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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63413
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

Summary

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Abstract

A capacidade de visualizar interações fisiológicas complexas e dinâmicas entre numerosos tipos de células e a matriz extracelular (ECM) dentro de um microambiente tumoral vivo é um passo importante para entender mecanismos que regulam a progressão do tumor. Embora isso possa ser realizado através das técnicas atuais de imagem intravital, ela permanece desafiadora devido à natureza heterogênea dos tecidos e à necessidade de contexto espacial dentro da observação experimental. Para isso, desenvolvemos um fluxo de trabalho de imagem intravital que emparelha a imagem de segunda geração harmônica de colágeno, fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H, e microscopia de imagem de fluorescência vitalícia (FLIM) como meio de compartimentar não invasivamente o microambiente tumoral do tumor em domínios básicos do ninho tumoral, o estroma circundante ou ECM, e a vaculatura. Este protocolo não invasivo detalha o processo passo a passo que vai desde a aquisição de imagens de lapso de tempo de modelos de tumores mamários até análise pós-processamento e segmentação de imagens. A principal vantagem deste fluxo de trabalho é que ele explora assinaturas metabólicas para contextualizar o microambiente tumoral vivo em mudança dinâmica sem o uso de rótulos fluorescentes exógenos, tornando-o vantajoso para modelos de xenerto derivados do paciente humano (PDX) e uso clínico futuro onde fluoroforos extrínsecos não são prontamente aplicáveis.

Introduction

A matriz extracelular (ECM) no microambiente tumoral é conhecida por ser dinamicamente depositada e remodelada por múltiplos tipos de células para facilitar ainda mais a progressão da doença 1,2,3. Essas alterações matriciais fornecem sinais mecânicos e biológicos que alteram o comportamento celular e muitas vezes resultam em um ciclo contínuo de remodelação matricial4. A investigação sobre a interação dinâmica e recíproca entre as células tumorais e a matriz extracelular é frequentemente conduzida usando cultura tridimensional (3D) in vitro ou sistemas microfluidos. Embora essas abordagens de baixo para cima tenham demonstrado mecanismos de remodelação do ECM 5,6,7, aumento da proliferação8, epitelial para transição mesenquimal 9,10,11,12, e migração e invasão de células tumorais 7,13,14,15,16 , seu foco tem sido principalmente em alguns tipos de células (por exemplo, células tumorais ou fibroblastos) dentro de uma matriz 3D homogênea em comparação com a diversidade e heterogeneidade das interações presentes dentro de um tecido fisiológico. Além dos sistemas in vitro, a histologia tumoral ex vivo também pode fornecer algumas informações sobre essas interações célula-célula e célula-ECM17. A imunohistoquímica tem a vantagem de poder analisar múltiplos tipos celulares no que diz respeito à composição espacialmente heterogênea e arquitetura do ECM, mas os pontos finais estáticos do tecido fixo não captam a natureza dinâmica das interações entre as células e o microambiente. A imagem intravital abriu a porta para interrogar interações diversas e dinâmicas dentro do contexto fisiológico do microambiente tumoral nativo.

As capacidades de imagem de tumor intravital estão avançando rapidamente. Melhorias no design de janelas de imagem e técnicas cirúrgicas para implantar as janelas permitiram imagens longitudinais de tumor a longo prazo em uma variedade de locais anatômicos (ou seja, tumor primário, linfonodos, sítios metastáticos 18,19,20). Além disso, a capacidade de instrumentação óptica para visualizar e coletar dados em múltiplas dimensões (ou seja, intensidade espectral, fluorescência espacial e vida útil), e em alta resolução e velocidade (taxa de vídeo) está se tornando amplamente acessível. A tecnologia aprimorada oferece uma oportunidade para explorar mudanças rápidas na sinalização celular e dinâmica fenotípica dentro de um ambiente fisiológico. Por fim, a expansão das ferramentas optogenéticas e a ampla gama de construções fluorescentes genéticas permitem a marcação de tipos celulares específicos para capturar a migração celular no microambiente tumoral ou rastreamento de linhagem celular durante o desenvolvimento ou progressão da doença21,22. O uso dessas ferramentas em combinação com a tecnologia CRISPR/Cas9 proporciona aos pesquisadores a oportunidade de gerar modelos animais únicos em tempo hábil.

Embora todos esses avanços tornem a imagem intravital um método cada vez mais poderoso para explorar interações celulares dinâmicas e fisiológicas, ainda há uma necessidade importante de desenvolver estratégias que forneçam contexto espacial, temporal e estrutural no nível tecidual a essas interações biológicas. Atualmente, muitos estudos de imagem intravital compensam a falta de marcos visuais, como os vasos sanguíneos, injetando corantes fluorescentes na vasculatura ou empregando modelos de camundongos que exógenos expressam proteínas fluorescentes para delinear características físicas. Corantes injetáveis e substratos como dextrans fluorescentes são amplamente utilizados para rotular com sucesso a vasculatura nas coleções intravitais19, 23, 24. No entanto, essa abordagem não é sem limitações. Por um tempo, requer manipulações adicionais de mouse e sua utilidade está limitada a experimentos de curto prazo. Para estudos longitudinais, o dextran fluorescente pode ser problemático, pois observamos o acúmulo de dextran em células fagocíticas ou difusão no tecido circundante ao longo do tempo25. A incorporação de proteínas fluorescentes exógenas no modelo do camundongo tem sido apresentada como uma alternativa aos dextrans fluorescentes, mas apresenta limitações próprias. A disponibilidade e a diversidade de fluoroforos exógenos dentro dos modelos de mouse ainda são limitadas e caras de criar. Além disso, em modelos específicos, como modelos PDX, manipulações genéticas não são desejáveis ou possíveis. Também foi demonstrado que a presença de proteínas fluorescentes ou bioluminescentes dentro das células são reconhecidas como estrangeiras dentro do camundongo, e dentro de modelos de camundongos imunocompetuntes, isso reduz a quantidade de metástase devido à resposta do sistema imunológico hospedeiro26,27. Por fim, proteínas fluorescentes exógenas ou corantes fluorescentes usados para contexto espacial ou para segmentar dados subsequentes muitas vezes ocupam faixas primos do espectro de luz que poderiam ser usadas para investigar as interações fisiológicas de interesse.

O uso do sinal intrínseco do ECM ou fluorescência endógena das células dentro do tecido representa um potencial meio universal livre de rótulos para segmentar dados intravitais para uma análise celular e espacial mais aprofundada. A segunda geração harmônica (SHG) tem sido usada há muito tempo para visualizar o ECM28. Com o desenvolvimento subsequente de importantes ferramentas para auxiliar na caracterização da organização defibras 29,30,31, é possível caracterizar o comportamento celular em relação à estrutura local de ECM. Além disso, a autofluorescência do metabólito endógeno, NAD(P)H, fornece outra ferramenta sem rótulos para compartimentar o microambiente tumoral in vivo. Nad(P)H fluoresce brilhantemente em células tumorais e pode ser usado para discriminar os limites do ninho tumoral em crescimento de seu estroma circundante21,32. Por fim, a vasculatura é uma importante estrutura fisiológica no microambiente tumoral e local de interações específicas do tipo celular chave 33,34,35. A excitação dos glóbulos vermelhos (RBC) ou plasma sanguíneo tem sido usada para visualizar a vasculatura tumoral, e usando excitação de dois ou três fótons (2P; 3P) a medição das taxas de fluxo sanguíneo tem se mostrado possível36. No entanto, enquanto os vasos sanguíneos maiores são facilmente identificáveis por suas assinaturas de fluorescência endógena, a identificação de vasos sanguíneos pequenos sutis, variáveis e menos fluorescentes requer mais conhecimento. Essas dificuldades inerentes dificultam a segmentação de imagem ideal. Felizmente, essas fontes de fluorescência endógena (ou seja, glóbulos vermelhos e plasma de sangue) também podem ser medidas pela imagem de vida fluorescência37, que capitaliza as propriedades fotofísicas únicas da vasculatura e representa uma adição útil à crescente caixa de ferramentas intravital.

Neste protocolo, um fluxo de trabalho para a segmentação de imagens intravitais quadridimensionais (4D) explicitamente utilizando sinais intrínsecos como fluorescência endógena e SHG é descrito desde a aquisição até a análise. Este protocolo é particularmente pertinente para estudos longitudinais através de uma janela de imagem mamária onde a fluorescência exógena pode não ser prática ou possível, como é o caso dos modelos PDX. Os princípios de segmentação aqui descritos, no entanto, são amplamente aplicáveis aos usuários intravitais que investigam biologia tumoral, desenvolvimento de tecidos ou mesmo fisiologia tecidual normal. O conjunto de abordagens de análise relatadas permitirá aos usuários diferenciar o comportamento celular entre regiões de configurações alinhadas ou aleatórias de fibra de colágeno, comparar números ou comportamentos de células residentes em regiões específicas do microambiente tumoral e mapear a vasculatura para o microambiente tumoral usando apenas sinal livre de rótulos ou intrínsecos. Juntos, esses métodos criam uma estrutura operacional para maximizar a profundidade das informações obtidas a partir da imagem intravital 4D da glândula mamária, minimizando a necessidade de rótulos exógenos adicionais.

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Protocol

Todos os experimentos descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Wisconsin-Madison. O bem-estar e o tratamento da dor em todos os experimentos com animais é primordial. Assim, todos os esforços são feitos para garantir que o animal esteja confortável e bem cuidado em cada etapa do procedimento.

1. Geração da janela de imagem mamária (MIW)

  1. Para construir a janela de imagem mamária, forja um anel de 14 mm a partir de aço inoxidável de grau cirúrgico.
  2. Limpe a estrutura da janela usinada usando uma solução quente de detergente de limpeza de 5%, enxágue por 10 minutos em água deionizada (DI), mergulhe em 100% etanol por 10 minutos e depois seque sob uma lâmpada de calor. Autoclave o quadro MIW seco e armazene-o para uso posterior.
  3. Prepare o vidro de cobertura MIW da seguinte forma: Mergulhe o vidro redondo de cobertura de 1,5 12 mm em 100% etanol por 10 minutos, seque sob uma lâmpada de calor e, em seguida, fixe na estrutura de METAL MIW usando adesivo de cianoacrilato. Cure o adesivo da noite para o dia.
  4. Limpe o MIW montado de adesivo em excesso usando um cotonete encharcado de acetona, e limpe-o submergindo-o em 70% de etanol por 10 minutos. Deixe a janela limpa secar. Prepare o MIW com antecedência e armazene-o em uma placa de Petri estéril antes da implantação cirúrgica.

2. Implantação cirúrgica do MIW

  1. Ferramentas cirúrgicas autoclave e higienize superfícies com 70% de etanol antes de iniciar a cirurgia para a implantação da janela.
  2. Faça uma cirurgia em uma mesa higienizada usando um cobertor aquecido coberto com um campo estéril. Coloque a manta de aquecimento de tal forma que a temperatura medida em cima do campo estéril seja de 40 °C.
  3. Use iluminação fria auxiliar para ajudar a evitar a secagem de tecidos. Use lupas para facilitar o procedimento cirúrgico. Use EPI consistindo de um jaleco estéril, de uso único, mangas cirúrgicas, luvas, proteção ocular e máscara facial, conforme recomendado pelas melhores práticas cirúrgicas.
  4. Anestesiar o mouse usando uma máquina vaporizadora de anestesia com uma configuração isoflurane de 2,0% e uma taxa de fluxo de oxigênio de 2,0 L/min. Administre analgésico (10 mg/kg de meloxicam) por injeção subcutânea.
    NOTA: Forneça doses adicionais nas primeiras 24h, preferencialmente a cada 8-12 h nos primeiros 2 dias após a cirurgia.
  5. Uma vez anestesiado (confirmado sem resposta ao dedo do dedo do poço), aplique um gel ocular hidratante para evitar a secagem dos olhos. Use um creme depilatório para remover a pele no local da cirurgia (4ª glândula mamária inguinal) seguida de enxaguamento com gaze estéril encharcada de água.
  6. Prepare o local cirúrgico depilado para cirurgia, higienizando a superfície da pele com 3 esfoliantes alternados de betadina e etanol.
  7. Para começar a cirurgia, levante suavemente a pele sobre a 4ª glândula mamária número 4 usando fórceps. Uma vez que a pele seja afastada da parede do corpo, remova uma seção de ~1 mm da camada dérmica na ponta dos fórceps com microlassa cirúrgica. Se ocorrer sangramento, aplique pressão suave com gaze estéril até que o sangramento pare.
    NOTA: Em geral, tumores maiores têm maior potencial para sangrar do que tumores menores ou tecidos normais.
  8. Retire a glândula mamária da camada dérmica com movimentos suaves dos fórceps na abertura cirúrgica para evitar o corte da glândula subjacente.
  9. Crie uma incisão de 10 mm e libere a glândula mamária da camada dérmica na periferia para que as suturas possam ser colocadas sem penetrar na glândula mamária. Adicione PBS para cobrir a glândula/tumor exposto e para evitar a secagem.
  10. Crie uma sutura de corda de bolsa ao longo da periferia da abertura usando sutura trançada de seda 5-0. Insira uma borda do MIW para que a camada dérmica se envolva no entalhe receptor do MIW.
  11. Estique suavemente o epitélio no lado oposto do MIW e empurre o MIW metálico para o lugar de tal forma que a camada dérmica engaje totalmente o entalhe receptor em torno de toda a circunferência MIW. Aperte a corda da bolsa firmemente para desenhar a camada dérmica no entalhe e amarre-a totalmente para fixar totalmente o MIW.
  12. Adicione um antibiótico tópico à camada dérmica do MIW, e monitore continuamente o mouse até que ele tenha recuperado consciência suficiente para manter a recumbência severa. Abriga o mouse implantado pela MIW separadamente na cama macia com um iglu colocado na gaiola e permite que o mouse se recupere por 48 horas antes da imagem.

3. Posicionamento e manutenção do mouse no estágio do microscópio para imagem

  1. Coloque a câmara de aquecimento no palco do microscópio. Use um sistema de ar forçado definido para 30 °C ou qualquer outro sistema semelhante. Use um aquecedor objetivo para evitar a deriva no foco z. Permita que o sistema se equilibre por pelo menos 1h antes da imagem.
    NOTA: Camundongos anestesiados são incapazes de manter adequadamente a temperatura corporal e, portanto, é necessário ter um ambiente aquecido para quaisquer aquisições de lapso de tempo. O aquecedor objetivo ajuda a combater os efeitos da expansão térmica, fenômeno que causa deriva no foco z à medida que a lente objetiva e o tecido que está sendo imageado chegam ao equilíbrio térmico.
  2. Uma vez que a câmara de aquecimento do microscópio tenha estabilizado a 30 °C, anestesiar o mouse receptor com configurações da máquina de anestesia de 2% isoflurane e taxa de fluxo de oxigênio de 2 L/min.
  3. Depois que o rato estiver sedado (confirmado por nenhuma resposta ao dedo do dedo do dedo do poço), limpe a parte externa do vidro MIW com um aplicador de algodão e limpador de vidro, adicione pomada para evitar a secagem e insira um cateter da veia da cauda, se necessário.
  4. Para manter a hidratação adequada, dê uma injeção inicial de 0,5 mL PBS sub-cutâneo ou 100 μL através do cateter da veia traseira. Repita a cada 2h durante a sessão de imagem.
  5. Uma vez que o mouse tenha sido devidamente preparado, configure o microscópio para imagem. Para reduzir a evaporação durante as medições de lapso de tempo, use um gel à base de água em vez de água para a mídia de imersão. Isso deve ser feito antes de colocar o mouse no palco. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes dos componentes ópticos.
  6. Coloque o mouse no estágio do microscópio, encaixe a mangueira isoflurane e pressione a coleira do MIW em um orifício receptor de 14 mm na inserção do palco para estabilizar as imagens. Leve o campo de imagem em foco usando os oculares do microscópio e use iluminação de campo brilhante para observar a vasculatura com fluxo sanguíneo.
  7. Verifique a estabilidade do campo de visão. Se os artefatos de movimento respiratório estiverem presentes, aplique uma compressão suave na parte traseira da glândula com um pequeno bloco de espuma e um pedaço de fita adesiva semelhante à cintura. Após a aplicação da compressão, verifique se o fluxo sanguíneo é mantido em todo o campo de visão.
  8. Ajuste periodicamente os níveis de isoflurane em incrementos de 0,25% durante a sessão de imagem para manter um nível adequado de sedação, contando manualmente a respiração animal.
  9. Mantenha uma taxa de 36-40 respirações por min (rpm) para melhorar a longevidade animal e a imagem óptica. Taxas de respiração mais baixas podem resultar na não sobrevivência do rato no experimento, enquanto as taxas de respiração acima de 60 rpm podem resultar em má sedação, o que pode aumentar a respiração e os artefatos de movimento nos dados da imagem.

4. Configuração para imagens intravitais 4D, baseadas em intensidade e sem rótulos do comportamento celular dinâmico

  1. Uma vez que o mouse esteja sedado e posicionado com segurança no estágio do microscópio invertido, comece a localizar regiões de interesse.
  2. Usando uma fonte de luz direcionada ao MIW, use os oculares do microscópio para identificar áreas potenciais para investigação. Adicione e salve as posições x e y no software para retornar a essas posições.
    NOTA: Os detalhes finos do tumor não serão facilmente visíveis com este tipo de iluminação. O objetivo é simplesmente identificar regiões para investigações mais aprofundadas. O foco é ver vasculatura e fluxo sanguíneo.
  3. Depois de várias posições terem sido salvas no software, visualize os campos de exibição escolhidos usando excitação de 890 nm e o cubo de filtro FAD/SHG. Use um tempo máximo de moradia de 4 μs com menor potência e configuração pmt alta. O objetivo é visualizar os campos de visão sem expor excessivamente o tecido à luz laser excessiva.
  4. Uma vez configurados níveis de energia apropriados, configure as pilhas z. Observe a aparência de fibras abundantes de colágeno (SHG) a 20-50 μm abaixo da superfície de vidro do MIW. O colágeno se tornará menos prevalente à medida que o microscópio se se for mais profundo no tumor (Figura 1B). Vazios no SHG revelam a localização das massas tumorais.
  5. Coloque a fatia z superior, abaixo da camada de células solitárias onde as primeiras fibras de colágeno aparecem em ~50-100 μm. Coloque a fatia z inferior em ~250 μm, onde as fibras desaparecem e o sinal ruim domina. Repita isso para todas as posições x-y salvas.
  6. Uma vez definida a faixa de pilha z, aumente o tempo de moradia (até 8 μs) e otimize as configurações de energia e detector. Otimize os níveis de energia conforme necessário para excitar o tecido para cada experimento. O uso de potências de até 90 mW a 750 nm ou 70 mW a 890 nm na abertura traseira do objetivo está dentro de um intervalo aceitável.
    NOTA: A profundidade de imagem, a quantidade de dispersão dentro do tecido, características objetivas e sensibilidade ao detector afetarão significativamente a quantidade de energia necessária para obter uma imagem.
  7. Ajuste os intervalos de tempo de acordo com as metas experimentais. Comece com intervalos de 10 minutos entre os pontos de coleta para a maioria dos filmes de migração intravital.
  8. Mesmo que a excitação 2P seja suave em células e tecidos, fique ciente de sinais de fototoxicidade, como sangramento de células ou aumento rápido da autofluorescência, e fotobleaching excessivo. Reduza a potência do laser ou aumente os intervalos de timelapse conforme as condições indicam.

5. Imagem vitalícia da fluorescência (FLIM) de NAD(P)H

  1. Preservando as posições x-y das aquisições timelapse, configure o microscópio para coletar uma pilha FLIM. Insira um filtro 440/80 em um suporte de filtro na frente do detector GaAsP e defina a tensão do detector GaAsP para 800 no software. Desligue as luzes da sala quando os detectores estiverem ligados.
  2. No software, mude da imagem de intensidade baseada em galvanômetro para um modo de imagem FLIM.
  3. Com o objetivo de identificar e mascarar a vasculatura, defina a resolução para 512 x 512 pixels. Para coletar informações metabólicas complementares, defina a resolução para 256 x 256 pixels para aumentar a resolução temporal da assinatura vitalícia. Ajuste o tempo de moradia para 4 μs e ajuste o laser para 750 nm.
  4. Inicie a varredura da visualização e comece a ajustar a potência do laser. Ajuste a potência do laser até que a leitura para a fração constante discriminatória (CFD) esteja entre 1 x 105 e 1 x 106. Não exceda 1 x106 , pois isso resultará em acúmulo de fótons e resultados gerais ruins.
  5. Uma vez definido o nível de potência, defina o tempo de integração entre 90 e 120 s e inicie a coleção FLIM. Ele adquirirá fótons do campo de visão pelo tempo alocado.
  6. Opcional: Depois de todas as coletas necessárias terem sido feitas e o mouse tiver sido removido do palco, colete uma função de resposta ao instrumento (IRF). Meça o IRF por meio da imagem da superfície de cristais de ureia disponíveis comercialmente em um prato de fundo de vidro com os mesmos parâmetros e configurado usado para a imagem do tecido.
    NOTA: O IRF responde por quaisquer atrasos ou reflexos devido à configuração eletrônica ou óptica. O IRF está envolvido em todas as aquisições da FLIM, e desconvá-lo a partir dos dados pode melhorar a precisão das curvas calculadas de decadência de fluorescência. Dito isto, os IRFs calculados podem muitas vezes replicar razoavelmente a qualidade das curvas de decaimento da fluorescência a partir de IRF medido. É uma boa prática medir o IRF até que se determine que o IRF calculado produzirá ajustes equivalentes das curvas de decomposição e aproximadamente os resultados da IRF medida.

6. Análise de imagens nadh lifetime

  1. Abra o software FLIM e importe a imagem vitalícia NAD(P)H do conjunto de dados. Para obter mais detalhes sobre como usar corretamente o software, consulte os manuais de vida fluorescentes (Veja tabela de materiais).
  2. Para começar, defina os parâmetros do modelo no software. Na barra de menus, clique em Opções > Modelo. Selecione as seguintes caixas: Configurações > decadência multi-exponencial, método de ajuste > MLE, Binning Espacial > Square, Threshold > Peak e verifique a transferência de correção antes de calcular a imagem.
  3. Na barra de menu, clique em Color >A 1% do menu suspenso. No lado direito da janela, defina-o como um ajuste de três componentes. Ajuste o tamanho da caixa > 3.
  4. Ajuste o limiar > ~10. Reavalie a precisão do limiar após a matriz de decomposição ter sido calculada pela primeira vez.
  5. Conserte o τ1 a 200 ps. Isso representa a curta vida útil dos glóbulos vermelhos. Tente encontrar o valor que melhor corresponde a múltiplas manchas no vaso sanguíneo maior, o que pode ser visto na imagem de intensidade. Conserte o τ2 a 1200 ps. Isso representa a longa vida dos glóbulos vermelhos.
    NOTA: Os valores definidos são apenas o ponto de partida. Os valores precisarão ser otimizados para trazer mais vasculatura. Na maioria dos casos, mas nem sempre, esses valores diminuirão.
  6. Em Calcular na barra de menu, selecione Decay Matrix. Isso vai gerar uma inicial de1% de imagens ao longo da vida com a vasculatura tendo valores elevados. Use o cursor (mira) para pairar sobre a vasculatura. Sistematicamente e um de cada vez, flutuar (desmarque a caixa De fixação ) o τ1 e τ2. Registo esses valores, pois eles ajudarão a otimizar os parâmetros fixos.
    NOTA: O objetivo não é necessariamente obter os valores mais precisos na imagem, mas sim maximizar a disparidade entre a vasculatura e o tecido sem diminuir drasticamente a área identificada como vasculatura.
  7. Uma vez identificados os parâmetros apropriados para τ1 e τ2, na barra de menu selecione Calcular > processamento em lote. Certifique-se de que a maioria das configurações são semelhantes entre as fatias z.
  8. Certifique-se de verificar se não há uma configuração grosseiramente diferente das outras. Se assim for, ajuste o turno primeiro e tente novamente. Se o problema persistir, reajuste usando novos parâmetros. Uma mudança incorreta pode ser uma grande causa de ruído nas encaixes e pode aumentar os valores de1% nas regiões tumorais adjacentes.
  9. Na guia menu, salve os arquivos eexporte arquivos A 1%. Carregue esses arquivos no ImageJ para mascarar e segmentar.

7. Segmentação de imagem da vasculatura

  1. Abra ImageJ e importe a imagem A1% como uma imagem de texto. Repita isso para todas as imagens dentro da pilha.
  2. Com todas as imagens A1% abertas, selecione Imagem > Stack > Z-Project. Use a Projeção de Intensidade Máxima e salve as imagens. Consulte dados suplementares 1 para uma imagem representativa.
  3. Vá para Plugins > Segmentação. Selecione o plugin de segmentação WEKA38.
  4. Uma vez que a janela WEKA se abra, use as configurações padrão e comece a treinar o software criando duas classes e traçando linhas sobre a vasculatura (regiões de1% altas) e não-vasculatura (regiões baixas A1%).
  5. Continue adicionando novos traços às duas classes até que o software identifique consistentemente as regiões altas de1% da vasculatura, eliminando quaisquer regiões mais altas de ruído de fundo. Consulte modelo suplementar para modelo de classificador representativo.
  6. Uma vez que a imagem classificada seja produzida, clique em Imagem > Tipo > 8 Bit. Limiar a imagem e criar uma máscara. Se a imagem limiar ainda precisa ser limpa ainda mais, use a função Analisar partículas .
  7. Ajuste o tamanho e a circularidade até que quaisquer regiões menores e circulares da imagem limiar sejam excluídas. Uma máscara limpa com apenas a vasculatura e muito pouco fundo é obtida.
  8. Clique em Editar > Seleção > Criar Seleção. Transfira a seleção para o gerente do ROI clicando em Analisar > Ferramentas > gerente de ROI.
  9. Duplicar a imagem confidencial. Prossiga para processar > Binário. Para expandir a máscara e definir a distância da vasculatura que será incluída na segmentação de imagem, selecione Dilate. Repita até que a máscara se expanda para o alcance desejado. Registo essa região de interesse (ROI) no roi manager.
    NOTA: O objetivo desta etapa é quantificar a quantidade ou o comportamento dentro de uma certa proximidade do vaso sanguíneo (por exemplo, o número de células presentes dentro de X μm dos vasos sanguíneos). A quantidade de dilatação necessária é inteiramente determinada pela questão científica.
  10. Para quantificar o número de células dentro das regiões restritivas, selecione a janela (imagem/canal) de interesse. Esta pode ser qualquer janela que compartilhe o mesmo campo de visão que a máscara vascular. Aplique ambos os ROI's usando a função XOR no menu suspenso.
    NOTA: Esta operação medirá os itens dentro da distância desejada da vasculatura, excluindo a vasculatura em si. Essa abordagem combinada do ROI pode então ser usada para medir uma infinidade de parâmetros, como intensidade, número de celular ou migração.

8. Segmentação de imagem do ninho tumoral

  1. Abra a imagem NADH de uma varredura de alta resolução ou coleção FLIM no ImageJ.
    NOTA: Isso pode ser feito em fatias z individuais, pilhas completas ou aplicadas a projeções z de algumas fatias.
  2. Vá para Plugins > Segmentação. Selecione o plugin de segmentação WEKA capacitável.
  3. Uma vez que a janela WEKA se abra, use as configurações padrão e comece a treinar o software em duas classes de regiões altas naDH e regiões baixas do NADH. As regiões altas do NADH terão um padrão muito perceptível de células com núcleos e o software irá identificá-lo facilmente.
  4. Continue alternando para frente e para trás com a sobreposição para refinar o algoritmo com treinamento adicional até que ele reconheça todas as regiões do tumor como determinado pelo conhecimento ocular e prévio da morfologia tumoral. Este é um processo iterativo.
  5. Uma vez que o algoritmo reconheça todas as regiões do tumor, selecione o botão Criar resultado . Isso produzirá uma nova imagem. Duplicar essa imagem.
  6. Selecione a primeira imagem duplicada e converta-a em uma imagem de 8 bits selecionando imagem > Tipo > 8 Bit. Limiar esta imagem para criar uma máscara binária. Em seguida, crie uma seleção e transfira-a para o gerente do ROI. Esses ROIs definirão o estroma.
  7. Selecione a segunda da imagem duplicada e converta-a em uma imagem de 8 bits. Inverta esta imagem selecionando Imagem > Editar > Inverter e, em seguida, limiar essa imagem para criar uma máscara binária. Mais uma vez crie uma seleção e transfira para o gerente do ROI. Este ROI definirá o ninho tumoral.

9. Segmentação de imagem por organização ou alinhamento de fibras

  1. Para começar, abra as imagens SHG, prepare qualquer projeção z e avalie a necessidade de qualquer pré-processamento. Para bons resultados, são necessárias imagens de alta qualidade com fibras discerníveis e baixo ruído.
  2. Opcional: Para pré-processamento no ImageJ para aumentar o sinal-ruído (SNR) do canal SHG, subtraia o fundo usando uma subtração de bola rolando. Para a maioria das aplicações, use uma subtração de bola rolando entre 20 pixels e 50 pixels. Em seguida, suavizar a imagem e salvá-la.
  3. Abra o plugin OrientationJ e defina os parâmetros de processamento. Na janela OrientationJ, defina o tamanho da janela tensor local. Para uma imagem de 20x desta densidade de fibras, coloque de 10 pixels a 15 pixels como ponto de partida.
  4. Selecione o Spline cúbico como modelo de gradiente e verifique a Caixa de Pesquisa de Cores. Defina a pesquisa de cores. Defina tanto o Matiz quanto a Saturação como Coherência e, em seguida, defina o Brilho como Imagem Original, hit Run.
  5. O arquivo de saída do plugin é o colormap RGB. Ajuste o valor da janela tensor local até que as regiões alinhadas, conforme determinado pelo olho, sejam devidamente destacadas com tons azuis e magentas.
  6. Uma vez que a imagem de saída seja satisfatória, separe esta imagem RGB em 3 canais. Selecione Imagem > Color > Split Channel.
  7. Para melhorar a aparência de regiões alinhadas com o propósito de mascarar, use a calculadora de imagem selecionando a Calculadora de Imagens processante >. Usando este operador, subtraia a imagem verde da imagem azul. Para uma máscara mais restritiva, subtraia a imagem verde da imagem vermelha. Para regiões aleatórias, subtraia o canal azul do canal verde.
  8. Limiar a imagem resultante usando o algoritmo Moments . Na maioria dos casos, isso não deve precisar de mais ajustes. No entanto, ajuste se necessário. Isso produzirá uma imagem binária.
  9. Uma vez feita a imagem binária, preencha os orifícios selecionando processe > Binário > preencher buracos entre fibras e arredondar os limites da máscara usando um filtro mediano. Um filtro mediano de 10 é um bom ponto de partida, ajuste-o para fazer um bom ajuste para os dados. Inspecione manualmente a máscara para obter concordância e remova quaisquer ROIs que estejam errados.
  10. Uma vez que a máscara seja satisfatória, crie uma seleção selecionando Editar > Seleção > Criar Seleção. Transfira esta seleção para o gerente do ROI.

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Representative Results

A instalação do MIW e o planejamento experimental básico são os primeiros passos nesse processo. Este projeto e protocolo MIW em particular são mais favoráveis aos estudos longitudinais19 e tem sido utilizado com sucesso com microscópios eretos e invertidos. Neste caso, um microscópio invertido foi usado, pois resultou em maior estabilidade de imagem da glândula mamária com menos artefatos respiratórios. Na Figura 1A, fornecemos as dimensões do MIW rígido e uma visão geral gráfica do processo de implantação.

Um campo de visão típico dentro de um tumor mamário MMTV-PyMT39 (Figura 1B-E, Figura 3A) é muito heterogêneo, composto por fibras de colágeno, numerosas células estrômicas, massas de células tumorais e vasculatura (Figura 3A). Em geral, as fibras de colágeno são mais abundantes perto da janela e diminuem em abundância mais profundamente no tumor (Figura 1B-E) A organização das fibras ao redor das massas tumorais também pode ser bastante variada, muitas vezes com regiões de organização mais aleatória no mesmo campo de visão que regiões de maior alinhamento (Figura 2D,H e Figura 3I).

Para desenvolver um pipeline de análise que possa segmentar dados intravitais em regiões perivasculares, tumor e estroma, este protocolo se concentrou no uso do sinal de NAD(P)H e SHG endógeno). Embora a identificação do tumor e do estroma possa ser simples, a identificação de regiões perivasculares dentro do microambiente tumoral pode ser desafiadora. A vasculatura muitas vezes reside dentro das fitas estreitas do sinal NAD(P)H reduzido entre as massas brilhantes de células cancerígenas NAD(P)H+. É importante notar que nem todas as fronteiras escuras abrigam vasculatura; em vez disso, algumas regiões escuras são simplesmente dobras tumorais ou a incha de lobos tumorais adjacentes (seta amarela, Figura 2G). Além disso, enquanto um olho temperado pode extrair os vasos sanguíneos de maior diâmetro do tumor, pois eles têm uma aparência distinta, essa distinção nem sempre é trivial. Isso é especialmente verdadeiro para vasos de menor diâmetro, onde sua aparência pode ser mais sutil e variável. Neste caso, o uso da fluorescência ao longo da vida de NAD(P)H pode auxiliar na identificação positiva da vasculatura (Figura 2B,F). A vida útil da fluorescência (FLIM) não mede a abundância ou intensidade dos fótons em um local, mas o tempo que leva para essas moléculas excitadas emitirem um fóton e decair em seu estado terrestre. Os glóbulos vermelhos (RBC) e o plasma de sangue têm mostrado ter uma vida de fluorescência caracteristicamente curta e distinta32,37 que pode ser aproveitada para a identificação e segmentação de vasos em tecidos.

Para determinar o quão bem a vida fluorescência de NAD(P)H identifica a vasculatura intravitalmente, um bolus de 100 μL de um dextran rotulado de rhodamina foi injetado na veia da cauda após a coleta da imagem FLIM. Comparações de projeções de intensidade máxima de NAD(P)H FLIM refletem de perto os vasos rotulados com um dextran fluorescentemente rotulado (Figura 2I-J). Repetindo essa abordagem em vários camundongos demonstrou que a área média da máscara da imagem FLIM sobre a área da máscara do Dextran foi de 78,6% ± 12,3% (Figura 2L). Enquanto a sobreposição não era 100%, essa técnica estava mapeando com precisão toda a rede vascular. As diferenças observadas nas áreas relatadas podem muitas vezes ser atribuídas a problemas de deriva intravital ou registro, diâmetros mais finos dos vasos devido à encaixe do modelo ou à perda de vasos finos devido à exclusão da RBC pela pressão da massa crescente. É importante ressaltar que essa técnica funciona igualmente bem na presença de fluoroforos geneticamente codificados como GFP ou modelos de tumores sem rótulos (Figura 2D,H), fornecendo assim um meio muito robusto e amplamente aplicável de identificar a vasculatura para segmentação de imagem.

Para delinear os limites das massas tumorais livres de rótulos, foi utilizada a autofluorescência NAD(P)H (Figura 1C). Isso pode ser capturado coletando independentemente uma imagem NAD(P)H ou somando os dados NAD(P)H FLIM para gerar uma imagem de intensidade. Qualquer rota permitirá a segmentação adequada do microambiente tumoral. Como observação geral, a excitação de dois fótons de NAD(P)H em células cancerosas provoca autofluorescência brilhante produzindo uma imagem que mostra células individuais nítidas com núcleos escurecidos (Figura 2E,G). Este padrão pode ser usado para definir a extensão da massa em crescimento. Embora o limiar simples baseado em intensidade de NAD(P)H seja possível definir o limite do compartimento tumoral, uma ferramenta de segmentação trainável geralmente tem melhor desempenho (Figura 3B,E). Algumas outras leituras comuns, como migração celular ou análise protrusiva celular, podem se beneficiar da fluorescência exógena geneticamente codificada dentro do modelo do camundongo ou da implantação de linhas celulares fluorescentes rotuladas (Figura 2A). Nesses casos, a tarefa de demarcar o limite da massa pode ser cumprida com simples limiar da proteína fluorescente. Às vezes, a expressão do fluoróforo pode se tornar bastante heterogedógena após a implantação. Isso não deve causar problemas de segmentação. Além disso, tem sido frequentemente observado que tumores criados por aloenxertos fluorescentes ou xenoenxertos têm regiões menos compartimentadas de fibras de colágeno do que tumores criados por modelos genéticos de tumores como MMTV-PyMT16.

O compartimento estromal abrange as regiões fora da massa crescente ou entre massas em crescimento, e uma máscara para o estroma é obtida invertendo o ROI tumoral (Figura 3B-F). O compartimento estromal pode então ser ainda mais compartimentalizado em sub-ROIs com base na arquitetura de fibra de colágeno. As fibras de colágeno são uma característica significativa no estroma e possuem uma grande diversidade de organizações de fibras, que são conhecidas por modular o comportamento celular40,41. Muitas vezes existem numerosas regiões locais (<100 μm) de fibras alinhadas ou aleatórias dentro da imagem16. Portanto, foram identificadas regiões de organização de fibras relativamente alinhadas (tons vermelhos/azuis) ou aleatórias (tons verdes) (Figura 3I) com o plugin OrientationJ. Utilizando o mapa de cores de coerência orientationj, máscaras baseadas na organização local de fibras podem ser criadas para fins de segmentação (Figura 3J). Essas máscaras podem então ser sobrepostas para analisar o comportamento de células estromal dinâmica diferencial (Figura 3K) devido aos efeitos da organização específica da fibra (Figura 3H,I).

Agora que os ROIs para os vários compartimentos do microambiente tumoral foram definidos, eles podem ser aplicados nos quadros individuais ou canais do filme timelapse intravital. Neste ponto, é importante enfatizar que todos os sinais mostrados na Figura 3A são derivados inteiramente de fontes endógenas. Esta imagem demonstra o rico potencial de pistas espaciais e contextuais que podem vir de fontes puramente endógenas, onipresentes e livres de rótulos. Aqui, utilizamos o modelo de tumor MMTV-PyMT como exemplo para ilustrar a aplicabilidade do método para quantificar o número e características dos macrófagos em locais específicos do microambiente tumoral (TME). Um estudo intravital anterior42 mostrou que as células que emitem altos níveis de autofluorescência FAD (Figura 3A, células magenta, setas amarelas) mancham positivamente com anticorpos F4/80 e representam uma população de macrófagos dentro do TME. Usando este fluxo de trabalho para segmentar a imagem, é possível examinar com eficiência e precisão o número, monitorar as interações célula-célula ao longo do tempo, ou mesmo observar as características metabólicas deste subconjunto de macrófagos (magenta) dentro de diferentes compartimentos do TME (Figura 3A, setas amarelas). Por exemplo, o comportamento de macrófagos de alta modus polegadas que residem especificamente dentro do ninho tumoral nad(P)H-high pode ser caracterizado (Figura 3E). Da mesma forma, podem ser examinados os comportamentos dos macrófagos em relação à organização local das fibras na região do estroma. Alguns relatórios recentes indicaram que macrófagos e outras células migratórias no estroma respondem a sinais mecânicos de seu microambiente local 16,43,44. Utilizando as máscaras de alinhamento de fibras produzidas por este método, é possível examinar seus comportamentos diferenciais entre regiões de organizações aleatórias e alinhadas de colágeno. Por fim, essa mesma análise focada também pode ser aplicada para determinar o número e o comportamento dos macrófagos localizados dentro de uma proximidade definida com a vasculatura. Na Figura 3G, a vasculatura pode ser vista em vermelho, e macrófagos podem ser vistos novamente em magenta. Uma máscara para a vasculatura usando NAD(P)H FLIM foi criada e, em seguida, expandida através da dilatação de 10 pixels. A distância escolhida foi arbitrária para fins de demonstração, mas pode ser otimizada para as necessidades particulares do experimento individual. É importante ressaltar que, embora esta imagem seja de uma única fatia z, este procedimento pode ser facilmente extrapolado para pilhas 3D para observar o comportamento em torno de todo o volume da nave.

Figure 1
Figura 1: Resumo gráfico da implantação da janela mamária e a organização subjacente de um tumor MMTV-PyMT. (A) As dimensões da janela de imagem mamária e do esquema para o processo geral de implantação. (B-E) Esta é uma montagem de um representante de tumor MMTV-PyMT sem rótulos a partir de 50 μm abaixo da superfície do MIW e continuando a uma profundidade de 80 μm. Os valores de profundidade são fornecidos abaixo de cada imagem. As fibras de colágeno (cinza) são mais prevalentes na superfície do tumor (NAD(P)H, azul) do que em profundidades maiores. Barra de escala 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagem intravital representativa de um tumor PyMT rotulado e sem rótulos e validação de NAD(P)H FLIM como marcador para a vasculatura. Uma imagem composta (A) de um aloenxerto típico de células GFP-4T1 na almofada de gordura mamária e um tumor mamário representativo de um modelo de tumor MMTV-PyMT (E). NAD(P)H FLIM mapeia a vasculatura em ambos os modelos (B,F). Fluorescência GFP (C) e autofluorescência NAD(P)H (G) foram utilizadas para identificar o tumor. O colágeno foi visualizado por SHG (D,H). Uma imagem composta usando NAD(P)H FLIM para identificar vasculatura foi validada comparando projeções de intensidade máxima da pilha intravital antes e depois da injeção da veia da cauda do dextran fluorescente (I,J,K). A quantificação da razão da área determinada por NAD(P)H FLIM sobre a área identificada pela injeção de dextran em quatro camundongos (a cor identifica camundongos individuais) e vários campos de visão (pontos individuais no gráfico) é mostrada em (L). Barras de escala 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Segmentação de imagem representativa usando fluorescência endógena dentro do tumor PyMT sem rótulo. Uma imagem composta (A) de uma única fatia z de um tumor mamário típico de PyMT foi coletada usando apenas sinais intrínsecos. SHG (cinza) visualiza as fibras de colágeno do tumor. A imagem de fluorescência ao longo da vida da autofluorescência NAD(P)H (Tau (τ) significa) relata as assinaturas metabólicas das células (tons verde-laranja) e a localização dos vasos sanguíneos (vermelho). A autofluorescência FAD (magenta) identifica macrófagos. Utilizando o esquema de segmentação descrito neste protocolo, o tumor sem rótulos foi segmentado em compartimentos para o ninho tumoral (B,E), stroma (C,F) e vasculatura (D,G) utilizando apenas autofluorescência SHG e NAD(P)H). As fibras de estroma e colágeno (H) também podem ser classificadas em regiões locais de fibras alinhadas ((mostradas em magenta/azul), J,K). Barras de escala 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Dados Suplementares 1: Conjunto de dados representativos de1% do NAD(P)H FLIM. Esta é uma projeção de intensidade máxima de um A1% ajustado de um conjunto de dados típico. É um representante da qualidade de identificação possível e um nível típico de fundo antes de usar o classificador de classe. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Modelo suplementar: Classificador representativo utilizado no ajuste A1% para a identificação da vasculatura. Este é um modelo de classificação de amostra para uso no plugin de segmentação WEKA treinável dentro do ImageJ. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

A imagem intravital 4D é uma ferramenta poderosa para investigar interações fisiológicas dinâmicas dentro do contexto espacial e temporal do microambiente tumoral nativo. Este manuscrito fornece uma estrutura operacional muito básica e adaptável para compartimentar interações celulares dinâmicas dentro da massa tumoral, do estroma adjacente ou nas proximidades da rede vascular usando apenas sinais endógenos de segunda geração harmônica ou autofluorescência NAD(P)H). Este protocolo fornece um método abrangente, passo a passo, desde a implantação da janela de imagem até a aquisição, análise e segmentação de imagens. Acreditamos que essa técnica contribuirá para uma estrutura de análise necessária para segmentar e quantificar dados intravitais 4D.

Este protocolo foi desenvolvido para ser amplamente compatível com inúmeros modelos de mouse intravital, incluindo modelos PDX não rotulados. PDX's são um modeloincrivelmente informativo 45, mas representam um desafio para a imagem intravital porque a natureza do modelo PDX não é adequada para manipulação genética. Portanto, seria bastante vantajoso ter um método que possa visualizar e compartimentar interações dinâmicas dentro de seu ambiente fisiológico não rotulado usando metabólitos exclusivamente endógenos como NAD(P)H e segunda geração harmônica (SHG). Além de vantajosa para modelos PDX, essa abordagem multidimensional poderia ser teoricamente aplicada a qualquer estudo intravital em tecido cancerígeno ou normal que precise de contexto espacial e estrutural para abordar uma questão fisiológica. A autofluorescência NAD(P)H e o SHG das fibras de colágeno são onipresentes para todos os tecidos e representam um recurso universal e livre nas coleções intravitais. Esta abordagem FLIM também é robusta, pois pode identificar a vasculatura na presença de fluorescência de fontes exógenas como a GFP. Essa abordagem também é vantajosa porque a emissão de SHG e NAD(P)H pode ser visualizada no espectro azul, residindo assim em um comprimento de onda que não é normalmente usado na imagem de construtos de fusão fluorescente que podem ser necessários de outra forma para o estudo.

O aspecto dessa abordagem que é nova e tem valor agregado particular é a identificação livre de rótulos da vasculatura. Embora outras abordagens possam funcionar, o uso da fluorescência ao longo da vida de NAD(P)H facilmente fornece uma assinatura clara sem a necessidade de rotulagem adicional. Os dados mostram que os vasos definidos ao longo da vida refletem a vasculatura rotulada a partir da injeção de veias traseiras do dextran fluorescente, o padrão ouro para a imagem de vasculatura. Nossa técnica se destaca em visualizar vasos sanguíneos menores em comparação com a simples excitação de dois fótons ou três fótons, onde vasos maiores são facilmente visualizados, mas os menores requerem mais experiência para identificar. A assinatura vitalícia é inequívoca para todos os vasos, independentemente do tamanho. Além disso, essa aquisição adicional de NAD(P)H FLIM pode ser facilmente combinada com outros marcadores para a segmentação do microambiente tumoral. Através de uma única aquisição FLIM de NAD(P)H, os requisitos para definir a vasculatura, ninho de tumor e estroma são alcançáveis. A coleção FLIM pode ser incorporada ao projeto experimental existente, coletando uma única aquisição no final ou início de uma série temporal ou intercalando as coleções durante toda a aquisição 4D. A determinação da quantidade adequada de imagens FLIM dependerá de necessidades e restrições experimentais específicas, como intervalos de aquisição, duração experimental ou estabilidade de imagem, mas no mínimo, uma coleção FLIM por série 4D será necessária para este método.

Este processo de utilização do NAD(P)H FLIM para a identificação da vasculatura requer a adequação matematicamente dos dados FLIM a uma função exponencial da forma

Equation 1

com A1+A2+A3=1. Enquanto a maioria das imagens de vida de NAD(P)H relatadas na literatura são encaixadas como um bi-exponencial, nesta aplicação NAD(P)H foi montado como um tri-exponencial onde os τ1 e τ2 são definidos para os valores relatados de RBC e τ3 é permitido flutuar. É importante ressaltar que o objetivo não é alcançar o valor mais preciso da vida, mas sim fornecer uma imagem ideal para segmentação. Quando os valores de τ1 e τ2 são inicialmente fixados nos valores relatados dos32,46 da RBC e a matriz é calculada, os vasos sanguíneos se destacarão com valores de1% superiores a 60% nos vasos sanguíneos e valores de1% geralmente inferiores a 40% no tumor adjacente. O próximo passo é tentar maximizar o A1% nos vasos sanguíneos, minimizando o A1% no tumor adjacente. Trata-se de um processo iterativo, e ao final dele, os valores A1% dos vasos sanguíneos serão superiores a 90% com os valores A1% do tumor inferiores a 10%. Uma vez que os valores A1% dos vasos sanguíneos são uniformemente altos e o fundo é uniformemente baixo, exporte esses arquivos A1% em uma ferramenta de segmentação trainável. Isso removerá rapidamente qualquer ruído restante e definirá o ROI para a vasculatura.

Como a almofada de gordura mamária está localizada fora da cavidade corporal, a cirurgia é minimamente invasiva, e os melhores resultados são obtidos através da implantação do MIW sobre a glândula mamária4ª inguinal. O tempo de implantação da janela e quando o experimento será conduzido é crítico. É melhor permitir que 24 - 48h de cura pós-cirurgia antes do ponto de tempo fisiológico que será investigado. Enquanto o procedimento em si requer apenas uma pequena incisão (≈ 10 mm) para inserir a janela (Figura 1A), o tempo de cura pós-cirurgia permitirá que qualquer inflamação e fluidos que se acumularam devido ao processo de implantação se limpem. Além disso, também permitirá que o tumor continue a crescer na janela. Ambos os fatores melhorarão a qualidade geral da imagem, diminuindo a opacidade/dispersão e aumentando a estabilidade da imagem. A próxima coisa a considerar é a duração total planejada do experimento. Embora essas janelas tenham sido projetadas para estudos longitudinais, a natureza rígida da janela incorre em um limite de tempo de 2 a 3 semanas. Depois desse tempo, a janela tende a se desalojar da camada dérmica, contaminando e terminando o experimento. Se não for necessário um estudo longitudinal da glândula mamária, outros métodos intravitais como um procedimento terminal de retalhosde pele 22 que elimina a implantação cirúrgica de um MIW podem ser uma opção melhor. O procedimento de retalho de pele proporciona melhor acesso a toda a glândula, pois não é restringido pela colocação e dimensões do MIW, e pode produzir maior estabilidade de imagem à medida que a glândula é afastada da cavidade corporal. Independentemente da abordagem de imagem intravital, a segmentação do microambiente usando fluorescência endógena ainda é amplamente aplicável para análise de imagem subsequente. A última coisa a considerar é a duração do experimento de imagem individual. Não é razoável adquirir filmes com duração de 6-8 h. No entanto, durante as coletas mais longas, a hidratação se torna um problema, e é necessário um acompanhamento próximo da saúde do camundongo.

Uma vantagem significativa deste método é que as várias imagens de fluorescência endógena necessárias para a segmentação do microambiente tumoral podem ser coletadas com relativa facilidade e sem manipulações adicionais ao camundongo. Com a combinação filtro/dicroica relatada aqui (Tabela de Materiais), ambas as imagens SHG e NADH podem ser adquiridas com o mesmo conjunto de filtros alternando comprimentos de onda de 890 nm a 750 nm. Embora isso crie um atraso de aquisição, não afeta a segmentação subsequente de imagens. Também é importante lembrar que este método representa um mero ponto de partida para uma técnica de segmentação usando fluorescência endógena, e configurações ópticas mais avançadas podem permitir aquisições simultâneas, se necessário.

Há limitações do uso da FLIM para identificar a vasculatura. A abordagem FLIM requer eletrônica especializada, instrumentação e expertise para coleta. No entanto, todos esses requisitos estão cada vez mais integrados aos microscópios modernos e mais disponíveis através do uso de instalações de núcleo de imagem. A FLIM tornou-se uma tecnologia madura e adquirir bons dados não requer muito treinamento. Uma segunda limitação é que as aquisições da FLIM são demoradas. Embora a taxa de quadros de uma imagem coletada com dextran fluorescente seja de cerca de um segundo ou menos, a coleção média de FLIM pode variar de 60 s a 120 s, o que pode ser proibitivo se os pontos de tempo fisiológicos forem menores do que isso. A identificação FLIM da vasculatura não se destina a substituir toda a veia da cauda injetada dextran fluorescente ou excitação multifotônio da vasculatura; em vez disso, é mais uma abordagem na caixa de ferramentas em crescimento para imagens intravitais. Além disso, prevemos que os tempos de aquisição mais longos serão drasticamente menores nos próximos anos. Os detectores e eletrônicos estão melhorando rapidamente, diminuindo o tempo de morte do detector e, assim, exigindo períodos de aquisição mais curtos para capturar o mesmo número de fótons. Outra razão para ser otimista com tempos de aquisição mais curtos é o surgimento de software de aprendizado de máquina ou algoritmo de restauração de imagens como o CSBDeep47. Esses algoritmos potencialmente poderiam ser treinados para trabalhar com tempos de exposição mais curtos, reduzindo assim o número de fótons necessários para identificar estruturas com precisão para fins de segmentação. Juntos, isso poderia reduzir rapidamente os prazos necessários para essas aquisições multidimensionais.

O uso de imagens intravitais só se tornará mais importante à medida que os pesquisadores tentarem desvendar as muitas interações células-células complexas e matrizcelular que ocorrem dentro do microambiente do tumor fisiológico. Portanto, são necessários desenvolvimentos contínuos nas capacidades de aquisição, segmentação e análise. Para isso, é importante não ignorar o potencial da fluorescência endógena para a segmentação de microambientes. Neste protocolo, o sinal endógeno de SHG e metabólitos de fluorescência, incluindo intensidade NAD(P)H e FLIM, foi utilizado para fins de segmentação durante a imagem intravital do TME mamário. Outros metabólitos endógenos ou propriedades intrínsecas podem fornecer sinais adicionais para revelar a reciprocidade dinâmica das células tumorais e do microambiente. Por exemplo, fad pode ser usado para monitorar o movimento de populações imunes42, geração 3P pode destacar características estruturais como membranas plasmáticas ou adiposa36, e a fluorescência de elastina pode ser usada para separar artérias das veias46. Portanto, a fluorescência endógena continuará a fornecer uma rica plataforma multidimensional que deve ser utilizada ao máximo à medida que a comunidade de pesquisa continua a construir a caixa de ferramentas para segmentação e análise de microambientes intravitais.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de reconhecer as subvenções NCI R01 CA216248, CA206458 e CA179556 para financiar este trabalho. Também gostaríamos de reconhecer o Dr. Kevin Eliceiri e seu grupo de imagens por sua experiência técnica no desenvolvimento precoce do nosso programa intravital. Agradecemos também ao Dr. Ben Cox e outros membros do Grupo de Fabricação Eliceiri do Instituto morgridge de pesquisa por seu design técnico essencial durante as fases iniciais do MIW. Ellen Dobson ajudou com conversas úteis sobre a ferramenta de segmentação WEKA capacitável ImageJ. Além disso, gostaríamos de agradecer à Dra. Por último, gostaríamos de agradecer à Dra.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 12mm round cover glass Warner Instruments # 64-0712 MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection BD 309659 Syringe
20x objective Zeiss 421452-988 Water immersion
27G needle for SQ injection Covidien 1188827012 Needle
40x objective Nikon MRD77410 Water immersion
5-0 silk braided suture Ethicon K870 Suture for MIW implantation
Artificial tears gel Akorn NDC 59399-162-35 Eye gel
Betadine solution, 5% Fisher Scientific NC1558063 Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator Fisher Scientific 23-400-101
Cyanoacrylate adhesive Loctite 1365882 MIW construction
fluorescent dextran Sigma T1287-50mg intravenous labelling of vasculature
forceps Mckesson.com Miltex #18-782 stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube Hamamatsu 
heating blanket CARA 72 heating pad  038056000729 Temperature selectable
heating chamber home built
Fluorescent lifetime handbook Becker and Hickl https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base Nikon
Isoflurane Akorn NDC 59399-106-01 Anesthesia
Liqui-Nox Fisher Scientific 16-000-125 MIW cleaning
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10 Analgesic
Micro Hose Scientific Commodities INC.  BB31695-PE/1
multiphoton scan head Bruker Ultima II Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter Chroma 284994 ET 440/80 m-2P
Nair CVS 339826 Depilatory cream
objective heater Tokai Hit STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter Chroma 320740 ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner Amazon.com B00814ME24 Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board Becker and Hickl
surgical light FAJ B06XV1VQVZ Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors Excelta 366 stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment Actavis Pharma NDC 0472-0179-34 Antibiotic
TV catheter Custom BD 30G needle: 305106 Catheter for TV injection
Two photon filter Chroma 320282 ET585/65m-2P
two-photon laser Coherent charmeleon Tunable multiphoton laser
ultrasound gel Parker PKR-03-02 Water immersion gel
Urea crystals Sigma U5128-5G Optional: FLIM IRF

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References

  1. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
  2. Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
  3. Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
  4. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120 (2020).
  5. Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
  6. Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
  7. Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173 (2020).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
  9. Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
  10. Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
  11. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  12. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
  13. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
  14. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
  15. Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
  16. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  17. Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
  18. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  19. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490 (2019).
  22. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  23. Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
  24. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  25. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  26. Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
  27. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  28. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  29. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007 (2014).
  30. Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  31. Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
  32. Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
  33. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  34. von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), New York, N.Y. 925-938 (2013).
  35. Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
  36. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125 (2018).
  37. Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
  38. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), Oxford, England. 2424-2426 (2017).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  41. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  42. Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086 (2016).
  43. Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787 (2020).
  44. Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850 (2019).
  45. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
  46. Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171 (2017).
  47. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).

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Pesquisa sobre câncer edição 183
Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário
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Burkel, B. M., Inman, D. R.,… More

Burkel, B. M., Inman, D. R., Virumbrales-Muñoz, M., Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (183), e63413, doi:10.3791/63413 (2022).

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