Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

גישת סגמנטציה ללא תווית להדמיה תוך-ורידית של מיקרו-סביבה של גידולי יונקים

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63413
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

Summary

שיטת ההדמיה התוך-ורידית המתוארת כאן משתמשת בדור ההרמוני השני של הקולגן ובפלואורסצנציה אנדוגנית מהקו-פקטור המטבולי NAD(P)H כדי לפלח באופן לא פולשני מיקרו-סביבה של גידול ללא תווית לתוך תאי גידול, סטרומל וכלי דם לצורך ניתוח מעמיק של תמונות תוך-ורידיות 4D.

Abstract

היכולת לדמיין אינטראקציות פיזיולוגיות מורכבות ודינמיות בין סוגי תאים רבים לבין המטריצה החוץ-תאית (ECM) בתוך מיקרו-סביבה של גידול חי היא צעד חשוב לקראת הבנת מנגנונים המווסתים את התקדמות הגידול. אמנם ניתן להשיג זאת באמצעות טכניקות הדמיה תוך-ורידיות עכשוויות, אך זה עדיין מאתגר בשל האופי ההטרוגני של הרקמות והצורך בהקשר מרחבי בתוך התצפית הניסיונית. לשם כך, פיתחנו תהליך הדמיה תוך-ורידי המשלב הדמיה של קולגן מהדור ההרמוני השני, פלואורסצנציה אנדוגנית מהקו-פקטור המטבולי NAD(P)H, ומיקרוסקופיית הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים (FLIM) כאמצעי למידור לא פולשני של המיקרו-סביבה של הגידול לתחומים בסיסיים של קן הגידול, הסטרומה או ה-ECM שמסביב, וכלי הדם. פרוטוקול לא פולשני זה מפרט את התהליך שלב אחר שלב, החל מרכישת תמונות בהילוך מהיר של מודלים של גידולי יונקים ועד לניתוח לאחר העיבוד ופילוח תמונות. היתרון העיקרי של זרימת עבודה זו הוא בכך שהיא מנצלת חתימות מטבוליות כדי להקשר את המיקרו-סביבה של הגידול החי המשתנה באופן דינמי ללא שימוש בתוויות פלואורסצנטיות אקסוגניות, מה שהופך אותה ליתרון עבור מודלים של קסנוגרפט (PDX) שמקורם במטופלים אנושיים ולשימוש קליני עתידי שבו פלואורופורים חיצוניים אינם ישימים בקלות.

Introduction

המטריצה החוץ-תאית (ECM) במיקרו-סביבה של הגידול ידועה כמי שהופקדה באופן דינמי ושופצה על ידי סוגי תאים מרובים כדי להקל עוד יותר על התקדמות המחלה 1,2,3. שינויי מטריצה אלה מספקים רמזים מכניים וביולוגיים המשנים את התנהגות התאים ולעתים קרובות גורמים למחזור מתמשך של שיפוץ מטריצה4. חקירת יחסי הגומלין הדינמיים וההדדיים בין תאי הגידול לבין המטריצה החוץ-תאית מתבצעת לעתים קרובות באמצעות תרבית מבחנה תלת-ממדית (תלת-ממדית) או מערכות מיקרופלואידיות. בעוד שגישות אלה מלמטה למעלה הדגימו מנגנונים של שיפוץ ECM 5,6,7, התפשטות מוגברת8, מעבר אפיתל למזנכימלי 9,10,11,12, והגירה ופלישה של תאי גידול 7,13,14,15,16 ההתמקדות שלהם הייתה בעיקר בכמה סוגי תאים (למשל, תאי גידול או פיברובלסטים) בתוך מטריצה תלת-ממדית הומוגנית בהשוואה למגוון ולהטרוגניות של אינטראקציות הקיימות בתוך רקמה פיזיולוגית., בנוסף למערכות in vitro, היסטולוגיה של גידולי ex vivo יכולה גם לספק כמה תובנות לגבי האינטראקציות האלה בין תאים לתאים ותאים-ECM17. לאימונוהיסטוכימיה יש יתרון בכך שהיא מסוגלת לנתח סוגי תאים מרובים ביחס להרכב ההטרוגני המרחבי ולארכיטקטורה של ה-ECM, אך נקודות הקצה הסטטיות של רקמות קבועות אינן לוכדות את האופי הדינמי של אינטראקציות בין תאים לבין המיקרו-סביבה. הדמיה תוך-ורידית פתחה את הדלת לחקור אינטראקציות מגוונות ודינמיות בהקשר הפיזיולוגי של המיקרו-סביבה הטבעית של הגידול.

היכולות של הדמיית גידולים תוך-ורידיים מתקדמות במהירות. שיפורים בתכנון חלונות הדמיה וטכניקות כירורגיות להשתלת החלונות אפשרו הדמיה ארוכת טווח של גידולים אורכיים במגוון מקומות אנטומיים (כלומר, גידול ראשוני, בלוטות לימפה, אתרים גרורתיים 18,19,20). יתר על כן, היכולת של מכשור אופטי להמחיש ולאסוף נתונים בממדים מרובים (כלומר, ספקטרלי, עוצמת פלואורסצנציה מרחבית ואורך חיים), וברזולוציה ובמהירות גבוהה (קצב וידאו) הופכת לנגישה באופן נרחב. הטכנולוגיה המשופרת מספקת הזדמנות לחקור שינויים מהירים באיתות תאי ובדינמיקה פנוטיפית בתוך סביבה פיזיולוגית. לבסוף, הרחבת הכלים האופטוגנטיים והמגוון הרחב של מבנים פלואורסצנטיים גנטיים מאפשרים תיוג של סוגי תאים ספציפיים כדי ללכוד את נדידת התאים במיקרו-סביבה של הגידול או במעקב אחר שושלת התאים במהלך ההתפתחות או התקדמות המחלה21,22. השימוש בכלים אלה בשילוב עם טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מספק לחוקרים את ההזדמנות ליצור מודלים ייחודיים של בעלי חיים בזמן.

בעוד שכל ההתקדמות הזו הופכת את ההדמיה התוך-לוויתנית לשיטה רבת עוצמה יותר ויותר לחקר אינטראקציות תאיות דינמיות ופיזיולוגיות, עדיין יש צורך חשוב לפתח אסטרטגיות המספקות הקשר מרחבי, זמני ומבנה ברמת הרקמה לאינטראקציות ביולוגיות אלה. נכון לעכשיו, מחקרי הדמיה תוך-ורידיים רבים מפצים על היעדר ציוני דרך חזותיים כגון כלי דם על ידי הזרקת צבעים פלואורסצנטיים לתוך כלי הדם או שימוש במודלים של עכברים המבטאים באופן אקסוגני חלבונים פלואורסצנטיים כדי להגדיר תכונות פיזיות. צבעים ומצעים הניתנים להזרקה כמו דקסטרנים פלואורסצנטיים נמצאים בשימוש נרחב כדי לתייג בהצלחה את כלי הדם באוספים תוך-ויטליים19, 23, 24. עם זאת, גישה זו אינה נטולת מגבלות. ראשית, היא דורשת מניפולציות נוספות בעכברים והתועלת שלה מוגבלת לניסויים קצרי טווח. עבור מחקרי אורך, דקסטרן פלואורסצנטי יכול להיות בעייתי כאשר אנו צופים בהצטברות של דקסטרן בתאים פאגוציטיים או דיפוזיה לתוך הרקמה הסובבת לאורך זמן25. שילוב חלבון פלואורסצנטי אקסוגני במודל העכבר הוצג כחלופה לדקסטרנים פלואורסצנטיים, אך מציג מגבלות משלו. הזמינות והמגוון של פלואורופורים אקסוגניים בתוך דגמי עכברים עדיין מוגבלים ויקרים ליצירה. בנוסף, במודלים ספציפיים, כגון מודלים של PDX, מניפולציות גנטיות אינן רצויות או אפשריות. כמו כן, הוכח כי נוכחותם של חלבונים פלואורסצנטיים או ביולומינסצנטיים בתוך התאים מוכרת כזרה בתוך העכבר, ובתוך מודלים של עכברים מדוכאי חיסון, הדבר מפחית את כמות הגרורות עקב התגובה של מערכת החיסון המארחת26,27. לבסוף, חלבונים פלואורסצנטיים אקסוגניים או צבעים פלואורסצנטיים המשמשים להקשר מרחבי או לפלח נתונים מאוחרים יותר תופסים לעתים קרובות טווחים ראשוניים של ספקטרום האור, שאחרת ניתן היה להשתמש בהם כדי לחקור את האינטראקציות הפיזיולוגיות המעניינות.

השימוש באות הפנימי מה-ECM או פלואורסצנציה אנדוגנית מתאים בתוך הרקמה מייצג אמצעי אוניברסלי פוטנציאלי ללא תוויות לפלח נתונים תוך-תאיים לצורך ניתוח תאי ומרחבי מעמיק יותר. הדור ההרמוני השני (SHG) שימש זה מכבר להדמיית ה-ECM28. עם התפתחותם של כלים חשובים שיסייעו באפיון ארגון הסיבים 29,30,31, ניתן לאפיין את התנהגות התא ביחס למבנה ECM המקומי. בנוסף, אוטופלואורסצנציה מהמטבוליט האנדוגני, NAD(P)H, מספקת כלי נוסף ללא תווית למידור המיקרו-סביבה של הגידול in vivo. NAD(P)H פלואורסצנטי בבהירות בתאי הגידול וניתן להשתמש בו כדי להבחין בין גבולות קן הגידול הגדל לבין הסטרומה הסובבת אותו21,32. לבסוף, כלי הדם הוא מבנה פיזיולוגי חשוב במיקרו-סביבה של הגידול ובאתר של אינטראקציות מפתח ספציפיות לסוג התא 33,34,35. עירור של תאי דם אדומים (RBC) או פלזמת דם שימש כדי לדמיין את כלי הדם של הגידול, ובאמצעות עירור של שניים או שלושה פוטונים (2P; 3P) מדידת קצב זרימת הדם הוכחה כאפשרית36. עם זאת, בעוד שכלי דם גדולים יותר ניתנים לזיהוי בקלות על ידי חתימות הפלואורסצנטיות האנדוגניות שלהם, זיהוי של כלי דם קטנים עדינים, משתנים ופחות פלואורסצנטיים דורש מומחיות רבה יותר. קשיים מובנים אלה מעכבים פילוח תמונה אופטימלי. למרבה המזל, ניתן למדוד את המקורות הללו של פלואורסצנציה אנדוגנית (כלומר, תאי דם אדומים ופלסמה בדם) גם על ידי הדמיה פלואורסצנטיתלכל החיים 37, המנצלת את התכונות הפוטופיזיות הייחודיות של כלי הדם ומייצגת תוספת שימושית לארגז הכלים התוך-ורידי ההולך וגדל.

בפרוטוקול זה מתוארת זרימת עבודה לסגמנטציה של הדמיה תוך-לוויטלית ארבע-ממדית (4D) המשתמשת במפורש באותות פנימיים כמו פלואורסצנציה אנדוגנית ו-SHG מרכישה ועד ניתוח. פרוטוקול זה רלוונטי במיוחד למחקרי אורך דרך חלון הדמיה של יונקים שבו פלואורסצנציה אקסוגנית עשויה להיות לא מעשית או אפשרית, כמו במקרה של מודלים של PDX. עם זאת, עקרונות הסגמנטציה המתוארים כאן ישימים באופן נרחב למשתמשים תוך-ורידיים החוקרים ביולוגיה של גידולים, התפתחות רקמות או אפילו פיזיולוגיה של רקמות תקינה. החבילה המדווחת של גישות הניתוח תאפשר למשתמשים להבדיל התנהגות תאית בין אזורים של תצורות סיבי קולגן מיושרות או אקראיות, להשוות מספרים או התנהגויות של תאים השוכנים באזורים ספציפיים של המיקרו-סביבה של הגידול, ולמפות את כלי הדם למיקרו-סביבה של הגידול באמצעות אות נטול תוויות או פנימי בלבד. יחד, שיטות אלה יוצרות מסגרת תפעולית למקסום עומק המידע המתקבל מהדמיה תוך-ורידית 4D של בלוטת החלב תוך מזעור הצורך בתוויות אקסוגניות נוספות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים שתוארו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון. הרווחה וניהול הכאב בכל הניסויים בבעלי חיים הם בעלי חשיבות עליונה. לפיכך, נעשה כל מאמץ כדי לוודא שבעל החיים נוח ומטופל היטב בכל שלב של ההליך.

1. יצירת חלון הדמיה של יונקים (MIW)

  1. כדי לבנות את חלון ההדמיה של החלב, יצרו טבעת 14 מ"מ מפלדת אל-חלד כירורגית.
  2. נקו את מסגרת החלון הממוחשבת באמצעות תמיסה חמה של 5% חומר ניקוי, שטפו במשך 10 דקות תחת מים זורמים (DI), השרו ב-100% אתנול למשך 10 דקות, ולאחר מכן ייבשו מתחת למנורת חום. יש לאחסן באופן אוטומטי את מסגרת ה-MIW המיובשת ולאחסן אותה לשימוש מאוחר יותר.
  3. הכן זכוכית כיסוי MIW כדלקמן: השרו את זכוכית הכיסוי העגולה #1.5 12 מ"מ ב-100% אתנול למשך 10 דקות, יבשו מתחת למנורת חום, ולאחר מכן הקפידו על מסגרת MIW המתכתית באמצעות דבק ציאנואקרילט. לרפא את הדבק למשך הלילה.
  4. נקו את ה-MIW המורכב מעודף דבק באמצעות ספוגית אצטון, ונקו על ידי טבילתו ב-70% אתנול למשך 10 דקות. אפשרו לחלון המנוקה להתייבש. הכינו את ה-MIW מראש ואחסנו אותו בצלחת פטרי סטרילית לפני ההשתלה הניתוחית.

2. השתלה כירורגית של ה-MIW

  1. כלים כירורגיים של Autoclave וחיטוי משטחים עם 70% אתנול לפני תחילת הניתוח להשתלת החלון.
  2. בצע ניתוח על שולחן מחוטא באמצעות שמיכת חימום מכוסה בשדה סטרילי. הגדר את שמיכת החימום כך שהטמפרטורה הנמדדת על גבי השדה הסטרילי היא 40 מעלות צלזיוס.
  3. השתמשו בתאורת עזר קרה כדי למנוע ייבוש רקמות. השתמש במשקפיים מגדילים כדי להקל על ההליך הכירורגי. לבשו PPE המורכב ממעיל מעבדה סטרילי וחד-פעמי, שרוולים כירורגיים, כפפות, הגנה על העיניים ומסכת פנים, כפי שהומלץ על ידי שיטות העבודה המומלצות הכירורגיות.
  4. הרדמה את העכבר באמצעות מכונת אידוי הרדמה עם הגדרת איזופלורן של 2.0% וקצב זרימת חמצן של 2.0 ליטר לדקה. נהלו משכך כאבים (10 מ"ג/ק"ג מלוקסיקם) בהזרקה תת עורית.
    הערה: ספקו מינונים נוספים בתוך 24 השעות הראשונות, רצוי כל 8-12 שעות ביומיים הראשונים לאחר הניתוח.
  5. לאחר ההרדמה (אושרה על ידי אי תגובה לצביטת הבוהן), יש למרוח ג'ל לחות לעיניים כדי למנוע ייבוש של העיניים. השתמשו בקרם דפילטורי להסרת פרווה באתר הניתוח (בלוטת היונק המפשעההרביעית ) ולאחר מכן השטיפה עם גזה סטרילית ספוגת מים.
  6. הכינו את האתר הכירורגי המדולדל לניתוח על ידי חיטוי משטח העור עם 3 קרצופי בטאדין ואתנול מתחלפים.
  7. כדי להתחיל את הניתוח, להרים בעדינות את העור מעל בלוטת החלב 4 מספר 4 באמצעות מלקחיים. לאחר הסרת העור מדופן הגוף, יש להסיר חלק של כ-1 מ"מ של השכבה העורית בקצה המלקחיים באמצעות מיקרו-מספריים כירורגיים. אם מתרחש דימום, להפעיל לחץ עדין עם גזה סטרילית עד הדימום מפסיק.
    הערה: באופן כללי, לגידולים גדולים יותר יש פוטנציאל גדול יותר לדמם מאשר גידולים קטנים יותר או רקמות נורמליות.
  8. נתקו את בלוטת החלב משכבת העור בתנועות עדינות של המלקחיים בפתח הניתוח כדי להימנע מחיתוך הבלוטה שמתחת.
  9. צור חתך של 10 מ"מ ושחרר את בלוטת החלב משכבת העור בפריפריה, כך שניתן יהיה למקם תפרים מבלי לחדור לבלוטת החלב. הוסיפו PBS כדי לכסות את הבלוטה/הגידול שנחשף ולמנוע ייבוש.
  10. צור תפר מיתר ארנק לאורך שולי הפתח באמצעות תפר קלוע משי 5-0. הכנס קצה של ה- MIW כך ששכבת העור תתחבר לחריץ המקבל של ה- MIW.
  11. מתחו בעדינות את האפיתל בצד הנגדי של ה-MIW ודחפו את ה-MIW המתכתי למקומו כך שהשכבה העורית תפעיל באופן מלא את החריץ המקבל סביב כל היקף ה-MIW. כיווץ את מיתר הארנק בחוזקה כדי למשוך את השכבה העורית לתוך החריץ ולקשור אותה כדי לאבטח את ה-MIW באופן מלא.
  12. הוסיפו אנטיביוטיקה מקומית לשכבת העור ב-MIW, ועקבו באופן רציף אחר העכבר עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על התאוששות החזה. אחסנו את העכבר המושתל ב-MIW בנפרד על מצעים רכים עם איגלו שמונח בכלוב, ואפשרו לעכבר להתאושש במשך 48 שעות לפני ההדמיה.

3. מיקום ושמירה על העכבר על במת המיקרוסקופ להדמיה

  1. הגדר את תא החימום על במת המיקרוסקופ. השתמש במערכת אוויר כפוי המוגדרת ל-30 °C (30 °F) או כל מערכת דומה אחרת. השתמש במחמם אובייקטיבי כדי למנוע סחף במיקוד z. אפשרו למערכת להגיע לשיווי משקל של לפחות שעה אחת לפני ההדמיה.
    הערה: עכברים מורדמים אינם מסוגלים לשמור כראוי על טמפרטורת הגוף שלהם, ולכן, יש צורך בסביבה מחוממת עבור כל רכישות קיטועי זמן . תנור החימום האובייקטיבי מסייע להילחם בהשפעות ההתפשטות התרמית, תופעה הגורמת לסחף בפוקוס z כאשר העדשה האובייקטיבית והרקמה המצולמת מגיעות לשיווי משקל תרמי.
  2. לאחר שתא החימום במיקרוסקופ התייצב על 30 מעלות צלזיוס, הרדימו את העכבר המקבל עם הגדרות מכונת הרדמה של 2% איזופלורן וקצב זרימת חמצן של 2 ליטר לדקה.
  3. לאחר שהעכבר מורדם (מאושר על ידי אי תגובה לצביטת הבוהן), נקו את החלק החיצוני של זכוכית MIW עם אפליקטור כותנה ומנקה זכוכית, הוסיפו משחה לעיניים למניעת ייבוש, והכניסו קטטר וריד זנב במידת הצורך.
  4. כדי לשמור על הידרציה נכונה, תן זריקה ראשונית של 0.5 מ"ל PBS תת עורית או 100 μL דרך צנתר וריד הזנב. חזור על הפעולה כל 2 שעות למשך הפעלת ההדמיה.
  5. לאחר שהעכבר הוכן כראוי, הגדר את המיקרוסקופ להדמיה. כדי להפחית את האידוי במהלך מדידות של קיטועי זמן, השתמשו בג'ל על בסיס מים במקום במים למדיית הטבילה. זה צריך להיעשות לפני הצבת העכבר על הבמה. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על הרכיבים האופטיים.
  6. הניחו את העכבר על במת המיקרוסקופ, התאימו את צינור האיזופלורן ולחצו על צווארון ה-MIW לתוך חור קבלה של 14 מ"מ בתוסף הבמה כדי לייצב את התמונות. הביאו את שדה ההדמיה לפוקוס באמצעות עיני המיקרוסקופ והשתמשו בהארת שדה בהיר כדי לצפות בכלי הדם עם זרימת הדם.
  7. בדוק את יציבות שדה הראייה. אם קיימים ממצאי תנועת נשימה, יש למרוח דחיסה עדינה על החלק האחורי של הבלוטה עם גוש קצף קטן ופיסת סרט דבק דמוית סיכה. לאחר הפעלת הדחיסה, ודא שזרימת הדם נשמרת בכל שדה הראייה.
  8. התאם מעת לעת את רמות האיזופלורן במרווחים של 0.25% במהלך סשן ההדמיה כדי לשמור על רמה נכונה של הרגעה על ידי ספירה ידנית של הנשימה של בעלי חיים.
  9. שמרו על קצב של 36-40 נשימות לדקה (סל"ד) כדי לשפר את תוחלת החיים ואת ההדמיה האופטית. קצבי נשימה נמוכים יותר יכולים לגרום לכך שהעכבר לא ישרוד את הניסוי, בעוד שקצבי נשימה מעל 60 סל"ד עלולים לגרום להרגעה לקויה, מה שעלול להגביר את הנשימה ואת תוצרי התנועה בנתוני התמונה.

4. הוקם עבור הדמיה תוך-ורידית דו-ממדית, מבוססת עוצמה ונטולת תוויות של התנהגות תאים דינמית

  1. לאחר שהעכבר מורדם וממוקם בבטחה על שלב המיקרוסקופ ההפוך, התחל לאתר אזורי עניין.
  2. באמצעות מקור אור המכוון ל-MIW, השתמשו בעיניים של המיקרוסקופ כדי לזהות אזורים פוטנציאליים לחקירה. הוסף ושמור את מיקומי x, y בתוכנה כדי לחזור למיקומים אלה.
    הערה: הפרטים הקטנים של הגידול לא יהיו גלויים בקלות עם סוג זה של תאורה. המטרה היא פשוט לזהות אזורים להמשך חקירה. ההתמקדות היא בראיית כלי הדם וזרימת הדם.
  3. לאחר שנשמרו מספר מיקומים בתוכנה, הצג בתצוגה מקדימה את שדות התצוגה שנבחרו באמצעות עירור של 890 ננומטר וקוביית המסנן FAD/SHG. השתמש בזמן שהייה מרבי של 4 μs עם הספק נמוך יותר והגדרת PMT גבוהה. המטרה היא להציג תצוגה מקדימה של שדות הראייה מבלי לחשוף יתר על המידה את הרקמה לאור לייזר מוגזם.
  4. לאחר שהוגדרו רמות הספק מתאימות, הגדר את ערימות z. שימו לב למראה של סיבי קולגן שופעים (SHG) בטמפרטורה של 20-50 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הזכוכית של MIW. קולגן יהפוך לנפוץ פחות ככל שהמיקרוסקופ ישקע עמוק יותר לתוך הגידול (איור 1B). חללים ב- SHG חושפים את מיקומם של מסות הגידול.
  5. הגדר את פרוסת z העליונה, מתחת לשכבת התאים הבודדים שבה סיבי הקולגן הראשונים מופיעים על ~ 50-100 מיקרומטר. הגדר את פרוסת z התחתונה על ~ 250 מיקרומטר, שם הסיבים דוהים החוצה והאות הלקוי שולט. חזור על פעולה זו עבור כל מיקומי x-y שנשמרו.
  6. לאחר הגדרת טווח z-stack, הגדל את זמן השהייה (עד 8 μs) ובצע אופטימיזציה של הגדרות החשמל והגלאי. מטב את רמות ההספק לפי הצורך כדי להלהיב את הרקמה עבור כל ניסוי. שימוש בהספקים של עד 90 mW ב- 750 ננומטר או 70 mW ב- 890 ננומטר בפתח האחורי של המטרה הם בטווח מקובל.
    הערה: עומק ההדמיה, כמות הפיזור בתוך הרקמה, המאפיינים האובייקטיביים ורגישות הגלאי ישפיעו כולם באופן משמעותי על כמות הכוח הדרושה לקבלת תמונה.
  7. התאם את מרווחי הזמן בהתאם למטרות הניסוי. התחילו במרווחים של 10 דקות בין נקודות איסוף עבור רוב סרטי ההעברה התוך-לוויראליים.
  8. אף על פי שעירור 2P עדין על תאים ורקמות, היו מודעים לסימנים של פוטוטוקסיות, כמו הלבנת תאים או הגדלה מהירה של האוטו-פלואורסצנציה, והלבנת פוטו-אקונומיקה מוגזמת. הפחת את עוצמת הלייזר או הגדל את מרווחי הזמן כפי שהתנאים מציינים.

5. הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים (FLIM) של NAD(P)H

  1. תוך שמירה על מיקומי ה-x-y מרכישות טווחי הזמן, הגדירו את המיקרוסקופ לאיסוף ערימת FLIM. הכנס מסנן 440/80 למחזיק מסנן מול גלאי GaAsP, והגדר את מתח גלאי GaAsP ל-800 בתוכנה. כבה את אורות החדר כאשר הגלאים דולקים.
  2. בתוכנה, עברו מהדמיית עוצמה מבוססת גלוונומטר למצב הדמיית FLIM.
  3. לצורך זיהוי ומיסוך כלי הדם, הגדר את הרזולוציה ל- 512 x 512 פיקסלים. לאיסוף מידע מטבולי משלים, הגדר את הרזולוציה ל- 256 x 256 פיקסלים כדי להגדיל את הרזולוציה הזמנית של חתימת החיים. הגדר את זמן השהייה ל- 4 μs וכוונן את הלייזר ל- 750 ננומטר.
  4. התחל בסריקת תצוגה מקדימה והתחל לכוונן את עוצמת הלייזר. התאם את עוצמת הלייזר עד שהקריאה עבור מפלה השברים הקבוע (CFD) תהיה בין 1 x 105 ל- 1 x 106. אין לחרוג מ-1 x 106 מכיוון שהדבר יגרום לערימת פוטונים ולתוצאות כלליות גרועות.
  5. לאחר הגדרת רמת ההספק, הגדר את זמן האינטגרציה בין 90 שניות ל- 120 שניות והתחל את אוסף FLIM. הוא ירכוש פוטונים משדה הראייה למשך הזמן המוקצב.
  6. אופציונלי: לאחר שכל האוספים הדרושים נעשו והעכבר הוסר מהבמה, אסוף פונקציית תגובה למכשיר (IRF). מדוד את ה- IRF על ידי הדמיית פני השטח של גבישי אוריאה הזמינים באופן מסחרי בצלחת תחתית זכוכית עם אותם פרמטרים והגדרה המשמשת להדמיית הרקמה.
    הערה: ה- IRF לוקח בחשבון עיכובים או השתקפויות כלשהם עקב ההתקנה האלקטרונית או האופטית. ה-IRF מעורב בכל רכישות ה-FLIM, וביטולו מהנתונים יכול לשפר את הדיוק של עקומות דעיכה פלואורסצנטיות מחושבות. עם זאת, ה-IRFs המחושבים יכולים לעתים קרובות לשכפל באופן סביר את איכות עקומות הדעיכה הפלואורסצנטיות מ-IRF שנמדדו. מומלץ למדוד את ה-IRF עד שייקבע כי ה-IRF המחושב יניב התאמות שוות ערך של עקומות הדעיכה ויעריך כראוי את התוצאות מה-IRF הנמדד.

6. ניתוח תמונות של NADH לכל החיים

  1. פתח את תוכנת FLIM ויבא את תמונת החיים של NAD(P)H ממערך הנתונים. לקבלת פרטים נוספים על אופן השימוש הנכון בתוכנה, עיין בספרי ההדרכה לכל החיים הפלואורסצנטיים (ראה טבלת חומרים).
  2. כדי להתחיל, הגדר את פרמטרי המודל בתוכנה. בשורת התפריטים, לחץ על אפשרויות > דגם. בחר את התיבות הבאות: הגדרות > דעיכה מרובת אקספוננציאליים, שיטת התאמה > MLE, ריבוע > של Binning מרחבי, שיא > סף וסמן את תיקון Shift לפני חישוב התמונה.
  3. בשורת התפריטים, לחץ על צבע > A1% מהתפריט הנפתח. בצד ימין של החלון, הגדר אותו כהתאמה של שלושה רכיבים. הגדר את גודל הפח > 3.
  4. התאם את > הסף ~ 10. הערך מחדש את דיוק הסף לאחר שמטריצת הדעיכה חושבה בפעם הראשונה.
  5. תקן את τ1 עד 200 ps. זה מייצג את אורך החיים הקצר של תאי הדם האדומים. נסו למצוא את הערך המתאים ביותר למספר כתמים בכלי הדם הגדול יותר, אותם ניתן לראות בתמונת העוצמה. תקן את τ2 עד 1200 ps. זה מייצג את אורך החיים הארוך של תאי הדם האדומים.
    הערה: הערכים המוגדרים הם רק נקודת ההתחלה. הערכים יצטרכו להיות מותאמים כדי להוציא את כלי הדם יותר. ברוב המקרים, אך לא תמיד, ערכים אלה יפחתו.
  6. תחת חישוב בשורת התפריטים, בחר מטריצת דעיכה. פעולה זו תיצור תמונות ראשוניות של A1% לכל החיים כאשר לכלי הדם יש ערכים גבוהים. השתמש בסמן (הכוונת) כדי לרחף מעל כלי הדם. באופן שיטתי ואחד בכל פעם, צף (בטל את סימון תיבת התיקון ) את τ1 ו- τ2. רשום ערכים אלה מכיוון שהם יעזרו למטב את הפרמטרים הקבועים.
    הערה: המטרה היא לא בהכרח לקבל את הערכים המדויקים ביותר בתמונה, אלא למקסם את הפער בין כלי הדם לרקמה מבלי להקטין באופן דרמטי את האזור שזוהה כ-vasculature.
  7. לאחר שזוהו הפרמטרים המתאימים עבור τ1 ו- τ2, בשורת התפריטים בחר חשב > עיבוד אצווה. ודא שרוב ההגדרות דומות בין z-slices.
  8. הקפידו לוודא שאין הגדרה אחת שונה בתכלית מהאחרות. אם כן, התאם תחילה את המשמרת ונסה שוב. אם הבעיה נמשכת, התאמה מחדש באמצעות פרמטרים חדשים. תזוזה שגויה יכולה להיות גורם גדול לרעש בהתקפים ויכולה להגדיל אתערכי A 1% באזורי הגידול הסמוכים.
  9. בכרטיסייה תפריט, שמור את הקבצים ולאחר מכן ייצא קבצים A1%. העלה קבצים אלה ב- ImageJ לצורך מיסוך ופילוח.

7. פילוח תמונה של כלי הדם

  1. פתח את ImageJ ויבא את התמונה A1% כתמונת טקסט. חזור על פעולה זו עבור כל התמונות בתוך הערימה.
  2. עם כל התמונות של A1% פתוחות, בחר תמונה > Stack > Z-Project. השתמש בהקרנת העוצמה המרבית ושמור את התמונות. ראה נתונים משלימים 1 לקבלת תמונה מייצגת.
  3. עבור אל תוספים > סגמנטציה. בחר את תוסף הסגמנטציה של WEKAהניתן לאימון 38.
  4. לאחר פתיחת חלון WEKA, השתמש בהגדרות ברירת המחדל והתחל לאמן את התוכנה על ידי יצירת שתי מחלקות וקווי מעקב מעל כלי הדם (אזורים גבוהים של A1% ) ואזורים שאינם כלי דם (אזורים נמוכים שלA 1%).
  5. המשך להוסיף עקבות חדשים לשתי המחלקות עד שהתוכנה תזהה באופן עקבי את אזורי Aהגבוהים של 1% של כלי הדם תוך ביטול אזורים גבוהים יותר של רעשי רקע. ראה מודל משלים עבור מודל מסווג מייצג.
  6. לאחר הפקת התמונה המסווגת, לחץ על תמונה > הקלד > 8 סיביות. סף את התמונה וצור מסיכה. אם עדיין יש צורך לנקות עוד יותר את תמונת הסף, השתמש בפונקציה Analyze Particles .
  7. התאם את הגודל והעגוליות עד שלא ייכללו אזורים קטנים ועגולים יותר של תמונת הסף. מתקבלת מסכה נקייה עם כלי הדם בלבד ומעט מאוד רקע.
  8. לחץ על ערוך > בחירה > צור בחירה. העבר את הבחירה למנהל ההחזר על ההשקעה על-ידי לחיצה על ניתוח כלי > > מנהל ההחזר על ההשקעה.
  9. שכפל את התמונה המסווגת. המשך לעבד > בינארי. כדי להרחיב את המסכה ולהגדיר את המרחק מהכלוב שייכלל בפילוח התמונה, בחר הרחבה. חזרו על הפעולה עד שהמסיכה התרחבה לטווח הרצוי. הקלט אזור עניין זה (ROI) במנהל ההחזר על ההשקעה.
    הערה: המטרה של שלב זה היא לכמת את הכמות או ההתנהגות בתוך קרבה מסוימת של כלי הדם (לדוגמה, מספר התאים הקיימים בתוך X μm של כלי הדם). כמות ההתרחבות הנדרשת נקבעת כולה על ידי השאלה המדעית.
  10. כדי לכמת את מספר התאים באזורים המגבילים, בחר את החלון (תמונה/ערוץ) המעניין. זה יכול להיות כל חלון שחולק את אותו שדה ראייה כמו מסכת כלי הדם. החל את שני החזרי ההשקעה באמצעות הפונקציה XOR מהתפריט הנפתח.
    הערה: פעולה זו תמדוד את הפריטים במרחק הרצוי ממאגר כלי הדם, למעט כלי הדם עצמו. לאחר מכן ניתן להשתמש בגישת ROI משולבת זו כדי למדוד מספר רב של פרמטרים, כגון עוצמה, מספר תא או העברה.

8. פילוח תמונה של קן הגידול

  1. פתח את תמונת NADH מסריקה בעוצמה גבוהה או מאוסף FLIM ברזולוציה גבוהה ב- ImageJ.
    הערה: ניתן לעשות זאת על פרוסות z בודדות, ערימות מלאות, או להחיל על הקרנות z של כמה פרוסות.
  2. עבור אל תוספים > סגמנטציה. בחר את תוסף הפילוח של WEKA הניתן לאימון.
  3. לאחר פתיחת חלון WEKA, השתמש בהגדרות ברירת המחדל והתחל לאמן את התוכנה לשתי מחלקות של אזורים גבוהים של NADH ואזורים נמוכים של NADH. באזורים הגבוהים של NADH תהיה תבנית מאוד ברורה של תאים עם גרעינים והתוכנה תזהה אותה בקלות.
  4. ממשיכים לעבור הלוך ושוב עם שכבת העל כדי לחדד את האלגוריתם עם הכשרה נוספת עד שהוא מזהה את כל אזורי הגידול כפי שנקבעו על ידי העין והידע המוקדם של המורפולוגיה של הגידול. זהו תהליך איטרטיבי.
  5. לאחר שהאלגוריתם מזהה את כל האזורים של הגידול, בחר בלחצן צור תוצאה . זה יפיק תמונה חדשה. שכפל תמונה זו.
  6. בחר את התמונה המשוכפלת הראשונה והמרה אותה לתמונה של 8 סיביות על-ידי בחירה באפשרות 'סוג > תמונה' > 8 סיביות. סף תמונה זו כדי ליצור מסיכה בינארית. לאחר מכן צור בחירה והעבר אותה למנהל ההחזר על ההשקעה. ROIs אלה יגדירו את הסטרומה.
  7. בחר את השנייה של התמונה המשוכפלת והמר אותה לתמונה של 8 סיביות. הפוך תמונה זו על-ידי בחירת תמונה > ערוך > Invert ולאחר מכן סף תמונה זו כדי ליצור מסיכה בינארית. שוב ליצור בחירה ולהעביר אותה למנהל ההחזר על ההשקעה. החזר השקעה זה יגדיר את קן הגידול.

9. פילוח תמונה לפי ארגון סיבים או יישור

  1. כדי להתחיל, פתח את תמונות SHG, הכן כל הקרנה z והערך את הצורך בכל עיבוד מקדים. לקבלת תוצאות טובות, נדרשות תמונות באיכות גבוהה עם סיבים הניתנים להבחנה ורעש נמוך.
  2. אופציונלי: לעיבוד מקדים ב- ImageJ כדי להגביר את האות לרעש (SNR) של ערוץ SHG, הפחת את הרקע באמצעות חיסור כדור מתגלגל. עבור רוב היישומים, השתמש בחיסור כדור מתגלגל בין 20 פיקסלים ל-50 פיקסלים. לאחר מכן החליקו את התמונה ושמרו אותה.
  3. פתח את התוסף OrientationJ והגדר את פרמטרי העיבוד. בחלון DirectionJ, הגדר את גודל חלון הטנזור המקומי. לקבלת תמונה של פי 20 מצפיפות סיבים זו, הגדר 10 פיקסלים עד 15 פיקסלים כנקודת התחלה.
  4. בחר קו מעוקב Spline כמודל מעבר הצבע וסמן את תיבת סקר הצבעים. הגדר את סקר הצבעים. הגדר גם את הגוון וגם את הרוויה כקוהרנטיות, ולאחר מכן הגדר את הבהירות כתמונה מקורית, לחץ על Run.
  5. קובץ הפלט של התוסף הוא מפת צבעים RGB. התאם את הערך של חלון הטנזור המקומי עד שאזורים מיושרים, כפי שנקבע על ידי העין, מודגשים כראוי בגווני כחול ומג'נטה.
  6. לאחר שתמונת הפלט משביעת רצון, הפרד תמונת RGB זו לשלושה ערוצים. בחר תמונה > צבע > ערוץ מפוצל.
  7. כדי לשפר את המראה של אזורים מיושרים לצורך מיסוך, השתמש במחשבון התמונה על-ידי בחירה במחשבון תמונה > תהליך. באמצעות אופרטור זה, הפחת את התמונה הירוקה מהתמונה הכחולה. לקבלת מסיכה מגבילה יותר, הפחת את התמונה הירוקה מהתמונה האדומה. עבור אזורים אקראיים, הפחת את הערוץ הכחול מהערוץ הירוק.
  8. סף התמונה המתקבלת באמצעות אלגוריתם 'רגעים' . ברוב המקרים, זה לא צריך התאמות נוספות. עם זאת, התאם במידת הצורך. זה יפיק תמונה בינארית.
  9. לאחר יצירת התמונה הבינארית, מלא את החורים על-ידי בחירה > תהליך > בינארי למלא חורים בין סיבים ולעגל את גבולות המסיכה באמצעות מסנן חציוני. מסנן חציוני של 10 הוא נקודת התחלה טובה, התאם אותו כך שיתאים לנתונים. בדוק ידנית את המסכה להסכם והסר את כל ה- ROIs השגויים.
  10. לאחר שהמסיכה משביעת רצון, צור בחירה על-ידי בחירה באפשרות ערוך > > צור בחירה. העבר בחירה זו למנהל ההחזר על ההשקעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההתקנה של MIW ותכנון ניסיוני בסיסי הם הצעדים הראשונים בתהליך זה. העיצוב והפרוטוקול הספציפיים האלה של MIW נוחים יותר למחקרי אורך19 , והם נוצלו בהצלחה עם מיקרוסקופים זקופים והפכים כאחד. במקרה זה, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך מכיוון שהוא הביא ליציבות תמונה גבוהה יותר של בלוטת החלב עם פחות ממצאי נשימה. באיור 1A, אנו מספקים את הממדים של ה-MIW הנוקשה וסקירה גרפית של תהליך ההשתלה.

שדה ראייה טיפוסי בתוך גידול החלב MMTV-PyMT39 נטול התוויות (איור 1B-E, איור 3A) הוא הטרוגני מאוד, ומורכב מסיבי קולגן, תאים סטרומליים רבים, המוני תאי גידול וכלי דם (איור 3A). באופן כללי, סיבי הקולגן נפוצים יותר ליד החלון ויורדים בשפע עמוק יותר לתוך הגידול (איור 1B-E) גם ארגון הסיבים המקיפים את מסות הגידול יכול להיות מגוון למדי, לעתים קרובות עם אזורים בעלי ארגון אקראי יותר באותו שדה ראייה כמו אזורים בעלי יישור גבוה יותר (איור 2D,H ואיור 3I).

כדי לפתח צינור ניתוח שיכול לפלח נתונים תוך-ורידיים לאזורים פריווסקולריים, גידול וסטרומה, פרוטוקול זה התמקד בשימוש באות מ- NAD(P)H ו- SHG אנדוגניים. בעוד שזיהוי הגידול והסטרום יכול להיות פשוט, זיהוי אזורים פריווסקולריים בתוך המיקרו-סביבה של הגידול יכול להיות מאתגר. כלי הדם נמצאים לעתים קרובות בתוך הסרטים הצרים של אות NAD(P)H מופחת בין מסות התאים הסרטניים הבהירים NAD(P)H+. חשוב לציין כי לא בכל הגבולות האפלים יש כלי דם; במקום זאת, אזורים כהים מסוימים הם פשוט קפלי גידול או התלקחות של אונות גידול סמוכות (חץ צהוב, איור 2G). יתר על כן, בעוד שעין מתובלת יכולה לחלץ את כלי הדם בקוטר גדול יותר מהגידול מכיוון שיש להם מראה ייחודי, הבחנה זו אינה תמיד טריוויאלית. זה נכון במיוחד עבור כלי שיט בקוטר קטן יותר שבו המראה שלהם עשוי להיות עדין ומשתנה יותר. במקרה זה, השימוש באורך החיים הפלואורסצנטי של NAD(P)H יכול לסייע בזיהוי חיובי של כלי הדם (איור 2B,F). אורך החיים הפלואורסצנטי (FLIM) אינו מודד את השפע או העוצמה של פוטונים במיקום מסוים, אלא את הזמן שלוקח לאותן מולקולות נרגשות לפלוט פוטון ולהירקב למצב הקרקע שלהן. תאי דם אדומים (RBC) ופלזמת דם הוכחו כבעלי אורך חיים פלואורסצנטי קצר וייחודיאופייני 32,37 שניתן למנף לזיהוי ופילוח כלי דם ברקמות.

כדי לקבוע עד כמה אורך החיים הפלואורסצנטי של NAD(P)H מזהה את כלי הדם באופן תוך-ורידי, בולוס של 100 μL של דקסטרן בעל תווית רודמין הוזרק לווריד הזנב לאחר איסוף תמונת FLIM. השוואות של הקרנות בעוצמה מרבית של NAD(P)H FLIM משקפות היטב את כלי הדם המסומנים בדקסטרן המסומן באופן פלואורסצנטי (איור 2I-J). חזרה על גישה זו בעכברים מרובים הראתה כי שטח המסכה הממוצע מתמונת FLIM על פני אזור מסכת הדקסטרן היה 78.6% ± 12.3% (איור 2L). בעוד שהכיסוי לא היה 100%, טכניקה זו מיפתה במדויק את כל רשת כלי הדם. את ההבדלים שנצפו באזורים המדווחים ניתן לייחס לעתים קרובות לבעיות סחיפה או רישום תוך-ורידיות, קוטרי כלי שיט דקים יותר עקב התאמת המודל, או אובדן כלי שיט עדינים עקב הרחקת RBC על ידי לחץ המסה ההולכת וגדלה. חשוב לציין שטכניקה זו פועלת באותה מידה בנוכחותם של פלואורופורים המקודדים גנטית כמו GFP או מודלים של גידולים ללא תוויות (איור 2D,H), ובכך מספקת אמצעי חזק מאוד וישים באופן נרחב לזיהוי כלי הדם לסגמנטציה של תמונה.

כדי לתאר את הגבולות של מסות גידול ללא תוויות, נעשה שימוש ב-NAD(P)H autofluorescence (איור 1C). ניתן לצלם זאת על-ידי איסוף עצמאי של תמונת NAD(P)H או סיכום נתוני NAD(P)H FLIM כדי ליצור תמונת עוצמה. כל אחד מהמסלולים יאפשר פילוח מתאים של המיקרו-סביבה של הגידול. כתצפית כללית, עירור דו-פוטוני של NAD(P)H בתאים סרטניים מעורר אוטופלואורסצנציה בהירה המייצרת תמונה המציגה תאים בודדים חדים עם גרעינים כהים (איור 2E,G). ניתן להשתמש בתבנית זו כדי להגדיר את היקף המסה ההולכת וגדלה. בעוד שספינה פשוטה מבוססת עוצמה של NAD(P)H ניתנת להגדרת הגבול של תא הגידול, כלי סגמנטציה הניתן לאימון מתפקד לעתים קרובות טוב יותר (איור 3B,E). כמה קריאות נפוצות אחרות, כמו נדידת תאים או ניתוח בליטה תאית, עשויות להפיק תועלת מפלואורסצנציה אקסוגנית המקודדת גנטית בתוך מודל העכבר או מהשתלת קווי תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי (איור 2A). במקרים אלה, המשימה של תיחום גבול המסה יכולה להתבצע באמצעות סף פשוט של החלבון הפלואורסצנטי. לפעמים הביטוי של פלואורופור יכול להיות הטרוגני למדי לאחר ההשתלה. זה לא אמור לגרום לבעיות סגמנטציה. כמו כן, זה נצפה לעתים קרובות כי גידולים שנוצרו על ידי allografts פלואורסצנטי או xenografts יש אזורים פחות ממודרים של סיבי קולגן מאשר גידולים שנוצרו על ידי מודלים גידול גנטיים כמו MMTV-PyMT16.

התא הסטרומלי מקיף את האזורים שמחוץ למסה ההולכת וגדלה או בין מסות גדלות, ומסכה לסטרומה מתקבלת על ידי היפוך החזר ההשקעה של הגידול (איור 3B-F). לאחר מכן ניתן למדר עוד יותר את התא הסטרומלי לתת-ROIs בהתבסס על ארכיטקטורת סיבי הקולגן. סיבי קולגן הם תכונה משמעותית בסטרומה ויש להם מגוון גדול של ארגוני סיבים, הידועים כמכווננים את התנהגות התאים40,41. לעתים קרובות קיימים אזורים מקומיים רבים (<100 מיקרומטר) של סיבים מיושרים או אקראיים בתוך התמונה16. לכן, אזורים של ארגון סיבים מיושר יחסית (גוונים אדומים/כחולים) או אקראי (גוונים ירוקים) (איור 3I) זוהו עם תוסף ה-OrientationJ. באמצעות מפת הצבעים הקוהרנטית של OrientationJ, ניתן ליצור מסכות המבוססות על ארגון הסיבים המקומי למטרות סגמנטציה (איור 3J). לאחר מכן ניתן לכסות את המסכות האלה כדי לנתח התנהגות דינמית דיפרנציאלית של תאים סטרומליים (איור 3K) בשל ההשפעות של ארגון סיבים מסוים (איור 3H,I).

כעת, לאחר שהוגדרו ROIs עבור התאים השונים של המיקרו-סביבה של הגידול, ניתן ליישם אותם על הפריימים או הערוצים הבודדים של סרט ההפסקה התוך-גופית. בנקודה זו, חשוב להדגיש שכל האותות המוצגים באיור 3A נגזרים כולם ממקורות אנדוגניים. תמונה זו מדגימה את הפוטנציאל העשיר של רמזים מרחביים והקשריים שיכולים להגיע ממקורות אנדוגניים גרידא, הנמצאים בכל מקום וללא תוויות. כאן, השתמשנו במודל הגידול MMTV-PyMT כדוגמה כדי להמחיש את הישימות של השיטה לכימות המספר והמאפיינים של מקרופאגים במיקומים ספציפיים של המיקרו-סביבה של הגידול (TME). מחקר תוך-ורידי קודם מס'42 הראה כי תאים הפולטים רמות גבוהות של אוטופלואורסצנציה של FAD (איור 3A, תאי מג'נטה, חצים צהובים) מוכתמים באופן חיובי בנוגדני F4/80 ומייצגים אוכלוסייה של מקרופאגים בתוך ה-TME. באמצעות זרימת עבודה זו כדי לפלח את התמונה, ניתן לבחון את המספר ביעילות ובדייקנות, לנטר אינטראקציות בין תאים לאורך זמן, או אפילו לבחון את המאפיינים המטבוליים של תת-קבוצה זו של מקרופאגים (magenta) בתוך תאים שונים של TME (איור 3A, חצים צהובים). לדוגמה, ניתן לאפיין את ההתנהגות של מקרופאגים בעלי רמת FAD הממוקמת באופן ספציפי בתוך קן הגידולים הגבוה NAD(P)H(H)H(איור 3E). באופן דומה, ניתן לבחון את ההתנהגויות של המקרופאגים ביחס לארגון המקומי של הסיבים באזור הסטרומה. כמה דיווחים מהעת האחרונה הצביעו על כך שמקרופאגים ותאים נודדים אחרים בסטרומה מגיבים לרמזים מכניים מהמיקרו-סביבה המקומית שלהם 16,43,44. באמצעות מסכות יישור הסיבים המיוצרות בשיטה זו, ניתן לבחון את ההתנהגויות הדיפרנציאליות שלהן בין אזורים של ארגוני קולגן אקראיים ומיושרים. לבסוף, ניתן ליישם את אותו ניתוח ממוקד גם כדי לקבוע את המספר ואת ההתנהגות של מקרופאגים הממוקמים בתוך קרבה מוגדרת לכלי הדם. באיור 3G, ניתן לראות את כלי הדם באדום, ומקרופאגים נראים שוב במג'נטה. מסיכה עבור כלי הדם באמצעות NAD(P)H FLIM נוצרה ולאחר מכן הורחבה באמצעות התרחבות של 10 פיקסלים. המרחק שנבחר היה שרירותי למטרות הדגמה, אך ניתן להתאים אותו לצרכים המסוימים של הניסוי האינדיבידואלי. חשוב לציין, בעוד שתמונה זו היא של פרוסת z יחידה, ניתן היה לבצע אקסטרפולציה קלה של הליך זה לערימות תלת-ממדיות כדי לבחון את ההתנהגות סביב כל נפח הכלי.

Figure 1
איור 1: מופשט גרפי של השתלת חלונות יונקים והארגון הבסיסי של גידול MMTV-PyMT. (A) הממדים של חלון ההדמיה של היונקים וסכמטיים לתהליך ההשתלה הכללי. (ב-ה) זהו מונטאז' מנציג גידול MMTV-PyMT ללא תווית המתחיל מ-50 מיקרומטר מתחת לפני השטח של ה-MIW וממשיך לעומק של 80 מיקרומטר. ערכי העומק מסופקים מתחת לכל תמונה. סיבי קולגן (אפורים) נפוצים יותר על פני השטח של הגידול (NAD(P)H, כחול) מאשר בעומקים גדולים יותר. סרגל קנה מידה 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תמונה תוך-ורידית מייצגת של גידול PyMT מסומן ונטול תוויות של GFP ואימות של NAD(P)H FLIM כסמן לכלי הדם. תמונה מורכבת (A) של אלוגרפט טיפוסי של תאי GFP-4T1 לתוך כרית השומן החלבית וגידול יונק מייצג ממודל גידול MMTV-PyMT (E). NAD(P)H FLIM ממפה את כלי הדם בשני המודלים (B,F). פלואורסצנציה של GFP (C) ואוטופלואורסצנציה של NAD(P)H (G) שימשו לזיהוי הגידול. קולגן הודגם על ידי SHG (D,H). תמונה מורכבת המשתמשת ב-NAD(P)H FLIM לזיהוי כלי דם אומתה על-ידי השוואת הקרנות בעוצמה מרבית של הערימה התוך-לוויטלית לפני ואחרי הזרקת וריד הזנב של דקסטרן פלואורסצנטי (I,J,K). הכימות של היחס בין השטח שנקבע על ידי NAD(P)H FLIM על פני השטח שזוהה על ידי הזרקת דקסטרן בארבעה עכברים (צבע מזהה עכברים בודדים) ושדות ראייה מרובים (נקודות בודדות בגרף) מוצג ב- (L). סרגלי קנה מידה 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: פילוח תמונה מייצג באמצעות פלואורסצנציה אנדוגנית בתוך גידול PyMT ללא תוויות. תמונה מורכבת (A) של פרוסת z בודדת מגידול חלבי PyMT טיפוסי נאספה באמצעות אותות פנימיים בלבד. SHG (אפור) מדמיין את סיבי הקולגן של הגידול. הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים של NAD(P)H autofluorescence (ממוצע טאו (τ) מדווחת על החתימות המטבוליות של התאים (גוונים ירוקים עד כתומים) ועל המיקום של כלי הדם (אדום). FAD autofluorescence (magenta) מזהה מקרופאגים. באמצעות סכימת הסגמנטציה המתוארת בפרוטוקול זה, הגידול נטול התוויות חולק לתאים עבור קן הגידול (B,E), סטרומה (C,F) וכלי הדם (D,G) באמצעות SHG ו-NAD(P)H בלבד. ניתן גם לסווג את הסטרומה וסיבי הקולגן (H) לאזורים מקומיים של סיבים מיושרים ((המוצגים במג'נטה/כחול), J,K). סרגלי קנה מידה 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

נתונים משלימים 1: מערך נתונים מייצג של Aמותאם A 1% מ- NAD(P)H FLIM. זוהי היטל בעוצמה מרבית של A מותאםשל 1% מתוך ערכת נתונים טיפוסית. הוא מייצג את איכות הזיהוי האפשרית ורמת רקע טיפוסית לפני השימוש בסיווג הניתן לאימון. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

מודל משלים: מסווג מייצג המשמש ב-A1% מותאם לזיהוי כלי הדם. זהו מודל מסווג לדוגמה לשימוש בתוסף הסגמנטציה של WEKA הניתן לאימון בתוך ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הדמיה תוך-ורידית 4D היא כלי רב עוצמה לחקר אינטראקציות פיזיולוגיות דינמיות בהקשר המרחבי והזמני של המיקרו-סביבה של הגידול הטבעי. כתב יד זה מספק מסגרת תפעולית בסיסית מאוד וניתנת להתאמה כדי למדר אינטראקציות של תאים דינמיים בתוך מסת הגידול, הסטרומה הסמוכה, או בסמיכות לרשת כלי הדם באמצעות אותות אנדוגניים בלבד מדור הרמוני שני או NAD(P)H autofluorescence. פרוטוקול זה מספק שיטה מקיפה, שלב אחר שלב, החל מהשתלת חלון ההדמיה ועד לרכישה, ניתוח ופילוח של תמונות. אנו מאמינים שטכניקה זו תתרום למסגרת ניתוח נחוצה כדי לפלח ולכמת נתונים תוך-ורידיים 4D.

פרוטוקול זה פותח כך שיתאים באופן נרחב לדגמים רבים של עכברים תוך-ורידיים, כולל דגמי PDX ללא תווית. PDX's הם מודלאינפורמטיבי להפליא 45 אך מציבים אתגר להדמיה תוך-ורידית מכיוון שאופיו של מודל PDX אינו מתאים היטב למניפולציה גנטית. לכן, זה יהיה די יתרון שיש שיטה שיכולה לדמיין ולמדר אינטראקציות דינמיות בתוך הסביבה הפיזיולוגית ללא תווית שלהם באמצעות מטבוליטים אנדוגניים בלבד כמו NAD(P)H ודור הרמוני שני (SHG). בנוסף להיותה יתרון למודלים של PDX, גישה רב-ממדית זו יכולה להיות מיושמת באופן תיאורטי על כל מחקר תוך-ורידי ברקמה סרטנית או נורמלית הזקוק להקשר מרחבי ומבנה כדי לענות על שאלה פיזיולוגית. NAD(P)H autofluorescence ו-SHG מסיבי קולגן נמצאים בכל מקום בכל מקום בכל הרקמות ומייצגים משאב אוניברסלי וחופשי באוספים תוך-ורידיים. גישת FLIM זו חזקה גם מכיוון שהיא יכולה לזהות את כלי הדם בנוכחות פלואורסצנציה ממקורות אקסוגניים כמו GFP. גישה זו היא גם יתרון מכיוון שניתן לדמיין את פליטת SHG ו- NAD(P)H בספקטרום הכחול, ובכך לשכון באורך גל שאינו משמש בדרך כלל בהדמיה של מבני היתוך פלואורסצנטיים שעשויים להיות נחוצים אחרת למחקר.

ההיבט של גישה זו, שהוא חדשני ובעל ערך מוסף מיוחד, הוא הזיהוי נטול התוויות של כלי הדם. בעוד שגישות אחרות יכולות לעבוד, השימוש באורך החיים הפלואורסצנטי של NAD(P)H מספק בקלות חתימה ברורה ללא צורך בתיוג נוסף. הנתונים מראים כי הכלים המוגדרים לכל החיים משקפים את כלי הדם המסומנים מהזרקת וריד הזנב של דקסטרן פלואורסצנטי, תקן הזהב להדמיית כלי דם. הטכניקה שלנו מצטיינת בהדמיה של כלי דם קטנים יותר בהשוואה לעירור פשוט של שני פוטונים או שלושה פוטונים, שבו כלי דם גדולים יותר ניתנים להדמיה בקלות, אך כלי דם קטנים יותר דורשים מומחיות רבה יותר לזיהוי. חתימת החיים היא חד משמעית עבור כל כלי השיט, ללא קשר לגודל. יתר על כן, ניתן לשלב בקלות רכישה נוספת זו של NAD(P)H FLIM עם סמנים אחרים לסגמנטציה של המיקרו-סביבה של הגידול. באמצעות רכישת FLIM יחידה של NAD(P)H, הדרישות להגדרת כלי הדם, קן הגידול והסטרומה ניתנות להשגה. ניתן לשלב את קולקציית FLIM בתכנון הניסויי הקיים על ידי איסוף רכישה בודדת בסוף או בתחילתה של סדרת זמן או שזירת הקולקציות לאורך כל הרכישה הארבע-ממדית. קביעת הכמות המתאימה של תמונות FLIM תהיה תלויה בצרכים ובאילוצים ניסיוניים ספציפיים, כגון מרווחי רכישה, משך ניסוי או יציבות תמונה, אך לכל הפחות, יהיה צורך באוסף FLIM אחד לכל סדרת 4D לשיטה זו.

תהליך זה של שימוש ב- NAD(P)H FLIM לזיהוי כלי הדם דורש התאמה מתמטית של נתוני FLIM לפונקציה מעריכית של הצורה

Equation 1

עם A1+A2+A3=1. בעוד שרוב תמונות החיים של NAD(P)H המדווחות בספרות מותאמות כדו-מעריכיות, ביישום זה NAD(P)H הותאם כ-tri-exponential שבו τ1 ו-τ2 מוגדרים לערכים המדווחים של RBC ו-τ3 מותר לצוף. חשוב לציין שהמטרה היא לא להשיג את ערך החיים המדויק ביותר, אלא לספק תמונה אופטימלית לסגמנטציה. כאשר הערכים τ1 ו- τ2 קבועים בתחילה בערכים המדווחים של32,46 של RBC והמטריצה מחושבת, כלי הדם יבלטו עם ערכים של A1% הגדולים מ-60% בכלי הדם וערכי A1% בדרך כלל פחות מ-40% בגידול הסמוך. השלב הבא הוא לנסות למקסם את A1% בכלי הדם תוך מזעור A1% בגידול הסמוך. זהו תהליך איטרטיבי, ועד סופו, ערכי A1% של כלי הדם יהיו גדולים מ -90% עם ערכי A1% של הגידול פחות מ -10%. לאחר שערכי A1% של כלי הדם גבוהים באופן אחיד והרקע נמוך באופן אחיד, ייצאו את הקבצים האלה שלA 1% לכלי פילוח שניתן לאמן. פעולה זו תסיר במהירות כל רעש שנותר ותגדיר את ההחזר על ההשקעה עבור כלי הדם.

מכיוון שמשטח השומן של החלב ממוקם מחוץ לחלל הגוף, הניתוח הוא זעיר פולשני, והתוצאות הטובות ביותר מתקבלות על ידי השתלת ה- MIW מעל בלוטת היונק המפשעההרביעית . עיתוי השתלת החלון ומתי ייערך הניסוי הוא קריטי. עדיף לאפשר 24 - 48 שעות של ריפוי לאחר הניתוח לפני נקודת הזמן הפיזיולוגית שתיחקר. בעוד שההליך עצמו דורש רק חתך קטן (≈ 10 מ"מ) כדי להכניס את החלון (איור 1A), זמן הריפוי שלאחר הניתוח יאפשר לכל דלקת ונוזלים שהצטברו עקב תהליך ההשתלה להתבהר. יתר על כן, זה גם יאפשר לגידול להמשיך לגדול לתוך החלון. שני הגורמים ישפרו את איכות התמונה הכוללת על ידי הפחתת האטימות/פיזור והגברת יציבות התמונה. הדבר הבא שיש לקחת בחשבון הוא משך הזמן הכולל המתוכנן של הניסוי. בעוד שחלונות אלה תוכננו למחקרי אורך, האופי הנוקשה של החלון כרוך במגבלת זמן של שבועיים עד שלושה שבועות. לאחר פרק זמן זה, לחלון יש נטייה להתנתק משכבת העור, ובכך לזהם ולסיים את הניסוי. אם אין צורך במחקר אורכי של בלוטת החלב, שיטות תוך-ורידיות אחרות כמו הליך דש עור סופני22 שמבטל את ההשתלה הניתוחית של MIW עשויות להיות אפשרות טובה יותר. הליך דש העור מספק גישה טובה יותר לכל הבלוטה מכיוון שהיא אינה מוגבלת על ידי המיקום והממדים של ה- MIW, והיא יכולה לייצר יציבות תמונה רבה יותר ככל שהבלוטה נמשכת מחלל הגוף. ללא קשר לגישת ההדמיה התוך-vital, הפילוח של המיקרו-סביבה באמצעות פלואורסצנציה אנדוגנית עדיין ישים באופן נרחב לניתוח תמונה מאוחר יותר. הדבר האחרון שיש לקחת בחשבון הוא משך ניסוי ההדמיה האינדיבידואלי. זה לא בלתי סביר לרכוש סרטים שנמשכים 6-8 שעות. עם זאת, במהלך האוספים הארוכים יותר, הידרציה הופכת לבעיה, ונדרש מעקב צמוד אחר בריאות העכבר.

אחד היתרונות המשמעותיים של שיטה זו הוא שניתן לאסוף את התמונות השונות של פלואורסצנציה אנדוגנית הנדרשות לסגמנטציה של המיקרו-סביבה של הגידול בקלות יחסית וללא מניפולציות נוספות לעכבר. עם השילוב של מסנן/דיכרואי המדווח כאן (טבלת חומרים), ניתן לרכוש גם תמונות SHG וגם תמונות NADH עם אותו סט מסנן על ידי החלפת אורכי גל מ-890 ננומטר ל-750 ננומטר. אמנם זה יוצר עיכוב ברכישה, אבל זה לא משפיע על פילוח התמונה הבא. חשוב גם לזכור ששיטה זו מייצגת נקודת התחלה בלבד לטכניקת סגמנטציה באמצעות פלואורסצנציה אנדוגנית, ותצורות אופטיות מתקדמות יותר עשויות לאפשר רכישות סימולטניות במידת הצורך.

ישנן מגבלות של שימוש ב- FLIM כדי לזהות את כלי הדם. גישת FLIM דורשת אלקטרוניקה מיוחדת, מכשור ומומחיות לאיסוף. עם זאת, כל הדרישות הללו משולבות יותר ויותר במיקרוסקופים מודרניים וזמינות יותר באמצעות שימוש במתקני הליבה של ההדמיה. FLIM הפכה לטכנולוגיה בוגרת ורכישת נתונים טובים אינה דורשת הכשרה רבה. מגבלה שנייה היא שרכישות FLIM גוזלות זמן רב. בעוד שקצב הפריימים של תמונה שנאספה עם דקסטרן פלואורסצנטי הוא בערך שנייה או פחות, אוסף ה-FLIM הממוצע יכול לנוע בין 60 שניות ל-120 שניות, מה שעשוי להיות בלתי אפשרי אם נקודות הזמן הפיזיולוגיות קצרות מכך. זיהוי FLIM של כלי הדם אינו מיועד להחליף את כל וריד הזנב המוזרק דקסטרן פלואורסצנטי או עירור מולטי-פוטון של כלי הדם; במקום זאת, זוהי גישה נוספת בארגז הכלים ההולך וגדל להדמיה תוך-ורידית. יתר על כן, אנו צופים כי זמני רכישה ארוכים יותר יתקצרו באופן דרמטי בשנים הקרובות. הגלאים והאלקטרוניקה משתפרים במהירות, מפחיתים את זמן המתים של הגלאי, ובכך דורשים תקופות רכישה קצרות יותר כדי ללכוד את אותו מספר של פוטונים. סיבה נוספת להיות אופטימיים לגבי זמני רכישה קצרים יותר היא הופעתה של תוכנת למידת מכונה או אלגוריתם שחזור תמונות כמו CSBDeep47. אלגוריתמים אלה עשויים להיות מאומנים לעבוד עם זמני חשיפה קצרים יותר, ובכך להפחית את מספר הפוטונים הדרושים לזיהוי מדויק של מבנים למטרות סגמנטציה. יחד, זה יכול לקצר במהירות את לוחות הזמנים הדרושים לרכישות רב-ממדיות אלה.

השימוש בהדמיה תוך-vital רק יהפוך לחשוב יותר ככל שהחוקרים ינסו לפענח את האינטראקציות המורכבות הרבות בין תאים לתאים ולמטריצות תאים המתרחשות בתוך המיקרו-סביבה הפיזיולוגית של הגידול. לכן, יש צורך בהתפתחויות מתמשכות ביכולות הרכישה, הפילוח והניתוח. לשם כך, חשוב לא להתעלם מהפוטנציאל של פלואורסצנציה אנדוגנית לסגמנטציה של מיקרו-סביבה. בפרוטוקול זה, האות האנדוגני ממטבוליטים SHG ופלואורסצנטיים, כולל עוצמת NAD(P)H ו- FLIM, שימש למטרות סגמנטציה במהלך הדמיה תוך-ורידית של TME היונק. מטבוליטים אנדוגניים אחרים או תכונות פנימיות יכולים לספק אותות נוספים כדי לחשוף את ההדדיות הדינמית של תאי הגידול ואת המיקרו-סביבה. לדוגמה, ניתן להשתמש ב-FAD כדי לנטר את התנועה של אוכלוסיות חיסוניות42, דור 3P יכול להדגיש תכונות מבניות כמו ממברנות פלזמה או שומן36, וניתן להשתמש בפלואורסצנציה של אלסטין כדי להפריד עורקים מוורידים46. לכן, פלואורסצנציה אנדוגנית תמשיך לספק פלטפורמה רב-ממדית עשירה שיש לנצלה במלואה ככל שקהילת המחקר תמשיך לבנות את ארגז הכלים לסגמנטציה וניתוח של מיקרו-סביבה תוך-ורידית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצים להכיר במענקי NCI R01 CA216248, CA206458 ו- CA179556 למימון עבודה זו. אנו רוצים גם להודות לד"ר קווין אליסירי ולקבוצת ההדמיה שלו על המומחיות הטכנית שלהם בפיתוח המוקדם של התוכנית התוך-לוויתית שלנו. אנו מודים גם לד"ר בן קוקס ולחברים אחרים בקבוצת הייצור של אליסירי במכון מורגרידג' למחקר על התכנון הטכני החיוני שלהם בשלבים המוקדמים של ה-MIW. ד"ר אלן דובסון סייע בשיחות שימושיות על כלי הפילוח של WeKA הניתן לאימון של ImageJ. בנוסף, ברצוננו להודות לד"ר מליסה סקאלה ולד"ר אלכסה בארס-היטון על השימוש בזמן במיקרוסקופ שלהן. לבסוף, ברצוננו להודות לד"ר בריג'יט ראבה, D.V.M, על כל הדיונים והעצות המהורהרות על הטיפול והטיפול בעכברים שלנו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 12mm round cover glass Warner Instruments # 64-0712 MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection BD 309659 Syringe
20x objective Zeiss 421452-988 Water immersion
27G needle for SQ injection Covidien 1188827012 Needle
40x objective Nikon MRD77410 Water immersion
5-0 silk braided suture Ethicon K870 Suture for MIW implantation
Artificial tears gel Akorn NDC 59399-162-35 Eye gel
Betadine solution, 5% Fisher Scientific NC1558063 Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator Fisher Scientific 23-400-101
Cyanoacrylate adhesive Loctite 1365882 MIW construction
fluorescent dextran Sigma T1287-50mg intravenous labelling of vasculature
forceps Mckesson.com Miltex #18-782 stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube Hamamatsu 
heating blanket CARA 72 heating pad  038056000729 Temperature selectable
heating chamber home built
Fluorescent lifetime handbook Becker and Hickl https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base Nikon
Isoflurane Akorn NDC 59399-106-01 Anesthesia
Liqui-Nox Fisher Scientific 16-000-125 MIW cleaning
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10 Analgesic
Micro Hose Scientific Commodities INC.  BB31695-PE/1
multiphoton scan head Bruker Ultima II Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter Chroma 284994 ET 440/80 m-2P
Nair CVS 339826 Depilatory cream
objective heater Tokai Hit STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter Chroma 320740 ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner Amazon.com B00814ME24 Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board Becker and Hickl
surgical light FAJ B06XV1VQVZ Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors Excelta 366 stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment Actavis Pharma NDC 0472-0179-34 Antibiotic
TV catheter Custom BD 30G needle: 305106 Catheter for TV injection
Two photon filter Chroma 320282 ET585/65m-2P
two-photon laser Coherent charmeleon Tunable multiphoton laser
ultrasound gel Parker PKR-03-02 Water immersion gel
Urea crystals Sigma U5128-5G Optional: FLIM IRF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
  2. Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
  3. Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
  4. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120 (2020).
  5. Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
  6. Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
  7. Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173 (2020).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
  9. Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
  10. Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
  11. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  12. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
  13. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
  14. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
  15. Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
  16. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  17. Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
  18. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  19. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490 (2019).
  22. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  23. Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
  24. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  25. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  26. Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
  27. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  28. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  29. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007 (2014).
  30. Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  31. Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
  32. Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
  33. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  34. von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), New York, N.Y. 925-938 (2013).
  35. Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
  36. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125 (2018).
  37. Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
  38. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), Oxford, England. 2424-2426 (2017).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  41. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  42. Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086 (2016).
  43. Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787 (2020).
  44. Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850 (2019).
  45. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
  46. Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171 (2017).
  47. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).

Tags

חקר הסרטן גיליון 183
גישת סגמנטציה ללא תווית להדמיה תוך-ורידית של מיקרו-סביבה של גידולי יונקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burkel, B. M., Inman, D. R.,… More

Burkel, B. M., Inman, D. R., Virumbrales-Muñoz, M., Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (183), e63413, doi:10.3791/63413 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter