण को दोहराने से पता चला कि डेक्सट्रान मास्क के क्षेत्र पर एफएलआईएम छवि से औसत मुखौटा क्षेत्र 78.6% ± 12.3% (चित्रा 2एल) था। जबकि ओवरले 100% नहीं था, यह तकनीक पूरे संवहनी नेटवर्क को सटीक रूप से मैप कर रही थी। रिपोर्ट किए गए क्षेत्रों में देखे गए अंतरों को अक्सर इंट्रावाइटल बहाव या पंजीकरण के मुद्दों, मॉडल फिटिंग के कारण पतले पोत व्यास, या बढ़ते द्रव्यमान के दबाव से आरबीसी बहिष्करण के कारण ठीक जहाजों के नुकसान के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह तकनीक जीएफपी या लेबल-मुक्त ट्यूमर मॉडल (चित्रा 2 डी, एच) जैसे आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोफोर दोनों की उपस्थिति में समान रूप से अच्छी तरह से काम करती है, जिससे छवि विभाजन के लिए वास्कुलचर की पहचान करने का एक बहुत ही मजबूत और व्यापक रूप से लागू साधन प्रदान किया जाता है।

लेबल-मुक्त ट्यूमर द्रव्यमान की सीमाओं को चित्रित करने के लिए, एनएडी (पी) एच ऑटोफ्लोरेसेंस (चित्रा 1 सी) का उपयोग किया गया था। यह या तो स्वतंत्र रूप से एक NAD (P) H छवि एकत्र करके या एक तीव्रता छवि उत्पन्न करने के लिए NAD (P) H FLIM डेटा को सारांशित करके कैप्चर किया जा सकता है। या तो मार्ग ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के उपयुक्त विभाजन के लिए अनुमति देगा। एक सामान्य अवलोकन के रूप में, कैंसर कोशिकाओं में एनएडी (पी) एच के दो-फोटॉन उत्तेजना उज्ज्वल ऑटोफ्लोरेसेंस को प्राप्त करती है जो एक छवि का उत्पादन करती है जो अंधेरे नाभिक (चित्रा 2 ई, जी) के साथ कुरकुरा व्यक्तिगत कोशिकाओं को दिखाती है। इस पैटर्न का उपयोग बढ़ते द्रव्यमान की सीमा को परिभाषित करने के लिए किया जा सकता है। जबकि एनएडी (पी) एच की सरल तीव्रता-आधारित थ्रेशोल्डिंग ट्यूमर डिब्बे की सीमा को परिभाषित करना संभव है, एक ट्रेन करने योग्य विभाजन उपकरण अक्सर बेहतर प्रदर्शन करता है (चित्रा 3 बी, ई)। कुछ अन्य सामान्य रीडआउट, जैसे सेल माइग्रेशन या सेलुलर प्रोट्रूसिव विश्लेषण, माउस मॉडल के भीतर आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बहिर्जात प्रतिदीप्ति या फ्लोरोसेंटली लेबल सेल लाइनों (चित्रा 2 ए) के आरोपण से लाभान्वित हो सकते हैं। इन मामलों में, द्रव्यमान की सीमा का सीमांकन करने का कार्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन के सरल थ्रेशोल्डिंग के साथ पूरा किया जा सकता है। कभी-कभी फ्लोरोफोर की अभिव्यक्ति आरोपण के बाद काफी विषम हो सकती है। यह विभाजन समस्याओं का कारण नहीं होना चाहिए। इसके अलावा, यह अक्सर देखा गया है कि फ्लोरोसेंट एलोग्राफ्ट या 16 द्वारा बनाए गए ट्यूमर में एमएमटीवी-पायएमटी16 जैसे आनुवंशिक ट्यूमर मॉडल द्वारा बनाए गए ट्यूमर की तुलना में कोलेजन फाइबर के कम कंपार्टमेंटल क्षेत्र होते हैं।

स्ट्रोमल डिब्बे में बढ़ते द्रव्यमान के बाहर या बढ़ते द्रव्यमान के बीच के क्षेत्रों को शामिल किया गया है, और स्ट्रोमा के लिए एक मुखौटा ट्यूमर आरओआई (चित्रा 3 बी-एफ) को उलटकर प्राप्त किया जाता है। स्ट्रोमल डिब्बे को कोलेजन फाइबर आर्किटेक्चर के आधार पर उप-आरओआई में आगे बढ़ाया जा सकता है। कोलेजन फाइबर स्ट्रोमा में एक महत्वपूर्ण विशेषता है और इसमें फाइबर संगठनों की एक बड़ी विविधता है, जो सेल व्यवहार40,41 को संशोधित करने के लिए जाने जाते हैं। अक्सर संरेखित या यादृच्छिक फाइबर के कई स्थानीय (<100 μm) क्षेत्र छवि16 के भीतर मौजूद हैं। इसलिए, अपेक्षाकृत संरेखित (लाल / नीले रंग) या यादृच्छिक (हरे रंग) फाइबर संगठन (चित्रा 3I) के क्षेत्रों को ओरिएंटेशनजे प्लगइन के साथ पहचाना गया था। ओरिएंटेशनजे कोहेरेंसी रंग मानचित्र का उपयोग करके, स्थानीय फाइबर संगठन पर आधारित मास्क को विभाजन उद्देश्यों (चित्रा 3 जे) के लिए बनाया जा सकता है। इन मुखौटों को तब विशिष्ट फाइबर संगठन (चित्रा 3H, I) के प्रभावों के कारण विभेदक गतिशील स्ट्रोमल सेल व्यवहार (चित्रा 3K) का विश्लेषण करने के लिए ओवरलेड किया जा सकता है।

अब जब ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के विभिन्न डिब्बों के लिए आरओआई को परिभाषित किया गया है, तो उन्हें इंट्रावाइटल टाइमलैप्स मूवी के व्यक्तिगत फ्रेम या चैनलों पर लागू किया जा सकता है। इस बिंदु पर, इस बात पर जोर देना महत्वपूर्ण है कि चित्रा 3 ए में दिखाए गए सभी संकेत पूरी तरह से अंतर्जात स्रोतों से प्राप्त होते हैं। यह छवि स्थानिक और प्रासंगिक संकेतों की समृद्ध क्षमता को दर्शाती है जो विशुद्ध रूप से अंतर्जात, सर्वव्यापी और लेबल-मुक्त स्रोतों से आ सकती है। यहां, हमने ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) के विशिष्ट स्थानों के भीतर मैक्रोफेज की संख्या और विशेषताओं को मापने के लिए विधि की प्रयोज्यता को चित्रित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में MMTV-PyMT ट्यूमर मॉडल का उपयोग किया। एक पिछले इंट्रावाइटल अध्ययन42 से पता चला है कि एफएडी ऑटोफ्लोरेसेंस (चित्रा 3 ए, मैजेंटा कोशिकाओं, पीले तीर) के उच्च स्तर का उत्सर्जन करने वाली कोशिकाएं एफ 4 /80 एंटीबॉडी के साथ सकारात्मक रूप से दाग देती हैं और टीएमई के भीतर मैक्रोफेज की आबादी का प्रतिनिधित्व करती हैं। छवि को विभाजित करने के लिए इस वर्कफ़्लो का उपयोग करना, संख्या की कुशलतापूर्वक और सटीक रूप से जांच करना, समय के साथ सेल-सेल इंटरैक्शन की निगरानी करना, या यहां तक कि टीएमई के विभिन्न डिब्बों के भीतर मैक्रोफेज (मैजेंटा) के इस सबसेट की चयापचय विशेषताओं का निरीक्षण करना संभव है (चित्रा 3 ए, पीले तीर)। उदाहरण के लिए, एफएडी-उच्च मैक्रोफेज का व्यवहार जो विशेष रूप से एनएडी (पी) एच-उच्च ट्यूमर घोंसले के भीतर रहता है, की विशेषता हो सकती है (चित्रा 3 ई)। इसी तरह, स्ट्रोमा क्षेत्र में तंतुओं के स्थानीय संगठन के संबंध में मैक्रोफेज के व्यवहार की जांच की जा सकती है। कुछ हालिया रिपोर्टों ने संकेत दिया है कि स्ट्रोमा में मैक्रोफेज और अन्य माइग्रेटिंग कोशिकाएं अपने स्थानीय माइक्रोएन्वायरमेंट16,43,44 से यांत्रिक संकेतों के लिए उत्तरदायी हैं। इस विधि द्वारा उत्पादित फाइबर संरेखण मास्क का उपयोग करके, यादृच्छिक और संरेखित कोलेजन संगठनों के क्षेत्रों के बीच उनके अंतर व्यवहार की जांच करना संभव है। अंत में, यह वही केंद्रित विश्लेषण भी संख्या और vasculature के लिए एक परिभाषित निकटता के भीतर स्थानीयकृत मैक्रोफेज के व्यवहार को निर्धारित करने के लिए लागू किया जा सकता है। चित्रा 3 जी में, वास्कुलचर को लाल रंग में देखा जा सकता है, और मैक्रोफेज को एक बार फिर मैजेंटा में देखा जा सकता है। NAD(P)H FLIM का उपयोग करके वास्कुलचर के लिए एक मुखौटा बनाया गया था और फिर 10 पिक्सेल के फैलाव के माध्यम से विस्तारित किया गया था। चुनी गई दूरी प्रदर्शन उद्देश्यों के लिए मनमाना थी लेकिन व्यक्तिगत प्रयोग की विशेष आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित की जा सकती है। महत्वपूर्ण रूप से, जबकि यह छवि एक एकल जेड-स्लाइस की है, इस प्रक्रिया को पोत की पूरी मात्रा के आसपास व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए आसानी से 3 डी स्टैक पर एक्सट्रपलेटेड किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र1: स्तन विंडो आरोपण का ग्राफिकल सार और एक MMTV-PyMT ट्यूमर के अंतर्निहित संगठन। (A) स्तन इमेजिंग विंडो के आयाम और सामान्य आरोपण प्रक्रिया के लिए योजनाबद्ध। (B-E) यह एक बिना लेबल वाले MMTV-PyMT ट्यूमर प्रतिनिधि से एक असेंबल है जो MIW की सतह के नीचे 50 μm से शुरू होता है और 80 μm की गहराई तक जारी रहता है। गहराई मान प्रत्येक छवि के नीचे प्रदान किए जाते हैं। कोलेजन फाइबर (ग्रे) ट्यूमर की सतह पर अधिक से अधिक गहराई की तुलना में अधिक प्रचलित हैं (एनएडी (पी) एच, नीला)। स्केल बार 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एक GFP लेबल और लेबल मुक्त PyMT ट्यूमर और VASCULAture के लिए एक मार्कर के रूप में NAD (P) H FLIM के सत्यापन की प्रतिनिधि intravital छवि. स्तन वसा पैड में GFP-4T1 कोशिकाओं के एक विशिष्ट एलोग्राफ्ट की एक समग्र छवि (ए) और एक MMTV-PyMT ट्यूमर मॉडल (ई) से एक प्रतिनिधि स्तन ट्यूमर। एनएडी (पी) एच एफएलआईएम दोनों मॉडलों (बी, एफ) में वास्कुलचर को मैप करता है। ट्यूमर की पहचान करने के लिए जीएफपी प्रतिदीप्ति (सी) और एनएडी (पी) एच ऑटोफ्लोरेसेंस (जी) का उपयोग किया गया था। कोलेजन को एसएचजी (डी, एच) द्वारा कल्पना की गई थी। वास्कुलचर की पहचान करने के लिए एनएडी (पी) एच एफएलआईएम का उपयोग करने वाली एक समग्र छवि को फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान (आई, जे, के) के पूंछ शिरा इंजेक्शन से पहले और बाद में इंट्रावाइटल स्टैक के अधिकतम तीव्रता अनुमानों की तुलना करके मान्य किया गया था। चार चूहों में डेक्सट्रान इंजेक्शन द्वारा पहचाने गए क्षेत्र पर एनएडी (पी) एच एफएलआईएम द्वारा निर्धारित क्षेत्र के अनुपात का परिमाणीकरण (रंग व्यक्तिगत चूहों की पहचान करता है) और दृश्य के कई क्षेत्रों (ग्राफ में व्यक्तिगत डॉट्स) (एल) में दिखाया गया है। स्केल बार 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: लेबल मुक्त PyMT ट्यूमर के भीतर अंतर्जात प्रतिदीप्ति का उपयोग कर प्रतिनिधि छवि विभाजन. एक विशिष्ट PyMT स्तन ट्यूमर से एक एकल z-स्लाइस की एक समग्र छवि (ए) केवल आंतरिक संकेतों का उपयोग करके एकत्र की गई थी। एसएचजी (ग्रे) ट्यूमर के कोलेजन फाइबर की कल्पना करता है। एनएडी (पी) एच ऑटोफ्लोरेसेंस (ताऊ (π) का अर्थ है) की प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग कोशिकाओं के चयापचय हस्ताक्षर (हरे से नारंगी रंग) और रक्त वाहिकाओं (लाल) के स्थान की रिपोर्ट करती है। FAD autofluorescence (मैजेंटा) मैक्रोफेज की पहचान करता है। इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित विभाजन योजना का उपयोग करते हुए, लेबल-मुक्त ट्यूमर को ट्यूमर घोंसले (बी, ई), स्ट्रोमा (सी, एफ), और वास्कुलचर (डी, जी) के लिए डिब्बों में विभाजित किया गया था, जो केवल एसएचजी और एनएडी (पी) एच ऑटोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर रहा था। स्ट्रोमा और कोलेजन फाइबर (एच) को संरेखित फाइबर ((मैजेंटा / नीले रंग में दिखाया गया है), जे, के) के स्थानीय क्षेत्रों में भी वर्गीकृत किया जा सकता है। स्केल बार 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक डेटा 1: एनएडी (पी) एच एफएलआईएम से फिट ए1% का प्रतिनिधि डेटा सेट। यह एक विशिष्ट डेटा सेट से एक फिट ए1% का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण है। यह पहचान की गुणवत्ता का एक प्रतिनिधि है और ट्रेन करने योग्य क्लासिफायर का उपयोग करने से पहले पृष्ठभूमि का एक विशिष्ट स्तर है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक मॉडल: प्रतिनिधि क्लासिफायर वास्कुलचर की पहचान के लिए फिट ए1% पर उपयोग किया जाता है। यह ImageJ के भीतर trainable WEKA विभाजन प्लगइन में उपयोग के लिए एक नमूना क्लासिफायर मॉडल है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

4 डी इंट्रावाइटल इमेजिंग देशी ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के स्थानिक और अस्थायी संदर्भ के भीतर गतिशील शारीरिक बातचीत की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह पांडुलिपि ट्यूमर द्रव्यमान, आसन्न स्ट्रोमा, या संवहनी नेटवर्क की निकटता के भीतर गतिशील सेल इंटरैक्शन को विभाजित करने के लिए एक बहुत ही बुनियादी और अनुकूलनीय परिचालन ढांचा प्रदान करती है, जो दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी या एनएडी (पी) एच ऑटोफ्लोरेसेंस से केवल अंतर्जात संकेतों का उपयोग करती है। यह प्रोटोकॉल इमेजिंग विंडो के आरोपण से छवि अधिग्रहण, विश्लेषण और विभाजन तक एक व्यापक, चरण-दर-चरण विधि प्रदान करता है। हमारा मानना है कि यह तकनीक 4 डी इंट्रावाइटल डेटा को सेगमेंट और मापने के लिए एक आवश्यक विश्लेषण ढांचे में योगदान देगी।

इस प्रोटोकॉल को कई इंट्रावाइटल माउस मॉडल के साथ व्यापक रूप से संगत होने के लिए विकसित किया गया था, जिसमें अनलेबल पीडीएक्स मॉडल भी शामिल थे। पीडीएक्स एक अविश्वसनीय रूप से जानकारीपूर्ण मॉडल45 है, लेकिन इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए एक चुनौती पैदा करता है क्योंकि पीडीएक्स मॉडल की प्रकृति आनुवंशिक हेरफेर के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं है। इसलिए, यह काफी लाभप्रद होगा कि एक ऐसी विधि है जो एनएडी (पी) एच और दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) जैसे पूरी तरह से अंतर्जात चयापचयों का उपयोग करके अपने अनलेबल शारीरिक वातावरण के भीतर गतिशील इंटरैक्शन की कल्पना और कंपार्टमेंटलाइज़ कर सकती है। पीडीएक्स मॉडल के लिए फायदेमंद होने के अलावा, इस बहुआयामी दृष्टिकोण को सैद्धांतिक रूप से कैंसर या सामान्य ऊतक में किसी भी इंट्रावाइटल अध्ययन पर लागू किया जा सकता है जिसे शारीरिक प्रश्न को संबोधित करने के लिए स्थानिक और संरचनात्मक संदर्भ की आवश्यकता होती है। कोलेजन फाइबर से एनएडी (पी) एच ऑटोफ्लोरेसेंस और एसएचजी सभी ऊतकों के लिए सर्वव्यापी हैं और इंट्राविटल संग्रह में एक सार्वभौमिक और मुक्त संसाधन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह एफएलआईएम दृष्टिकोण भी मजबूत है क्योंकि यह जीएफपी जैसे बहिर्जात स्रोतों से प्रतिदीप्ति की उपस्थिति में वास्कुलचर की पहचान कर सकता है। यह दृष्टिकोण भी फायदेमंद है क्योंकि एसएचजी और एनएडी (पी) एच उत्सर्जन को नीले स्पेक्ट्रम में कल्पना की जा सकती है, जिससे एक तरंग दैर्ध्य में रहता है जो आमतौर पर फ्लोरोसेंट संलयन निर्माणों की इमेजिंग में उपयोग नहीं किया जाता है जो अन्यथा अध्ययन के लिए आवश्यक हो सकता है।

इस दृष्टिकोण का पहलू जो उपन्यास है और विशेष रूप से जोड़ा गया मूल्य है, वास्कुलचर की लेबल-मुक्त पहचान है। जबकि अन्य दृष्टिकोण काम कर सकते हैं, एनएडी (पी) एच के प्रतिदीप्ति जीवनकाल का उपयोग आसानी से अतिरिक्त लेबलिंग की आवश्यकता के बिना एक स्पष्ट हस्ताक्षर प्रदान करता है। डेटा से पता चलता है कि जीवनकाल-परिभाषित जहाजों को फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान के पूंछ शिरा इंजेक्शन से लेबल किए गए वास्कुलचर को दर्पण किया जाता है, जो वास्कुलचर इमेजिंग के लिए सोने का मानक है। हमारी तकनीक सरल दो-फोटॉन या तीन-फोटॉन उत्तेजना की तुलना में छोटी रक्त वाहिकाओं को देखने में उत्कृष्टता प्राप्त करती है, जहां बड़ी वाहिकाओं को आसानी से कल्पना की जाती है, लेकिन छोटे लोगों को पहचानने के लिए अधिक विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। जीवन भर के हस्ताक्षर आकार की परवाह किए बिना, सभी जहाजों के लिए स्पष्ट है। इसके अलावा, इस अतिरिक्त एनएडी (पी) एच एफएलआईएम अधिग्रहण को ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के विभाजन के लिए अन्य मार्करों के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है। एनएडी (पी) एच के एकल एफएलआईएम अधिग्रहण के माध्यम से, वास्कुलचर, ट्यूमर घोंसला और स्ट्रोमा को परिभाषित करने के लिए आवश्यकताएं प्राप्त करने योग्य हैं। FLIM संग्रह को एक समय श्रृंखला के अंत या शुरुआत में एक एकल अधिग्रहण एकत्र करके या पूरे 4 डी अधिग्रहण में संग्रह को इंटरलीव करके मौजूदा प्रयोगात्मक डिजाइन में शामिल किया जा सकता है। FLIM छवियों की उचित मात्रा का निर्धारण विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और बाधाओं पर निर्भर करेगा, जैसे अधिग्रहण अंतराल, प्रयोगात्मक अवधि, या छवि स्थिरता, लेकिन कम से कम, इस विधि के लिए प्रति 4 डी श्रृंखला एक एफएलआईएम संग्रह की आवश्यकता होगी।

वास्कुलचर की पहचान के लिए एनएडी (पी) एच एफएलआईएम का उपयोग करने की इस प्रक्रिया के लिए गणितीय रूप से फॉर्म के एक घातीय फ़ंक्शन के लिए एफएलआईएम डेटा को फिट करने की आवश्यकता होती है

Equation 1

A1+A2+A3=1 के साथ। जबकि साहित्य में रिपोर्ट किए गए एनएडी (पी) एच की अधिकांश आजीवन छवियों को एक द्वि-घातीय के रूप में फिट किया गया है, इस आवेदन में एनएडी (पी) एच को एक त्रि-घातीय के रूप में फिट किया गया था जहां π1 और π2 को आरबीसी के रिपोर्ट किए गए मूल्यों पर सेट किया गया था और π3 को तैरने की अनुमति है। महत्वपूर्ण रूप से, लक्ष्य सबसे सटीक जीवनकाल मूल्य प्राप्त करना नहीं है, बल्कि विभाजन के लिए एक इष्टतम छवि प्रदान करना है। जब π1 और π2 मानों को शुरू में RBC के32,46 के रिपोर्ट किए गए मूल्यों पर तय किया जाता है और मैट्रिक्स की गणना की जाती है, तो रक्त वाहिकाएं रक्त वाहिकाओं में 60% से अधिक1% मूल्यों के साथ खड़ी होंगी और ए1% मान आम तौर पर आसन्न ट्यूमर में 40% से कम होते हैं। अगला कदम आसन्न ट्यूमर में ए1% को कम करते हुए रक्त वाहिकाओं में ए1% को अधिकतम करने की कोशिश करना है। यह एक पुनरावर्ती प्रक्रिया है, और इसके अंत तक, रक्त वाहिकाओं के ए 1% मूल्य90% से अधिक होंगे, जिसमें ट्यूमर केए 1% मूल्य 10% से कम होंगे। एक बार जब रक्त वाहिकाओं के ए1% मान समान रूप से उच्च होते हैं और पृष्ठभूमि समान रूप से कम होती है, तो इन ए1% फ़ाइलों को एक ट्रेन करने योग्य विभाजन उपकरण में निर्यात करें। यह जल्दी से किसी भी शेष शोर को हटा देगा और वास्कुलचर के लिए आरओआई को परिभाषित करेगा।

जैसा कि स्तन वसा पैड शरीर गुहा के बाहर स्थित है, सर्जरी न्यूनतम इनवेसिव है, और सबसे अच्छे परिणाम 4वें वंक्षण स्तन ग्रंथि पर एमआईडब्ल्यू को प्रत्यारोपित करके प्राप्त किए जाते हैं। खिड़की आरोपण का समय और जब प्रयोग किया जाएगा महत्वपूर्ण है। शारीरिक टाइमपॉइंट से पहले सर्जरी के बाद 24 - 48 ज के उपचार की अनुमति देना सबसे अच्छा है जिसकी जांच की जाएगी। जबकि प्रक्रिया को केवल खिड़की (चित्रा 1 ए) डालने के लिए एक छोटे से चीरा (≈ 10 मिमी) की आवश्यकता होती है, सर्जरी के बाद उपचार समय किसी भी सूजन और तरल पदार्थ की अनुमति देगा जो आरोपण प्रक्रिया के कारण जमा होता है। इसके अलावा, यह ट्यूमर को खिड़की में बढ़ने के लिए जारी रखने की अनुमति देगा। दोनों कारक अस्पष्टता / प्रकीर्णन को कम करके और छवि स्थिरता में वृद्धि करके समग्र छवि गुणवत्ता में सुधार करेंगे। विचार करने के लिए अगली बात प्रयोग की नियोजित कुल अवधि है। जबकि इन खिड़कियों को अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए डिज़ाइन किया गया था, खिड़की की कठोर प्रकृति 2 से 3 सप्ताह की समय सीमा को रोकती है। उस टाइमस्पैन के बाद, खिड़की में त्वचीय परत से हटने की प्रवृत्ति होती है, जिससे प्रयोग को दूषित और समाप्त कर दिया जाता है। यदि स्तन ग्रंथि के अनुदैर्ध्य अध्ययन की आवश्यकता नहीं है, तो टर्मिनल त्वचा फ्लैप प्रक्रिया22 जैसे अन्य इंट्रावाइटल तरीके जो एमआईडब्ल्यू के सर्जिकल आरोपण को समाप्त करते हैं, एक बेहतर विकल्प हो सकता है। त्वचा फ्लैप प्रक्रिया पूरे ग्रंथि के लिए बेहतर पहुंच प्रदान करती है क्योंकि यह एमआईडब्ल्यू के प्लेसमेंट और आयामों से विवश नहीं है, और यह अधिक से अधिक छवि स्थिरता का उत्पादन कर सकती है क्योंकि ग्रंथि को शरीर की गुहा से दूर खींच लिया जाता है। इंट्रावाइटल इमेजिंग दृष्टिकोण के बावजूद, अंतर्जात प्रतिदीप्ति का उपयोग करके माइक्रोएन्वायरमेंट का विभाजन अभी भी बाद के छवि विश्लेषण के लिए व्यापक रूप से लागू होता है। विचार करने के लिए आखिरी बात व्यक्तिगत इमेजिंग प्रयोग की अवधि है। 6-8 घंटे तक चलने वाली फिल्मों को प्राप्त करना अनुचित नहीं है। हालांकि, लंबे संग्रह के दौरान, जलयोजन एक मुद्दा बन जाता है, और माउस के स्वास्थ्य की करीबी निगरानी की आवश्यकता होती है।

इस विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के विभाजन के लिए आवश्यक अंतर्जात प्रतिदीप्ति की विभिन्न छवियों को सापेक्ष आसानी से और माउस के लिए अतिरिक्त जोड़तोड़ के बिना एकत्र किया जा सकता है। यहां रिपोर्ट किए गए फ़िल्टर / डाइक्रोइक संयोजन (सामग्री की तालिका) के साथ, एसएचजी और एनएडीएच छवियों दोनों को 890 एनएम से 750 एनएम तक तरंग दैर्ध्य को स्विच करके एक ही फिल्टर सेट के साथ प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि यह अधिग्रहण देरी बनाता है, यह बाद की छवि विभाजन को प्रभावित नहीं करता है। यह याद रखना भी महत्वपूर्ण है कि यह विधि अंतर्जात प्रतिदीप्ति का उपयोग करके एक विभाजन तकनीक के लिए एक मात्र प्रारंभिक बिंदु का प्रतिनिधित्व करती है, और यदि आवश्यक हो तो अधिक उन्नत ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन एक साथ अधिग्रहण की अनुमति दे सकते हैं।

वास्कुलचर की पहचान करने के लिए एफएलआईएम का उपयोग करने की सीमाएं हैं। FLIM दृष्टिकोण को इकट्ठा करने के लिए विशेष इलेक्ट्रॉनिक्स, इंस्ट्रूमेंटेशन और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। हालांकि, इन सभी आवश्यकताओं को आधुनिक माइक्रोस्कोप में तेजी से एकीकृत किया जाता है और इमेजिंग कोर सुविधाओं के उपयोग के माध्यम से अधिक उपलब्ध होता है। एफएलआईएम एक परिपक्व तकनीक बन गई है और अच्छे डेटा प्राप्त करने के लिए अधिक प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है। एक दूसरी सीमा यह है कि FLIM अधिग्रहण समय लेने वाले हैं। जबकि फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान के साथ एकत्र की गई छवि के लिए फ्रेम दर लगभग एक सेकंड या उससे कम है, औसत एफएलआईएम संग्रह 60 एस से 120 सेकंड तक हो सकता है, जो निषेधात्मक हो सकता है यदि शारीरिक टाइमपॉइंट्स उससे कम हैं। वास्कुलचर की FLIM पहचान सभी पूंछ शिरा इंजेक्ट किए गए फ्लोरोसेंट डेक्सट्रान या वास्कुलचर के मल्टीफोटॉन उत्तेजना को प्रतिस्थापित करने का इरादा नहीं है; बल्कि, यह इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए बढ़ते टूलबॉक्स में अभी तक एक और दृष्टिकोण है। इसके अलावा, हम उम्मीद करते हैं कि आने वाले वर्षों में लंबे समय तक अधिग्रहण समय नाटकीय रूप से कम हो जाएगा। डिटेक्टरों और इलेक्ट्रॉनिक्स तेजी से सुधार कर रहे हैं, डिटेक्टर मृत समय को कम कर रहे हैं, और इस तरह फोटॉनों की एक ही संख्या पर कब्जा करने के लिए कम अधिग्रहण अवधि की आवश्यकता होती है। कम अधिग्रहण समय के बारे में आशावादी होने का एक और कारण मशीन लर्निंग सॉफ्टवेयर या सीएसबीदीप47 जैसे छवि बहाली एल्गोरिथ्म का उद्भव है। इन एल्गोरिदम को संभावित रूप से कम एक्सपोज़र समय के साथ काम करने के लिए प्रशिक्षित किया जा सकता है, जिससे विभाजन उद्देश्यों के लिए संरचनाओं की सटीक पहचान करने के लिए आवश्यक फोटॉनों की संख्या कम हो जाती है। साथ में, यह तेजी से इन बहुआयामी अधिग्रहणों के लिए आवश्यक समय सीमा को कम कर सकता है।

इंट्रावाइटल इमेजिंग का उपयोग केवल अधिक महत्वपूर्ण हो जाएगा क्योंकि शोधकर्ता शारीरिक ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर होने वाले कई जटिल सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन को उजागर करने की कोशिश करते हैं। इसलिए, अधिग्रहण, विभाजन और विश्लेषण क्षमताओं में निरंतर विकास की आवश्यकता है। इस अंत की ओर, माइक्रोएन्वायरमेंट विभाजन के लिए अंतर्जात प्रतिदीप्ति की क्षमता को अनदेखा नहीं करना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में, एसएचजी और प्रतिदीप्ति चयापचयों से अंतर्जात संकेत, एनएडी (पी) एच तीव्रता और एफएलआईएम सहित, स्तन टीएमई के इंट्रावाइटल इमेजिंग के दौरान विभाजन उद्देश्यों के लिए उपयोग किया गया था। अन्य अंतर्जात मेटाबोलाइट्स या आंतरिक गुण ट्यूमर कोशिकाओं की गतिशील पारस्परिकता और माइक्रोएन्वायरमेंट को प्रकट करने के लिए अतिरिक्त संकेत प्रदान कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एफएडी का उपयोग प्रतिरक्षा आबादी के आंदोलन की निगरानी के लिए किया जा सकताहै 42, 3 पी पीढ़ी प्लाज्मा झिल्ली या वसा36 जैसी संरचनात्मक विशेषताओं को उजागर कर सकती है, और इलास्टिन प्रतिदीप्ति का उपयोग नसों से धमनियों को अलग करने के लिए किया जा सकता है46। इसलिए, अंतर्जात प्रतिदीप्ति एक समृद्ध बहु-आयामी मंच प्रदान करना जारी रखेगा जिसका उपयोग पूरी तरह से किया जाना चाहिए क्योंकि अनुसंधान समुदाय इंट्रावाइटल माइक्रोएन्वायरमेंट विभाजन और विश्लेषण के लिए टूलबॉक्स का निर्माण करना जारी रखता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस काम के वित्तपोषण के लिए NCI R01 CA216248, CA206458, और CA179556 अनुदान स्वीकार करना चाहते हैं। हम अपने इंट्रावाइटल कार्यक्रम के शुरुआती विकास में अपनी तकनीकी विशेषज्ञता के लिए डॉ केविन एलिसीरी और उनके इमेजिंग समूह को भी स्वीकार करना चाहते हैं। हम एमआईडब्ल्यू के शुरुआती चरणों के दौरान अपने आवश्यक तकनीकी डिजाइन के लिए Morgridge Institute for Research में Dr. Ben Cox और Eliceiri Fabrication Group के अन्य सदस्यों को भी धन्यवाद देते हैं। डॉ एलेन Dobson ImageJ trainable WEKA विभाजन उपकरण के बारे में उपयोगी बातचीत के साथ सहायता की. इसके अलावा, हम डॉ मेलिसा स्काला और डॉ एलेक्सा बैरेस-हीटन को उनके माइक्रोस्कोप के समय पर उपयोग के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। अंत में, हम डॉ ब्रिगिट राबे, डीवीएम को हमारे माउस हैंडलिंग और देखभाल पर सभी विचारशील चर्चाओं और सलाह के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 12mm round cover glass Warner Instruments # 64-0712 MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection BD 309659 Syringe
20x objective Zeiss 421452-988 Water immersion
27G needle for SQ injection Covidien 1188827012 Needle
40x objective Nikon MRD77410 Water immersion
5-0 silk braided suture Ethicon K870 Suture for MIW implantation
Artificial tears gel Akorn NDC 59399-162-35 Eye gel
Betadine solution, 5% Fisher Scientific NC1558063 Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator Fisher Scientific 23-400-101
Cyanoacrylate adhesive Loctite 1365882 MIW construction
fluorescent dextran Sigma T1287-50mg intravenous labelling of vasculature
forceps Mckesson.com Miltex #18-782 stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube Hamamatsu 
heating blanket CARA 72 heating pad  038056000729 Temperature selectable
heating chamber home built
Fluorescent lifetime handbook Becker and Hickl https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base Nikon
Isoflurane Akorn NDC 59399-106-01 Anesthesia
Liqui-Nox Fisher Scientific 16-000-125 MIW cleaning
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10 Analgesic
Micro Hose Scientific Commodities INC.  BB31695-PE/1
multiphoton scan head Bruker Ultima II Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter Chroma 284994 ET 440/80 m-2P
Nair CVS 339826 Depilatory cream
objective heater Tokai Hit STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter Chroma 320740 ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner Amazon.com B00814ME24 Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board Becker and Hickl
surgical light FAJ B06XV1VQVZ Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors Excelta 366 stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment Actavis Pharma NDC 0472-0179-34 Antibiotic
TV catheter Custom BD 30G needle: 305106 Catheter for TV injection
Two photon filter Chroma 320282 ET585/65m-2P
two-photon laser Coherent charmeleon Tunable multiphoton laser
ultrasound gel Parker PKR-03-02 Water immersion gel
Urea crystals Sigma U5128-5G Optional: FLIM IRF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
  2. Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
  3. Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
  4. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120 (2020).
  5. Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
  6. Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
  7. Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173 (2020).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
  9. Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
  10. Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
  11. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  12. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
  13. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
  14. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
  15. Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
  16. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  17. Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
  18. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  19. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490 (2019).
  22. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  23. Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
  24. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  25. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  26. Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
  27. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  28. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  29. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007 (2014).
  30. Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  31. Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
  32. Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
  33. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  34. von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), New York, N.Y. 925-938 (2013).
  35. Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
  36. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125 (2018).
  37. Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
  38. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), Oxford, England. 2424-2426 (2017).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  41. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  42. Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086 (2016).
  43. Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787 (2020).
  44. Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850 (2019).
  45. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
  46. Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171 (2017).
  47. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).

Tags

कैंसर अनुसंधान अंक 183
स्तन ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए एक लेबल-मुक्त विभाजन दृष्टिकोण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burkel, B. M., Inman, D. R.,… More

Burkel, B. M., Inman, D. R., Virumbrales-Muñoz, M., Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (183), e63413, doi:10.3791/63413 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter