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Cancer Research

Un approccio di segmentazione senza etichette per l'imaging intravitale del microambiente del tumore mammario

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63413
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

Summary

Il metodo di imaging intravitale qui descritto utilizza la seconda generazione armonica di collagene e la fluorescenza endogena dal cofattore metabolico NAD(P)H per segmentare in modo non invasivo un microambiente tumorale non etichettato in compartimenti tumorali, stromali e vascolari per l'analisi approfondita delle immagini intravitali 4D.

Abstract

La capacità di visualizzare interazioni fisiologiche complesse e dinamiche tra numerosi tipi di cellule e la matrice extracellulare (ECM) all'interno di un microambiente tumorale vivo è un passo importante verso la comprensione dei meccanismi che regolano la progressione del tumore. Mentre questo può essere realizzato attraverso le attuali tecniche di imaging intravitale, rimane impegnativo a causa della natura eterogenea dei tessuti e della necessità di un contesto spaziale all'interno dell'osservazione sperimentale. A tal fine, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro di imaging intravitale che accoppia l'imaging di seconda generazione armonica del collagene, la fluorescenza endogena dal cofattore metabolico NAD(P)H e la microscopia di imaging a vita di fluorescenza (FLIM) come mezzo per compartimentare in modo non invasivo il microambiente tumorale in domini di base del nido tumorale, dello stroma circostante o ECM e della vascolarizzazione. Questo protocollo non invasivo descrive in dettaglio il processo passo-passo che va dall'acquisizione di immagini time-lapse di modelli di tumore mammario all'analisi post-elaborazione e alla segmentazione delle immagini. Il vantaggio principale di questo flusso di lavoro è che sfrutta le firme metaboliche per contestualizzare il microambiente tumorale vivo che cambia dinamicamente senza l'uso di etichette fluorescenti esogene, rendendolo vantaggioso per i modelli di xenotrapianti derivati dal paziente umano (PDX) e per il futuro uso clinico in cui i fluorofori estrinseci non sono facilmente applicabili.

Introduction

La matrice extracellulare (ECM) nel microambiente tumorale è nota per essere depositata dinamicamente e rimodellata da più tipi di cellule per facilitare ulteriormente la progressione della malattia 1,2,3. Queste alterazioni della matrice forniscono segnali sia meccanici che biologici che alterano il comportamento cellulare e spesso si traducono in un ciclo continuo di rimodellamento della matrice4. L'indagine sull'interazione dinamica e reciproca tra le cellule tumorali e la matrice extracellulare viene spesso condotta utilizzando colture tridimensionali (3D) in vitro o sistemi microfluidici. Mentre questi approcci bottom-up hanno dimostrato meccanismi di rimodellamento dell'ECM 5,6,7, aumento della proliferazione8, transizione da epiteliale a mesenchimale 9,10,11,12 e migrazione e invasione delle cellule tumorali 7,13,14,15,16 , il loro focus si è concentrato principalmente su alcuni tipi di cellule (ad esempio, cellule tumorali o fibroblasti) all'interno di una matrice 3D omogenea rispetto alla diversità e all'eterogeneità delle interazioni presenti all'interno di un tessuto fisiologico. Oltre ai sistemi in vitro, l'istologia tumorale ex vivo può anche fornire alcune informazioni su queste interazioni cellula-cellula e cellula-ECM17. L'immunoistochimica ha il vantaggio di poter analizzare più tipi di cellule rispetto alla composizione e all'architettura spazialmente eterogenee dell'ECM, ma gli endpoint statici del tessuto fisso non catturano la natura dinamica delle interazioni tra le cellule e il microambiente. L'imaging intravitale ha aperto la porta per interrogare interazioni diverse e dinamiche all'interno del contesto fisiologico del microambiente tumorale nativo.

Le capacità dell'imaging tumorale intravitale stanno rapidamente avanzando. I miglioramenti nella progettazione delle finestre di imaging e le tecniche chirurgiche per impiantare le finestre hanno consentito l'imaging longitudinale del tumore a lungo termine in una varietà di posizioni anatomiche (ad esempio, tumore primario, linfonodi, siti metastatici 18,19,20). Inoltre, la capacità della strumentazione ottica di visualizzare e raccogliere dati in più dimensioni (ad esempio, spettrale, intensità di fluorescenza spaziale e durata) e ad alta risoluzione e velocità (velocità video) sta diventando ampiamente accessibile. La tecnologia migliorata offre l'opportunità di esplorare rapidi cambiamenti nella segnalazione cellulare e nelle dinamiche fenotipiche all'interno di un ambiente fisiologico. Infine, l'espansione degli strumenti optogenetici e l'ampia gamma di costrutti fluorescenti genetici consentono l'etichettatura di specifici tipi di cellule per catturare la migrazione cellulare nel microambiente tumorale o il tracciamento del lignaggio cellulare durante lo sviluppo o la progressione della malattia21,22. L'uso di questi strumenti in combinazione con la tecnologia CRISPR / Cas9 offre ai ricercatori l'opportunità di generare modelli animali unici in modo tempestivo.

Mentre tutti questi progressi rendono l'imaging intravitale un metodo sempre più potente per esplorare le interazioni cellulari dinamiche e fisiologiche, c'è ancora un'importante necessità di sviluppare strategie che forniscano un contesto spaziale, temporale e strutturale a livello tissutale a queste interazioni biologiche. Attualmente, molti studi di imaging intravitale compensano la mancanza di punti di riferimento visivi come i vasi sanguigni iniettando coloranti fluorescenti nella vascolarizzazione o impiegando modelli murini che esprimono esogenamente proteine fluorescenti per delineare le caratteristiche fisiche. Coloranti iniettabili e substrati come dextrans fluorescenti sono ampiamente utilizzati per etichettare con successo la vascolarizzazione nelle collezioni intravitali19, 23, 24. Tuttavia, questo approccio non è privo di limitazioni. Per uno, richiede ulteriori manipolazioni del mouse e la sua utilità è limitata agli esperimenti a breve termine. Per gli studi longitudinali, il destrano fluorescente può essere problematico in quanto osserviamo l'accumulo di destrano nelle cellule fagocitiche o la diffusione nel tessuto circostante nel tempo25. L'incorporazione di proteine fluorescenti esogene nel modello murino è stata presentata come alternativa al dextrans fluorescente, ma presenta dei limiti propri. La disponibilità e la diversità dei fluorofori esogeni all'interno dei modelli murini sono ancora limitate e costose da creare. Inoltre, in modelli specifici, come i modelli PDX, le manipolazioni genetiche non sono desiderabili o possibili. È stato anche dimostrato che la presenza di proteine fluorescenti o bioluminescenti all'interno delle cellule sono riconosciute come estranee all'interno del topo, e all'interno di modelli murini immunocompetenti, questo riduce la quantità di metastasi dovute alla risposta del sistema immunitario dell'ospite26,27. Infine, le proteine fluorescenti esogene o i coloranti fluorescenti utilizzati per il contesto spaziale o per segmentare i dati successivi spesso occupano intervalli primi dello spettro luminoso che potrebbero altrimenti essere utilizzati per indagare le interazioni fisiologiche di interesse.

L'uso del segnale intrinseco dall'ECM o della fluorescenza endogena dalle cellule all'interno del tessuto rappresenta un potenziale mezzo universale privo di etichette per segmentare i dati intravitali per un'analisi cellulare e spaziale più approfondita. La seconda generazione armonica (SHG) è stata a lungo utilizzata per visualizzare l'ECM28. Con il successivo sviluppo di importanti strumenti per aiutare nella caratterizzazione dell'organizzazione delle fibre 29,30,31, è possibile caratterizzare il comportamento cellulare relativo alla struttura ECM locale. Inoltre, l'autofluorescenza del metabolita endogeno, NAD(P)H, fornisce un altro strumento privo di etichette per compartimentare il microambiente tumorale in vivo. Nad(P)H fluoresce brillantemente nelle cellule tumorali e può essere utilizzato per discriminare i confini del nido tumorale in crescita dal suo stroma circostante21,32. Infine, la vascolarizzazione è un'importante struttura fisiologica nel microambiente tumorale e il sito di interazioni chiave specifiche per tipo cellulare 33,34,35. L'eccitazione dei globuli rossi (RBC) o del plasma sanguigno è stata utilizzata per visualizzare la vascolarizzazione tumorale e utilizzando l'eccitazione a due o tre fotoni (2P; 3P) la misurazione delle velocità del flusso sanguigno ha dimostrato di essere possibile36. Tuttavia, mentre i vasi sanguigni più grandi sono facilmente identificabili dalle loro firme di fluorescenza endogena, l'identificazione di piccoli vasi sanguigni sottili, variabili e meno fluorescenti richiede più esperienza. Queste difficoltà intrinseche ostacolano la segmentazione ottimale dell'immagine. Fortunatamente, queste fonti di fluorescenza endogena (cioè globuli rossi e plasma sanguigno) possono anche essere misurate mediante imaging a fluorescenzaa vita 37, che capitalizza sulle proprietà fotofisiche uniche della vascolarizzazione e rappresenta un'utile aggiunta alla crescente cassetta degli attrezzi intravitale.

In questo protocollo, viene descritto un flusso di lavoro per la segmentazione dell'imaging intravitale quadridimensionale (4D) utilizzando esplicitamente segnali intrinseci come la fluorescenza endogena e l'SHG dall'acquisizione all'analisi. Questo protocollo è particolarmente pertinente per gli studi longitudinali attraverso una finestra di imaging mammario in cui la fluorescenza esogena potrebbe non essere pratica o possibile, come nel caso dei modelli PDX. I principi di segmentazione qui delineati, tuttavia, sono ampiamente applicabili agli utenti intravitali che studiano la biologia del tumore, lo sviluppo dei tessuti o anche la normale fisiologia dei tessuti. La suite di approcci di analisi riportata consentirà agli utenti di differenziare il comportamento cellulare tra regioni di configurazioni di fibre di collagene allineate o casuali, confrontare numeri o comportamenti di cellule residenti in regioni specifiche del microambiente tumorale e mappare la vascolarizzazione al microambiente tumorale utilizzando solo il segnale privo di etichette o intrinseco. Insieme, questi metodi creano un quadro operativo per massimizzare la profondità delle informazioni acquisite dall'imaging intravitale 4D della ghiandola mammaria, riducendo al minimo la necessità di ulteriori etichette esogene.

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Protocol

Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Wisconsin-Madison. Il benessere e la gestione del dolore in tutti gli esperimenti sugli animali sono fondamentali. Pertanto, viene fatto ogni sforzo per assicurarsi che l'animale sia a suo agio e ben curato in ogni fase della procedura.

1. Generazione della finestra di imaging mammario (MIW)

  1. Per costruire la finestra di imaging mammario, fabbricare un anello da 14 mm in acciaio inossidabile di grado chirurgico.
  2. Pulire il telaio della finestra lavorato utilizzando una soluzione calda di detergente detergente al 5%, risciacquare per 10 minuti sotto acqua deionizzata corrente (DI), immergere in etanolo al 100% per 10 minuti e quindi asciugare sotto una lampada di calore. Autoclave del telaio MIW essiccato e conservarlo per un uso successivo.
  3. Preparare il vetro di copertura MIW come segue: Immergere il vetro di copertura rotondo # 1,5 da 12 mm in etanolo al 100% per 10 minuti, asciugare sotto una lampada termica e quindi fissare al telaio MIW metallico utilizzando adesivo cianoacrilato. Curare l'adesivo durante la notte.
  4. Pulire il MIW assemblato dall'adesivo in eccesso utilizzando un tampone imbevuto di acetone e pulirlo immergendolo in etanolo al 70% per 10 minuti. Lasciare asciugare la finestra pulita. Preparare il MIW in anticipo e conservarlo in una capsula di Petri sterile prima dell'impianto chirurgico.

2. Impianto chirurgico del MIW

  1. Strumenti chirurgici in autoclave e sanificare le superfici con etanolo al 70% prima di iniziare l'intervento chirurgico per l'impianto della finestra.
  2. Eseguire un intervento chirurgico su un tavolo igienizzato utilizzando una coperta riscaldante coperta da un campo sterile. Impostare la coperta riscaldante in modo tale che la temperatura misurata sulla parte superiore del campo sterile sia di 40 °C.
  3. Utilizzare l'illuminazione fredda ausiliaria per aiutare a prevenire l'essiccazione dei tessuti. Utilizzare lenti d'ingrandimento per facilitare la procedura chirurgica. Indossare DPI costituiti da un cappotto da laboratorio sterile monouso, maniche chirurgiche, guanti, protezione per gli occhi e maschera facciale come raccomandato dalle migliori pratiche chirurgiche.
  4. Anestetizzare il mouse utilizzando una vaporizzatore per anestesia con un'impostazione isoflurano del 2,0% e una portata di ossigeno di 2,0 L/min. Somministrare analgesico (10 mg/kg di meloxicam) mediante iniezione sottocutanea.
    NOTA: Fornire dosi aggiuntive entro le prime 24 ore, preferibilmente ogni 8-12 ore per i primi 2 giorni dopo l'intervento chirurgico.
  5. Una volta anestetizzato (confermato da nessuna risposta al pizzicamento delle dita), applicare un gel idratante per gli occhi per prevenire l'asciugatura degli occhi. Utilizzare una crema depilatoria per rimuovere la pelliccia nel sito chirurgico (4° ghiandola mammaria inguinale) seguita da risciacquo con garza sterile imbevuta d'acqua.
  6. Preparare il sito chirurgico depilato per l'intervento chirurgico igienizzando la superficie della pelle con 3 scrub alternati di betadina ed etanolo.
  7. Per iniziare l'intervento chirurgico, sollevare delicatamente la pelle sopra la 4a ghiandola mammaria numero 4 usando una pinza. Una volta che la pelle viene allontanata dalla parete del corpo, rimuovere una sezione di ~ 1 mm dello strato dermico sulla punta della pinza con microforbici chirurgiche. Se si verifica sanguinamento, applicare una leggera pressione con una garza sterile fino a quando l'emorragia si ferma.
    NOTA: In generale, i tumori più grandi hanno un maggiore potenziale di sanguinamento rispetto ai tumori più piccoli o ai tessuti normali.
  8. Staccare la ghiandola mammaria dallo strato dermico con movimenti delicati della pinza all'apertura chirurgica per evitare di tagliare la ghiandola sottostante.
  9. Creare un'incisione di 10 mm e rilasciare la ghiandola mammaria dallo strato dermico alla periferia in modo che le suture possano essere posizionate senza penetrare nella ghiandola mammaria. Aggiungere PBS per coprire la ghiandola / tumore esposto e per prevenire l'essiccazione.
  10. Crea una sutura a corda di borsa lungo la periferia dell'apertura usando la sutura intrecciata di seta 5-0. Inserire un bordo del MIW in modo che lo strato dermico si innesti nella tacca ricevente del MIW.
  11. Allungare delicatamente l'epitelio sul lato opposto del MIW e spingere il MIW metallico in posizione in modo tale che lo strato dermico innesti completamente la tacca ricevente attorno all'intera circonferenza MIW. Stringere il cordone della borsa per attirare lo strato dermico nella tacca e legarlo per fissare completamente il MIW.
  12. Aggiungere un antibiotico topico allo strato dermico al MIW e monitorare continuamente il topo fino a quando non ha riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la reclinazione sternale. Ospitare il topo impiantato MIW separatamente su una lettiera morbida con un igloo posto nella gabbia e consentire al topo di recuperare per 48 ore prima dell'imaging.

3. Posizionamento e mantenimento del mouse sullo stadio del microscopio per l'imaging

  1. Impostare la camera di riscaldamento sul palco del microscopio. Utilizzare un sistema ad aria forzata impostato su 30 °C o qualsiasi altro sistema simile. Utilizzare un riscaldatore obiettivo per evitare la deriva nella messa a fuoco z. Consentire al sistema di raggiungere l'equilibrio per almeno 1 ora prima dell'imaging.
    NOTA: I topi anestetizzati non sono in grado di mantenere correttamente la loro temperatura corporea e, pertanto, è necessario disporre di un ambiente riscaldato per eventuali acquisizioni time-lapse . Il riscaldatore obiettivo aiuta a combattere gli effetti dell'espansione termica, un fenomeno che causa la deriva nella messa a fuoco z mentre la lente dell'obiettivo e il tessuto ripreso raggiungono l'equilibrio termico.
  2. Una volta che la camera di riscaldamento del microscopio si è stabilizzata a 30 °C, anestetizzare il mouse ricevente con impostazioni della macchina per anestesia del 2% di isoflurano e portata di ossigeno di 2 L/min.
  3. Dopo che il mouse è stato sedato (confermato dalla mancata risposta al pizzico della punta), pulire l'esterno del vetro MIW con un applicatore di cotone e un detergente per vetri, aggiungere unguento per gli occhi per evitare l'essiccazione e inserire un catetere per la vena della coda, se necessario.
  4. Per mantenere una corretta idratazione, somministrare un'iniezione iniziale di 0,5 ml di PBS per via sottocutanea o 100 μL attraverso il catetere della vena della coda. Ripetere ogni 2 ore per tutta la durata della sessione di imaging.
  5. Una volta che il mouse è stato preparato correttamente, impostare il microscopio per l'imaging. Per ridurre l'evaporazione durante le misurazioni time-lapse, utilizzare un gel a base d'acqua anziché acqua per il mezzo di immersione. Questo dovrebbe essere fatto prima di posizionare il mouse sul palco. Si prega di consultare la Tabella dei materiali per i dettagli dei componenti ottici.
  6. Posare il mouse sul palco del microscopio, montare il tubo isoflurano e premere il collare del MIW in un foro di ricezione di 14 mm nell'inserto del palco per stabilizzare le immagini. Mettere a fuoco il campo di imaging utilizzando gli oculari del microscopio e utilizzare l'illuminazione a campo luminoso per osservare la vascolarizzazione con il flusso sanguigno.
  7. Controllare la stabilità del campo visivo. Se sono presenti artefatti di movimento respiratorio, applicare una leggera compressione sul retro della ghiandola con un piccolo blocco di schiuma e un pezzo di nastro adesivo simile a una cintura. Dopo l'applicazione della compressione, verificare che il flusso sanguigno sia mantenuto in tutto il campo visivo.
  8. Regolare periodicamente i livelli di isoflurano con incrementi dello 0,25% durante la sessione di imaging per mantenere un livello adeguato di sedazione contando manualmente la respirazione animale.
  9. Mantenere una velocità di 36-40 respirazioni al minuto (rpm) per migliorare la longevità degli animali e l'imaging ottico. Tassi di respirazione più bassi possono far sì che il topo non sopravviva all'esperimento, mentre i tassi di respirazione superiori a 60 giri / min possono causare una scarsa sedazione, che può aumentare la respirazione e gli artefatti di movimento nei dati dell'immagine.

4. Configurazione per l'imaging intravitale 4D, basato sull'intensità, senza etichette del comportamento dinamico delle cellule

  1. Una volta che il mouse è sedato e posizionato saldamente sullo stadio del microscopio invertito, iniziare a localizzare le regioni di interesse.
  2. Utilizzando una sorgente luminosa diretta al MIW, utilizzare gli oculari del microscopio per identificare potenziali aree di indagine. Aggiungi e salva le posizioni x, y nel software per tornare a queste posizioni.
    NOTA: I dettagli fini del tumore non saranno facilmente visibili con questo tipo di illuminazione. L'obiettivo è semplicemente quello di identificare le regioni per ulteriori indagini. L'attenzione si concentra sulla visione della vascolarizzazione e del flusso sanguigno.
  3. Dopo aver salvato diverse posizioni nel software, visualizzare in anteprima i campi visivi scelti utilizzando l'eccitazione a 890 nm e il cubo del filtro FAD/SHG. Utilizzare un tempo di permanenza massimo di 4 μs con potenza inferiore e impostazione PMT elevata. L'obiettivo è quello di visualizzare in anteprima i campi visivi senza sovraesporre il tessuto a luce laser eccessiva.
  4. Una volta impostati i livelli di potenza appropriati, impostare gli z-stack. Osservare la comparsa di abbondanti fibre di collagene (SHG) a 20-50 μm sotto la superficie di vetro del MIW. Il collagene diventerà meno prevalente man mano che il microscopio si inserisce più in profondità nel tumore (Figura 1B). I vuoti nel SHG rivelano la posizione delle masse tumorali.
  5. Impostare la z-slice superiore, sotto lo strato di cellule solitarie dove le prime fibre di collagene appaiono a ~ 50-100 μm. Impostare la z-slice inferiore a ~ 250 μm, dove le fibre svaniscono e domina il segnale scarso. Ripeti questa operazione per tutte le posizioni x-y salvate.
  6. Una volta impostato l'intervallo z-stack, aumentare il tempo di permanenza (fino a 8 μs) e ottimizzare le impostazioni di potenza e del rilevatore. Ottimizza i livelli di potenza secondo necessità per eccitare il tessuto per ogni esperimento. L'utilizzo di potenze fino a 90 mW a 750 nm o 70 mW a 890 nm all'apertura posteriore dell'obiettivo rientra in un intervallo accettabile.
    NOTA: la profondità di imaging, la quantità di dispersione all'interno del tessuto, le caratteristiche oggettive e la sensibilità del rilevatore avranno un impatto significativo sulla quantità di energia necessaria per ottenere un'immagine.
  7. Regola gli intervalli di tempo in base agli obiettivi sperimentali. Inizia con intervalli di 10 minuti tra i punti di raccolta per la maggior parte dei filmati di migrazione intravitale.
  8. Anche se l'eccitazione 2P è delicata su cellule e tessuti, sii consapevole dei segni di fototossicità, come il blebbing cellulare o l'autofluorescenza in rapido aumento e l'eccessivo fotosbiancamento. Ridurre la potenza del laser o aumentare gli intervalli di timelapse come indicano le condizioni.

5. Imaging a fluorescenza (FLIM) di NAD(P)H

  1. Pur preservando le posizioni x-y dalle acquisizioni timelapse, impostare il microscopio per raccogliere uno stack FLIM. Inserire un filtro 440/80 in un portafiltro davanti al rilevatore GaAsP e impostare la tensione del rilevatore GaAsP su 800 nel software. Spegnere le luci della stanza quando i rilevatori sono accesi.
  2. Nel software, passare dall'imaging dell'intensità basato su galvanometro a una modalità di imaging FLIM.
  3. Allo scopo di identificare e mascherare la vascolarizzazione, impostare la risoluzione su 512 x 512 pixel. Per raccogliere informazioni metaboliche complementari, impostare la risoluzione su 256 x 256 pixel per aumentare la risoluzione temporale della firma a vita. Impostare il tempo di permanenza a 4 μs e sintonizzare il laser su 750 nm.
  4. Avviare la scansione di anteprima e iniziare a regolare la potenza del laser. Regolare la potenza del laser fino a quando la lettura per il discriminatore di frazione costante (CFD) è compresa tra 1 x 105 e 1 x 106. Non superare 1 x 106 in quanto ciò comporterà l'accumulo di fotoni e scarsi risultati complessivi.
  5. Una volta impostato il livello di potenza, impostare il tempo di integrazione tra 90 s e 120 s e avviare la raccolta FLIM. Acquisirà fotoni dal campo visivo per il tempo assegnato.
  6. Facoltativo: dopo che tutte le raccolte necessarie sono state effettuate e il mouse è stato rimosso dallo stadio, raccogliere una funzione di risposta dello strumento (IRF). Misurare l'IRF visualizzando la superficie dei cristalli di urea disponibili in commercio in una parabola con fondo di vetro con gli stessi parametri e la configurazione utilizzata per l'imaging del tessuto.
    NOTA: l'IRF tiene conto di eventuali ritardi o riflessioni dovuti alla configurazione elettronica o ottica. L'IRF è coinvolto in tutte le acquisizioni FLIM e il deconvolgimento dai dati può migliorare l'accuratezza delle curve di decadimento della fluorescenza calcolate. Detto questo, gli IRF calcolati possono spesso replicare ragionevolmente la qualità delle curve di decadimento della fluorescenza dall'IRF misurato. È buona norma misurare l'IRF fino a quando non sarà stato determinato che l'IRF calcolato produrrà adattamenti equivalenti delle curve di decadimento e approssima adeguatamente i risultati dell'IRF misurato.

6. Analisi delle immagini NADH Lifetime

  1. Aprire il software FLIM e importare l'immagine a vita NAD(P)H dal set di dati. Per ulteriori dettagli su come utilizzare correttamente il software, consultare i manuali sulla durata della fluorescenza (vedere la tabella dei materiali).
  2. Per iniziare, definire i parametri del modello nel software. Nella barra dei menu, fate clic su Opzioni (Options > Model). Selezionare le caselle seguenti: Impostazioni > Decadimento multievolutivo, Metodo di adattamento > MLE, Binning spaziale > quadrato, Soglia > picco e selezionare Correggi spostamento prima di calcolare l'immagine.
  3. Nella barra dei menu, fai clic su Colore > A1% dal menu a discesa. Sul lato destro della finestra, definirlo come un adattamento a tre componenti. Impostare la dimensione del cestino > 3.
  4. Regolare la soglia > ~10. Rivalutare l'accuratezza della soglia dopo che la matrice di decadimento è stata calcolata per la prima volta.
  5. Fissare il τ1 a 200 ps. Questo rappresenta la breve durata dei globuli rossi. Cerca di trovare il valore che meglio corrisponde a più punti nel vaso sanguigno più grande, che può essere visto nell'immagine di intensità. Fissare il τ2 a 1200 ps. Questo rappresenta la lunga durata dei globuli rossi.
    NOTA: i valori impostati sono solo il punto di partenza. I valori dovranno essere ottimizzati per far risaltare maggiormente la vascolarizzazione. Nella maggior parte dei casi, ma non sempre, questi valori diminuiranno.
  6. In Calcola nella barra dei menu selezionare Matrice decadimento. Ciò genererà un'iniziale A1% di immagini con la vascolarizzazione con valori elevati. Usa il cursore (mirino) per passare il mouse sopra la vascolarizzazione. Sistematicamente e uno alla volta, sposta (deseleziona la casella Correggi ) τ1 e τ2. Registrare questi valori in quanto aiuteranno a ottimizzare i parametri fissi.
    NOTA: L'obiettivo non è necessariamente quello di ottenere i valori più accurati nell'immagine, ma piuttosto di massimizzare la disparità tra la vascolarizzazione e il tessuto senza diminuire drasticamente l'area identificata come vascolare.
  7. Una volta identificati i parametri appropriati per τ1 e τ2, nella barra dei menu selezionare Calcola > elaborazione batch. Assicurarsi che la maggior parte delle impostazioni siano simili tra le z-slice.
  8. Assicurati di verificare che non ci sia un'impostazione grossolanamente diversa dalle altre. In tal caso, regolare prima il turno e riprovare. Se il problema persiste, eseguire il refit utilizzando nuovi parametri. Uno spostamento errato può essere una grande causa di rumore negli attacchi e può aumentare i valoridell'1% nelle regioni tumorali adiacenti.
  9. Nella scheda menu, salvare i file e quindi esportare I file A1%. Carica questi file in ImageJ per il mascheramento e la segmentazione.

7. Segmentazione dell'immagine della vascolarizzazione

  1. Aprire ImageJ e importare l'immagine A1% come immagine di testo. Ripeti questa operazione per tutte le immagini all'interno dello stack.
  2. Con tutte le immagini A1% aperte, selezionare Image > Stack > Z-Project. Utilizzate la proiezione di intensità massima e salvate le immagini. Vedere Dati supplementari 1 per un'immagine rappresentativa.
  3. Vai a Plugin > segmentazione. Selezionare il plug-in di segmentazione WEKA38 addestrabile.
  4. Una volta aperta la finestra WEKA, utilizzare le impostazioni predefinite e iniziare ad addestrare il software creando due classi e tracciando linee sopra la vascolarizzazione (regioni alte A1%) e non vascolarizzate (regioni A1% basse).
  5. Continuare ad aggiungere nuove tracce alle due classi fino a quando il software non identifica in modo coerente le regioni A1% elevate della vascolarizzazione, eliminando al contempo eventuali regioni più elevate di rumore di fondo. Vedere Modello supplementare per il modello di classificatore rappresentativo.
  6. Una volta prodotta l'immagine classificata, fare clic su Immagine > Tipo > 8 Bit. Soglie l'immagine e creare una maschera. Se l'immagine con soglia deve ancora essere ripulita ulteriormente, utilizzare la funzione Analizza particelle .
  7. Regolare le dimensioni e la circolarità fino a escludere le regioni più piccole e circolari dell'immagine con soglia. Si ottiene una maschera pulita con solo la vascolarizzazione e pochissimo sfondo.
  8. Fare clic su Modifica selezione > > Crea selezione. Trasferisci la selezione al ROI manager facendo clic su Analizza > Strumenti > ROI manager.
  9. Duplicare l'immagine classificata. Passare a Elabora > binario. Per espandere la maschera e definire la distanza dalla vascolarizzazione che verrà inclusa nella segmentazione dell'immagine, selezionare Dilate. Ripetere l'operazione fino a quando la maschera non si è espansa fino all'intervallo desiderato. Registrare questa regione di interesse (ROI) nel ROI manager.
    NOTA: L'obiettivo di questo passaggio è quantificare la quantità o il comportamento entro una certa vicinanza del vaso sanguigno (ad esempio, il numero di cellule presenti entro X μm dei vasi sanguigni). La quantità di dilatazione richiesta è interamente determinata dalla questione scientifica.
  10. Per quantificare il numero di celle all'interno delle regioni restrittive, selezionare la finestra (immagine/canale) di interesse. Questa può essere qualsiasi finestra che condivide lo stesso campo visivo della maschera vascolare. Applica entrambi i ROI utilizzando la funzione XOR dal menu a discesa.
    NOTA: Questa operazione misurerà gli elementi entro la distanza desiderata dalla vascolarizzazione, escludendo la vascolarizzazione stessa. Questo approccio ROI combinato può quindi essere utilizzato per misurare una moltitudine di parametri, come l'intensità, il numero di celle o la migrazione.

8. Segmentazione dell'immagine del nido tumorale

  1. Aprire l'immagine NADH da una scansione ad alta intensità di risoluzione o da una raccolta FLIM in ImageJ.
    NOTA: questa operazione può essere eseguita su singole z-slice, stack completi o applicata a z-projection di alcune slice.
  2. Vai a Plugin > segmentazione. Seleziona il plug-in di segmentazione WEKA addestrabile.
  3. Una volta aperta la finestra WEKA, utilizzare le impostazioni predefinite e iniziare a addestrare il software in due classi di regioni alte NADH e regioni basse NADH. Le regioni ad alto NADH avranno un modello molto distinguibile di cellule con nuclei e il software lo identificherà facilmente.
  4. Continua a passare avanti e indietro con la sovrapposizione per perfezionare l'algoritmo con un addestramento aggiuntivo fino a quando non riconosce tutte le regioni del tumore come determinato dall'occhio e dalla precedente conoscenza della morfologia del tumore. Questo è un processo iterativo.
  5. Una volta che l'algoritmo riconosce tutte le regioni del tumore, selezionare il pulsante Crea risultato . Questo produrrà una nuova immagine. Duplica questa immagine.
  6. Selezionare la prima immagine duplicata e convertirla in un'immagine a 8 bit selezionando Immagine > Tipo > 8 bit. Soglia di questa immagine per creare una maschera binaria. Quindi crea una selezione e trasferiscila al ROI manager. Questi ROI definiranno lo stroma.
  7. Selezionare la seconda immagine duplicata e convertirla in un'immagine a 8 bit. Invertire l'immagine selezionando Immagine > Modifica > Inverti e quindi soglie per creare una maschera binaria. Ancora una volta crea una selezione e trasferiscila al ROI manager. Questo ROI definirà il nido tumorale.

9. Segmentazione delle immagini per organizzazione o allineamento della fibra

  1. Per iniziare, apri le immagini SHG, prepara qualsiasi proiezione z e valuta la necessità di qualsiasi pre-elaborazione. Per ottenere buoni risultati, sono necessarie immagini di alta qualità con fibre distinguibili e basso rumore.
  2. Facoltativo: per la pre-elaborazione in ImageJ per aumentare il segnale-rumore (SNR) del canale SHG, sottrarre lo sfondo utilizzando una sottrazione a sfera rotante. Per la maggior parte delle applicazioni, utilizzare una sottrazione a sfera mobile compresa tra 20 pixel e 50 pixel. Quindi smussare l'immagine e salvarla.
  3. Aprire il plugin OrientationJ e impostare i parametri di elaborazione. Nella finestra OrientationJ, definite le dimensioni della finestra tensoriale locale. Per un'immagine 20x di questa densità di fibra, impostare 10 pixel su 15 pixel come punto di partenza.
  4. Selezionate Spline cubica (Cubic Spline) come modello sfumato e selezionate la casella Rilevamento colore (Color Survey). Definite il rilevamento del colore. Imposta sia la tonalità che la saturazione come coerenza, quindi definisci la luminosità come immagine originale, premi Esegui.
  5. Il file di output del plugin è RGB colormap. Regolare il valore della finestra del tensore locale fino a quando le regioni allineate, determinate dall'occhio, vengono evidenziate correttamente con tonalità blu e magenta.
  6. Una volta che l'immagine di output è soddisfacente, separare questa immagine RGB in 3 canali. Selezionare Immagine > Colore > Canale diviso.
  7. Per migliorare l'aspetto delle regioni allineate ai fini del mascheramento, utilizzare il calcolatore di immagini selezionando Elabora > Calcolatore immagini. Utilizzando questo operatore, sottrarre l'immagine verde dall'immagine blu. Per una maschera più restrittiva, sottrarre l'immagine verde dall'immagine rossa. Per le regioni casuali, sottrarre il canale blu dal canale verde.
  8. Soglie l'immagine risultante utilizzando l'algoritmo Moments . Nella maggior parte dei casi, questo non dovrebbe richiedere ulteriori aggiustamenti. Tuttavia, regolare se necessario. Questo produrrà un'immagine binaria.
  9. Una volta creata l'immagine binaria, riempite i fori selezionando Elabora > Binario > Riempi fori tra le fibre e arrotondate i contorni della maschera utilizzando un filtro mediano. Un filtro mediano di 10 è un buon punto di partenza, regolalo per adattarlo ai dati. Ispezionare manualmente la maschera per ottenere un accordo e rimuovere eventuali ROI errati.
  10. Una volta che la maschera è soddisfacente, create una selezione selezionando Modifica > Selezione > Crea selezione. Trasferisci questa selezione al ROI manager.

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Representative Results

L'installazione del MIW e la pianificazione sperimentale di base sono i primi passi in questo processo. Questo particolare design e protocollo MIW è più suscettibile agli studi longitudinali19 ed è stato utilizzato con successo sia con microscopi verticali che invertiti. In questo caso, è stato utilizzato un microscopio invertito in quanto ha portato a una maggiore stabilità dell'immagine della ghiandola mammaria con meno artefatti respiratori. Nella Figura 1A, forniamo le dimensioni del MIW rigido e una panoramica grafica del processo di impianto.

Un tipico campo visivo all'interno di un tumore mammario MMTV-PyMT39 senza etichetta (Figura 1B-E, Figura 3A) è molto eterogeneo, composto da fibre di collagene, numerose cellule stromali, masse di cellule tumorali e vascolarizzazione (Figura 3A). In generale, le fibre di collagene sono più abbondanti vicino alla finestra e diminuiscono in abbondanza più in profondità nel tumore (Figura 1B-E) L'organizzazione delle fibre che circondano le masse tumorali può anche essere piuttosto varia, spesso con regioni di organizzazione più casuale nello stesso campo visivo delle regioni di allineamento più elevato (Figura 2D, H e Figura 3I).

Per sviluppare una pipeline di analisi in grado di segmentare i dati intravitali in regioni perivascolari, tumore e stroma, questo protocollo si è concentrato sull'utilizzo del segnale da NAD(P)H e SHG endogeni. Mentre l'identificazione del tumore e dello stroma può essere semplice, l'identificazione delle regioni perivascolari all'interno del microambiente tumorale può essere difficile. La vascolarizzazione risiede spesso all'interno degli stretti nastri del segnale NAD(P)H ridotto tra le masse luminose delle cellule tumorali NAD(P)H+. È importante notare che non tutti i confini oscuri ospitano la vascolarizzazione; piuttosto, alcune regioni scure sono semplicemente pieghe tumorali o il buttting up di lobi tumorali adiacenti (freccia gialla, Figura 2G). Inoltre, mentre un occhio esperto può estrarre i vasi sanguigni di diametro maggiore dal tumore in quanto hanno un aspetto distintivo, questa distinzione non è sempre banale. Ciò è particolarmente vero per i vasi di diametro più piccolo in cui il loro aspetto può essere più sottile e variabile. In questo caso, l'uso della durata di fluorescenza di NAD(P)H può aiutare nell'identificazione positiva della vascolarizzazione (Figura 2B,F). La durata della fluorescenza (FLIM) non misura l'abbondanza o l'intensità dei fotoni in un luogo, ma il tempo necessario a quelle molecole eccitate per emettere un fotone e decadere al loro stato fondamentale. I globuli rossi (RBC) e il plasma sanguigno hanno dimostrato di avere una durata di fluorescenza caratteristicamente breve e distintiva32,37 che può essere sfruttata per l'identificazione e la segmentazione dei vasi nei tessuti.

Per determinare quanto bene la durata di fluorescenza di NAD(P)H identifica la vascolarizzazione per via intravitale, un bolo da 100 μL di un destrano marcato con rodamina è stato iniettato nella vena della coda dopo aver raccolto l'immagine FLIM. I confronti delle proiezioni di intensità massima di NAD(P)H FLIM rispecchiano da vicino quei vasi etichettati con un destrano marcato fluorescentemente (Figura 2I-J). La ripetizione di questo approccio in più topi ha dimostrato che l'area media della maschera dall'immagine FLIM sull'area della maschera destrana era del 78,6% ± del 12,3% (Figura 2L). Mentre la sovrapposizione non era al 100%, questa tecnica stava mappando accuratamente l'intera rete vascolare. Le differenze osservate nelle aree segnalate potrebbero spesso essere attribuite a problemi di deriva intravitale o di registrazione, diametri dei vasi più sottili dovuti al montaggio del modello o alla perdita di vasi fini a causa dell'esclusione dei globuli rossi a causa della pressione della massa crescente. È importante sottolineare che questa tecnica funziona ugualmente bene in presenza di fluorofori geneticamente codificati come GFP o modelli tumorali privi di etichetta (Figura 2D, H), fornendo così un mezzo molto robusto e ampiamente applicabile per identificare la vascolarizzazione per la segmentazione delle immagini.

Per delineare i confini delle masse tumorali prive di etichette, è stata utilizzata l'autofluorescenza NAD(P)H (Figura 1C). Questo può essere acquisito raccogliendo in modo indipendente un'immagine NAD(P)H o sommando i dati NAD(P)H FLIM per generare un'immagine di intensità. Entrambe le vie consentiranno un'adeguata segmentazione del microambiente tumorale. Come osservazione generale, l'eccitazione a due fotoni di NAD(P)H nelle cellule tumorali provoca un'autofluorescenza brillante producendo un'immagine che mostra singole cellule nitide con nuclei oscurati (Figura 2E,G). Questo modello può essere utilizzato per definire l'estensione della massa in crescita. Mentre una semplice soglia basata sull'intensità di NAD(P)H è possibile definire il confine del compartimento tumorale, uno strumento di segmentazione addestrabile spesso funziona meglio (Figura 3B,E). Alcune altre letture comuni, come la migrazione cellulare o l'analisi protrusiva cellulare, possono trarre beneficio dalla fluorescenza esogena geneticamente codificata all'interno del modello murino o dall'impianto di linee cellulari marcate fluorescentemente (Figura 2A). In questi casi, il compito di delimitare il confine della massa può essere realizzato con una semplice soglia della proteina fluorescente. A volte l'espressione del fluoroforo può diventare piuttosto eterogenea dopo l'impianto. Ciò non dovrebbe causare problemi di segmentazione. Inoltre, è stato spesso osservato che i tumori creati da alloinnesti fluorescenti o xenotrapianti hanno regioni meno compartimentate di fibre di collagene rispetto ai tumori creati da modelli tumorali genetici come MMTV-PyMT16.

Il compartimento stromale comprende le regioni al di fuori della massa crescente o tra le masse in crescita, e una maschera per lo stroma si ottiene invertendo il ROI del tumore (Figura 3B-F). Il compartimento stromale può quindi essere ulteriormente compartimentato in sub-ROI basati sull'architettura delle fibre di collagene. Le fibre di collagene sono una caratteristica significativa nello stroma e hanno una grande diversità di organizzazioni di fibre, che sono note per modulare il comportamento cellulare40,41. Spesso all'interno dell'immagine16 esistono numerose regioni locali (<100 μm) di fibre allineate o casuali. Pertanto, regioni di organizzazione della fibra relativamente allineata (tonalità rosse / blu) o casuale (tonalità verdi) (Figura 3I) sono state identificate con il plug-in OrientationJ. Utilizzando la mappa a colori di coerenza OrientationJ, è possibile creare maschere basate sull'organizzazione locale della fibra per scopi di segmentazione (Figura 3J). Queste maschere possono quindi essere sovrapposte per analizzare il comportamento differenziale dinamico delle cellule stromali (Figura 3K) a causa degli effetti di una specifica organizzazione delle fibre (Figura 3H,I).

Ora che sono stati definiti i ROI per i vari compartimenti del microambiente tumorale, possono essere applicati ai singoli fotogrammi o canali del film timelapse intravitale. A questo punto, è importante sottolineare che tutti i segnali mostrati in Figura 3A derivano interamente da sorgenti endogene. Questa immagine dimostra il ricco potenziale dei segnali spaziali e contestuali che possono provenire da fonti puramente endogene, onnipresenti e prive di etichette. Qui, abbiamo usato il modello di tumore MMTV-PyMT come esempio per illustrare l'applicabilità del metodo per quantificare il numero e le caratteristiche dei macrofagi all'interno di posizioni specifiche del microambiente tumorale (TME). Un precedente studio intravitale42 ha dimostrato che le cellule che emettono alti livelli di autofluorescenza FAD (Figura 3A, cellule magenta, frecce gialle) si colorano positivamente con anticorpi F4/80 e rappresentano una popolazione di macrofagi all'interno della TME. Utilizzando questo flusso di lavoro per segmentare l'immagine, è possibile esaminare in modo efficiente e accurato il numero, monitorare le interazioni cellula-cellula nel tempo o persino osservare le caratteristiche metaboliche di questo sottoinsieme di macrofagi (magenta) all'interno di diversi compartimenti della TME (Figura 3A, frecce gialle). Ad esempio, il comportamento dei macrofagi ad alto contenuto di FAD che risiedono specificamente all'interno del nido tumorale ad alto NAD(P)H può essere caratterizzato (Figura 3E). Allo stesso modo, i comportamenti dei macrofagi rispetto all'organizzazione locale delle fibre nella regione dello stroma possono essere esaminati. Alcuni rapporti recenti hanno indicato che i macrofagi e altre cellule migratorie nello stroma rispondono ai segnali meccanici dal loro microambiente locale 16,43,44. Utilizzando le maschere di allineamento delle fibre prodotte con questo metodo, è possibile esaminare i loro comportamenti differenziali tra regioni di organizzazioni di collagene casuali e allineate. Infine, questa stessa analisi mirata può essere applicata anche per determinare il numero e il comportamento dei macrofagi localizzati all'interno di una definita vicinanza alla vascolarizzazione. Nella Figura 3G, la vascolarizzazione può essere vista in rosso e i macrofagi possono ancora una volta essere visti in magenta. Una maschera per la vascolarizzazione utilizzando NAD(P)H FLIM è stata creata e poi espansa attraverso la dilatazione di 10 pixel. La distanza scelta è stata arbitraria a scopo dimostrativo ma può essere ottimizzata per le particolari esigenze del singolo esperimento. È importante sottolineare che, mentre questa immagine è di una singola z-slice, questa procedura potrebbe essere facilmente estrapolata a pile 3D per osservare il comportamento intorno all'intero volume della nave.

Figure 1
Figura 1: Abstract grafico dell'impianto della finestra mammaria e l'organizzazione sottostante di un tumore MMTV-PyMT. (A) Le dimensioni della finestra di imaging mammario e lo schema per il processo di impianto generale. (B-E) Questo è un montaggio da un rappresentante tumorale MMTV-PyMT non etichettato che parte da 50 μm sotto la superficie del MIW e continua fino a una profondità di 80 μm. I valori di profondità sono forniti sotto ogni immagine. Le fibre di collagene (grigio) sono più diffuse sulla superficie del tumore (NAD(P)H, blu) che a profondità maggiori. Barra della scala 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagine intravitale rappresentativa di un tumore PyMT marcato E privo di etichette GFP e convalida di NAD(P)H FLIM come marcatore per la vascolarizzazione. Un'immagine composita (A) di un tipico allotrapianto di cellule GFP-4T1 nel cuscinetto di grasso mammario e un tumore mammario rappresentativo da un modello tumorale MMTV-PyMT (E). NAD(P)H FLIM mappa la vascolarizzazione in entrambi i modelli (B,F). La fluorescenza GFP (C) e l'autofluorescenza NAD(P)H (G) sono state utilizzate per identificare il tumore. Il collagene è stato visualizzato da SHG (D, H). Un'immagine composita che utilizza NAD(P)H FLIM per identificare la vascolarizzazione è stata convalidata confrontando le proiezioni di intensità massima dello stack intravitale prima e dopo l'iniezione della vena di coda di destrano fluorescente (I,J,K). La quantificazione del rapporto tra l'area determinata da NAD(P)H FLIM sull'area identificata dall'iniezione di destrano in quattro topi (il colore identifica i singoli topi) e più campi visivi (singoli punti nel grafico) è mostrata in (L). Barre di scala 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Segmentazione rappresentativa delle immagini utilizzando la fluorescenza endogena all'interno del tumore PyMT privo di etichette. Un'immagine composita (A) di una singola z-slice da un tipico tumore mammario PyMT è stata raccolta utilizzando solo segnali intrinseci. SHG (grigio) visualizza le fibre di collagene del tumore. L'imaging a vita di fluorescenza dell'autofluorescenza NAD(P)H (Tau (τ) media) riporta le firme metaboliche delle cellule (tonalità da verde ad arancione) e la posizione dei vasi sanguigni (rosso). L'autofluorescenza FAD (magenta) identifica i macrofagi. Utilizzando lo schema di segmentazione delineato in questo protocollo, il tumore senza etichetta è stato segmentato in compartimenti per il nido tumorale (B, E), stroma (C, F) e vascolarizzazione (D, G) utilizzando solo l'autofluorescenza SHG e NAD (P) H. Le fibre di stroma e collagene (H) possono anche essere classificate in regioni locali di fibre allineate ((mostrate in magenta / blu), J, K). Barre di scala 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dati supplementari 1: Set di dati rappresentativo di Amontato 1% da NAD(P)H FLIM. Questa è una proiezione di intensità massima di un1% A montato da un tipico set di dati. È un rappresentante della qualità dell'identificazione possibile e un tipico livello di background prima di utilizzare il classificatore addestrabile. Fare clic qui per scaricare questo file.

Modello supplementare: Classificatore rappresentativo utilizzato su montato A1% per l'identificazione della vascolarizzazione. Questo è un modello di classificazione di esempio da utilizzare nel plug-in di segmentazione WEKA addestrabile all'interno di ImageJ. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

L'imaging intravitale 4D è un potente strumento per studiare le interazioni fisiologiche dinamiche all'interno del contesto spaziale e temporale del microambiente tumorale nativo. Questo manoscritto fornisce un quadro operativo molto semplice e adattabile per compartimentare le interazioni cellulari dinamiche all'interno della massa tumorale, dello stroma adiacente o in prossimità della rete vascolare utilizzando solo segnali endogeni dalla seconda generazione armonica o dall'autofluorescenza NAD(P)H. Questo protocollo fornisce un metodo completo e passo-passo dall'impianto della finestra di imaging all'acquisizione, analisi e segmentazione delle immagini. Riteniamo che questa tecnica contribuirà a un quadro di analisi necessario per segmentare e quantificare i dati intravitali 4D.

Questo protocollo è stato sviluppato per essere ampiamente compatibile con numerosi modelli murini intravitali, compresi i modelli PDX senza etichetta. I PDX sono un modello incredibilmente informativo45, ma rappresentano una sfida per l'imaging intravitale perché la natura del modello PDX non è adatta per la manipolazione genetica. Pertanto, sarebbe abbastanza vantaggioso avere un metodo in grado di visualizzare e compartimentare le interazioni dinamiche all'interno del loro ambiente fisiologico non etichettato utilizzando esclusivamente metaboliti endogeni come NAD(P)H e seconda generazione armonica (SHG). Oltre ad essere vantaggioso per i modelli PDX, questo approccio multidimensionale potrebbe essere teoricamente applicato a qualsiasi studio intravitale in tessuto canceroso o normale che necessita di un contesto spaziale e strutturale per affrontare una questione fisiologica. L'autofluorescenza NAD(P)H e l'SHG delle fibre di collagene sono onnipresenti in tutti i tessuti e rappresentano una risorsa universale e gratuita nelle collezioni intravitali. Questo approccio FLIM è anche robusto in quanto può identificare la vascolarizzazione in presenza di fluorescenza da fonti esogene come la GFP. Questo approccio è anche vantaggioso perché l'emissione di SHG e NAD(P)H può essere visualizzata nello spettro blu, risiedendo così in una lunghezza d'onda che non viene tipicamente utilizzata nell'imaging di costrutti di fusione fluorescente che potrebbero essere altrimenti necessari per lo studio.

L'aspetto di questo approccio che è nuovo e ha un particolare valore aggiunto è l'identificazione senza etichetta della vascolarizzazione. Mentre altri approcci possono funzionare, l'uso della durata di fluorescenza di NAD(P)H fornisce facilmente una firma chiara senza la necessità di ulteriori etichettature. I dati mostrano che i vasi definiti per tutta la vita rispecchiano la vascolarizzazione etichettata dall'iniezione della vena della coda di destrano fluorescente, il gold standard per l'imaging vascolare. La nostra tecnica eccelle nella visualizzazione di vasi sanguigni più piccoli rispetto alla semplice eccitazione a due o tre fotoni, in cui i vasi più grandi sono facilmente visualizzabili, ma quelli più piccoli richiedono più esperienza per identificare. La firma a vita è inequivocabile per tutte le navi, indipendentemente dalle dimensioni. Inoltre, questa ulteriore acquisizione di NAD(P)H FLIM può essere facilmente combinata con altri marcatori per la segmentazione del microambiente tumorale. Attraverso una singola acquisizione FLIM di NAD(P)H, i requisiti per definire la vascolarizzazione, il nido tumorale e lo stroma sono raggiungibili. La collezione FLIM può essere incorporata nel progetto sperimentale esistente raccogliendo una singola acquisizione alla fine o all'inizio di una serie temporale o intercalando le collezioni durante l'intera acquisizione 4D. La determinazione della quantità appropriata di immagini FLIM dipenderà da specifiche esigenze e vincoli sperimentali, come intervalli di acquisizione, durata sperimentale o stabilità dell'immagine, ma come minimo sarà necessaria una raccolta FLIM per serie 4D per questo metodo.

Questo processo di utilizzo di NAD(P)H FLIM per l'identificazione della vascolarizzazione richiede l'adattamento matematico dei dati FLIM a una funzione esponenziale della forma

Equation 1

con A1+A2+A3=1. Mentre la maggior parte delle immagini a vita di NAD(P)H riportate in letteratura sono montate come bi-esponenziali, in questa applicazione NAD(P)H è stato montato come un tri-esponenziale in cui τ1 e τ2 sono impostati sui valori riportati di RBC e τ3 è permesso di galleggiare. È importante sottolineare che l'obiettivo non è quello di raggiungere il lifetime value più accurato, ma piuttosto di fornire un'immagine ottimale per la segmentazione. Quando i valori τ1 e τ2 sono inizialmente fissati ai valori riportati di RBC32,46 e viene calcolata la matrice, i vasi sanguigni si distingueranno con valori A1% superiori al 60% nei vasi sanguigni e valori A1% generalmente inferiori al 40% nel tumore adiacente. Il prossimo passo è cercare di massimizzarel'A 1% nei vasi sanguigni riducendo al minimol'A 1% nel tumore adiacente. Questo è un processo iterativo e, alla fine, i valori Adell'1% dei vasi sanguigni saranno superiori al 90% con i valori Adell'1% del tumore inferiori al 10%. Una volta che i valori Adell'1% dei vasi sanguigni sono uniformemente alti e lo sfondo è uniformemente basso, esporta questi file A1% in uno strumento di segmentazione addestrabile. Ciò rimuoverà rapidamente qualsiasi rumore residuo e definirà il ROI per la vascolarizzazione.

Poiché il cuscinetto di grasso mammario si trova al di fuori della cavità corporea, l'intervento chirurgico è minimamente invasivo e i migliori risultati si ottengono impiantando il MIWsulla 4a ghiandola mammaria inguinale. I tempi di impianto della finestra e quando verrà condotto l'esperimento sono critici. È meglio consentire 24 - 48 ore di guarigione post-operatoria prima del timepoint fisiologico che verrà indagato. Mentre la procedura stessa richiede solo una piccola incisione (≈ 10 mm) per inserire la finestra (Figura 1A), il tempo di guarigione post-operatorio consentirà a qualsiasi infiammazione e fluidi accumulati a causa del processo di impianto di eliminare. Inoltre, permetterà anche al tumore di continuare a crescere nella finestra. Entrambi i fattori miglioreranno la qualità complessiva dell'immagine diminuendo l'opacità/dispersione e aumentando la stabilità dell'immagine. La prossima cosa da considerare è la durata totale pianificata dell'esperimento. Mentre queste finestre sono state progettate per studi longitudinali, la natura rigida della finestra comporta un limite di tempo di 2 o 3 settimane. Dopo quel lasso di tempo, la finestra ha la tendenza a staccarsi dallo strato dermico, contaminando e terminando così l'esperimento. Se non è richiesto uno studio longitudinale della ghiandola mammaria, altri metodi intravitali come una procedura terminale del lembo cutaneo22 che elimina l'impianto chirurgico di un MIW possono essere un'opzione migliore. La procedura del lembo cutaneo fornisce un migliore accesso all'intera ghiandola in quanto non è vincolata dal posizionamento e dalle dimensioni del MIW e può produrre una maggiore stabilità dell'immagine mentre la ghiandola viene allontanata dalla cavità corporea. Indipendentemente dall'approccio di imaging intravitale, la segmentazione del microambiente utilizzando la fluorescenza endogena è ancora ampiamente applicabile per la successiva analisi delle immagini. L'ultima cosa da considerare è la durata del singolo esperimento di imaging. Non è irragionevole acquisire film della durata di 6-8 ore. Tuttavia, durante le raccolte più lunghe, l'idratazione diventa un problema ed è necessario un attento monitoraggio della salute del topo.

Un vantaggio significativo di questo metodo è che le varie immagini di fluorescenza endogena necessarie per la segmentazione del microambiente tumorale possono essere raccolte con relativa facilità e senza ulteriori manipolazioni al topo. Con la combinazione filtro/dicroico qui riportata (Tabella dei materiali), sia le immagini SHG che NADH possono essere acquisite con lo stesso set di filtri commutando le lunghezze d'onda da 890 nm a 750 nm. Sebbene ciò crei un ritardo nell'acquisizione, non influisce sulla successiva segmentazione dell'immagine. È anche importante ricordare che questo metodo rappresenta un semplice punto di partenza per una tecnica di segmentazione che utilizza la fluorescenza endogena e configurazioni ottiche più avanzate possono consentire acquisizioni simultanee, se necessario.

Ci sono limitazioni nell'uso di FLIM per identificare la vascolarizzazione. L'approccio FLIM richiede elettronica, strumentazione e competenze specializzate da raccogliere. Tuttavia, tutti questi requisiti sono sempre più integrati nei microscopi moderni e più disponibili attraverso l'uso di strutture di imaging core. FLIM è diventata una tecnologia matura e l'acquisizione di buoni dati non richiede molta formazione. Una seconda limitazione è che le acquisizioni FLIM richiedono molto tempo. Mentre il frame rate per un'immagine raccolta con destrano fluorescente è di circa un secondo o meno, la raccolta media FLIM può variare da 60 s a 120 s, il che può essere proibitivo se i timepoint fisiologici sono più brevi di quello. L'identificazione FLIM della vascolarizzazione non è destinata a sostituire tutta la vena della coda iniettata con destrano fluorescente o l'eccitazione multifotonica della vascolarizzazione; piuttosto, è un altro approccio nella crescente cassetta degli attrezzi per l'imaging intravitale. Inoltre, prevediamo che i tempi di acquisizione più lunghi saranno resi notevolmente più brevi nei prossimi anni. I rivelatori e l'elettronica stanno rapidamente migliorando, diminuendo il tempo morto del rivelatore e richiedendo quindi periodi di acquisizione più brevi per catturare lo stesso numero di fotoni. Un altro motivo per essere ottimisti nei confronti di tempi di acquisizione più brevi è l'emergere di software di apprendimento automatico o algoritmo di ripristino delle immagini come CSBDeep47. Questi algoritmi potrebbero potenzialmente essere addestrati a lavorare con tempi di esposizione più brevi, riducendo così il numero di fotoni necessari per identificare con precisione le strutture a fini di segmentazione. Insieme, questo potrebbe ridurre rapidamente i tempi necessari per queste acquisizioni multidimensionali.

L'uso dell'imaging intravitale diventerà solo più importante quando i ricercatori cercheranno di svelare le molte complesse interazioni cellula-cellula e cellula-matrice che si verificano all'interno del microambiente fisiologico del tumore. Pertanto, sono necessari continui sviluppi nelle capacità di acquisizione, segmentazione e analisi. A tal fine, è importante non trascurare il potenziale della fluorescenza endogena per la segmentazione del microambiente. In questo protocollo, il segnale endogeno da SHG e metaboliti di fluorescenza, tra cui l'intensità NAD(P)H e FLIM, è stato utilizzato per scopi di segmentazione durante l'imaging intravitale della TME mammaria. Altri metaboliti endogeni o proprietà intrinseche possono fornire segnali aggiuntivi per rivelare la reciprocità dinamica delle cellule tumorali e del microambiente. Ad esempio, la FAD può essere utilizzata per monitorare il movimento delle popolazioni immunitarie42, la generazione 3P può evidenziare caratteristiche strutturali come le membrane plasmatiche o l'adiposo36 e la fluorescenza dell'elastina può essere utilizzata per separare le arterie dalle vene46. Pertanto, la fluorescenza endogena continuerà a fornire una ricca piattaforma multidimensionale che dovrebbe essere utilizzata al massimo mentre la comunità di ricerca continua a costruire la cassetta degli attrezzi per la segmentazione e l'analisi del microambiente intravitale.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano riconoscere le sovvenzioni NCI R01 CA216248, CA206458 e CA179556 per il finanziamento di questo lavoro. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Kevin Eliceiri e il suo gruppo di imaging per la loro esperienza tecnica nello sviluppo precoce del nostro programma intravitale. Ringraziamo anche il Dr. Ben Cox e altri membri dell'Eliceiri Fabrication Group presso il Morgridge Institute for Research per la loro progettazione tecnica essenziale durante le prime fasi del MIW. La dott.ssa Ellen Dobson ha assistito con conversazioni utili sullo strumento di segmentazione WEKA addestrabile ImageJ. Inoltre, vorremmo ringraziare la dott.ssa Melissa Skala e la dott.ssa Alexa Barres-Heaton per l'uso tempestivo del loro microscopio. Infine, vorremmo ringraziare la dott.ssa Brigitte Raabe, D.V.M, per tutte le discussioni premurose e i consigli sulla gestione e la cura del nostro mouse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 12mm round cover glass Warner Instruments # 64-0712 MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection BD 309659 Syringe
20x objective Zeiss 421452-988 Water immersion
27G needle for SQ injection Covidien 1188827012 Needle
40x objective Nikon MRD77410 Water immersion
5-0 silk braided suture Ethicon K870 Suture for MIW implantation
Artificial tears gel Akorn NDC 59399-162-35 Eye gel
Betadine solution, 5% Fisher Scientific NC1558063 Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator Fisher Scientific 23-400-101
Cyanoacrylate adhesive Loctite 1365882 MIW construction
fluorescent dextran Sigma T1287-50mg intravenous labelling of vasculature
forceps Mckesson.com Miltex #18-782 stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube Hamamatsu 
heating blanket CARA 72 heating pad  038056000729 Temperature selectable
heating chamber home built
Fluorescent lifetime handbook Becker and Hickl https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base Nikon
Isoflurane Akorn NDC 59399-106-01 Anesthesia
Liqui-Nox Fisher Scientific 16-000-125 MIW cleaning
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10 Analgesic
Micro Hose Scientific Commodities INC.  BB31695-PE/1
multiphoton scan head Bruker Ultima II Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter Chroma 284994 ET 440/80 m-2P
Nair CVS 339826 Depilatory cream
objective heater Tokai Hit STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter Chroma 320740 ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner Amazon.com B00814ME24 Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board Becker and Hickl
surgical light FAJ B06XV1VQVZ Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors Excelta 366 stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment Actavis Pharma NDC 0472-0179-34 Antibiotic
TV catheter Custom BD 30G needle: 305106 Catheter for TV injection
Two photon filter Chroma 320282 ET585/65m-2P
two-photon laser Coherent charmeleon Tunable multiphoton laser
ultrasound gel Parker PKR-03-02 Water immersion gel
Urea crystals Sigma U5128-5G Optional: FLIM IRF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  4. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120 (2020).
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Ricerca sul cancro numero 183
Un approccio di segmentazione senza etichette per l'imaging intravitale del microambiente del tumore mammario
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Burkel, B. M., Inman, D. R.,… More

Burkel, B. M., Inman, D. R., Virumbrales-Muñoz, M., Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (183), e63413, doi:10.3791/63413 (2022).

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