Summary
Den intravitala avbildningsmetoden som beskrivs här använder kollagen andra harmoniska generationen och endogen fluorescens från den metaboliska samfaktorn NAD (P) H för att icke-invasivt segmentera en omärkt tumörmikromiljö i tumör-, stromala och vaskulära fack för djupgående analys av 4D-intravitala bilder.
Abstract
Förmågan att visualisera komplexa och dynamiska fysiologiska interaktioner mellan många celltyper och den extracellulära matrisen (ECM) inom en levande tumörmikromiljö är ett viktigt steg mot att förstå mekanismer som reglerar tumörprogression. Även om detta kan åstadkommas genom nuvarande intravitala avbildningstekniker, är det fortfarande utmanande på grund av vävnadernas heterogena natur och behovet av rumsligt sammanhang inom den experimentella observationen. För detta ändamål har vi utvecklat ett intravitalt bildarbetsflöde som parar kollagen andra harmoniska generationens bildbehandling, endogen fluorescens från den metaboliska samfaktorn NAD (P) H och fluorescens livstidsavbildningsmikroskopi (FLIM) som ett sätt att icke-invasivt dela upp tumörmikromiljön i grundläggande domäner i tumörboet, den omgivande stroma eller ECM och vaskulaturen. Detta icke-invasiva protokoll beskriver steg-för-steg-processen som sträcker sig från förvärv av time-lapse-bilder av brösttumörmodeller till efterbehandlingsanalys och bildsegmentering. Den främsta fördelen med detta arbetsflöde är att det utnyttjar metaboliska signaturer för att kontextualisera den dynamiskt föränderliga levande tumörmikromiljön utan användning av exogena fluorescerande etiketter, vilket gör det fördelaktigt för humana patient-härledda xenograftmodeller (PDX) och framtida klinisk användning där yttre fluoroforer inte är lätt tillämpliga.
Introduction
Den extracellulära matrisen (ECM) i tumörmikromiljön är känd för att vara dynamiskt deponerad och ombyggd av flera celltyper för att ytterligare underlätta sjukdomsprogression 1,2,3. Dessa matrisförändringar ger både mekaniska och biologiska signaler som förändrar cellbeteendet och resulterar ofta i en fortsatt cykel av matrisombyggnad4. Undersökning av det dynamiska, ömsesidiga samspelet mellan tumörceller och den extracellulära matrisen utförs ofta med hjälp av tredimensionell (3D) in vitro-odling eller mikrofluidiska system. Medan dessa bottom-up-metoder har visat mekanismer för ECM-ombyggnad 5,6,7, ökad proliferation8, epitel till mesenkymal övergång 9,10,11,12 och tumörcellmigration och invasion 7,13,14,15,16 har deras fokus främst legat på ett fåtal celltyper (t.ex. tumörceller eller fibroblaster) inom en homogen 3D-matris jämfört med mångfalden och heterogeniteten hos interaktioner som finns i en fysiologisk vävnad. Förutom in vitro-system kan ex vivo tumör histologi också ge viss inblick i dessa cell-cell- och cell-ECM-interaktioner17. Immunohistokemi har fördelen att kunna analysera flera celltyper med avseende på ECM: s rumsligt heterogena sammansättning och arkitektur, men de statiska slutpunkterna för fast vävnad fångar inte den dynamiska karaktären av interaktioner mellan celler och mikromiljön. Intravital avbildning har öppnat dörren för att förhöra olika och dynamiska interaktioner inom det fysiologiska sammanhanget för den inhemska tumörmikromiljön.
Kapaciteten hos intravital tumöravbildning utvecklas snabbt. Förbättringar i utformningen av bildfönster och kirurgiska tekniker för att implantera fönstren har möjliggjort långsiktig longitudinell tumöravbildning på en mängd olika anatomiska platser (dvs. primär tumör, lymfkörtlar, metastatiska platser 18,19,20). Dessutom blir kapaciteten hos optisk instrumentering att visualisera och samla in data i flera dimensioner (dvs. spektral, rumslig fluorescensintensitet och livslängd) och vid hög upplösning och hastighet (videohastighet) allmänt tillgänglig. Den förbättrade tekniken ger en möjlighet att utforska snabba förändringar i cellsignalering och fenotypisk dynamik inom en fysiologisk miljö. Slutligen möjliggör expansionen av optogenetiska verktyg och det stora utbudet av genetiska fluorescerande konstruktioner märkning av specifika celltyper för att fånga cellmigration i tumörmikromiljön eller cellspårning under utveckling eller sjukdomsprogression 21,22. Användningen av dessa verktyg i kombination med CRISPR/Cas9-teknik ger forskare möjlighet att generera unika djurmodeller i tid.
Medan alla dessa framsteg gör intravital avbildning till en allt kraftfullare metod för att utforska dynamiska och fysiologiska cellulära interaktioner, finns det fortfarande ett viktigt behov av att utveckla strategier som ger rumsligt, tidsmässigt och strukturellt sammanhang på vävnadsnivå till dessa biologiska interaktioner. För närvarande kompenserar många intravitala avbildningsstudier för bristen på visuella landmärken som blodkärl genom att injicera fluorescerande färgämnen i vaskulaturen eller använda musmodeller som exogent uttrycker fluorescerande proteiner för att avgränsa fysiska egenskaper. Injicerbara färgämnen och substrat som fluorescerande dextrans används i stor utsträckning för att framgångsrikt märka vaskulaturen i intravitala samlingar19, 23, 24. Detta tillvägagångssätt är dock inte utan begränsningar. För det första kräver det ytterligare musmanipuleringar och dess användbarhet är begränsad till kortsiktiga experiment. För longitudinella studier kan fluorescerande dextran vara problematiskt eftersom vi observerar ackumulering av dextran i fagocytiska celler eller diffusion i den omgivande vävnaden över tid25. Exogen fluorescerande proteininkorporering i musmodellen har presenterats som ett alternativ till fluorescerande dextrans men presenterar egna begränsningar. Tillgängligheten och mångfalden av exogena fluoroforer inom musmodeller är fortfarande begränsad och dyr att skapa. Dessutom, i specifika modeller, såsom PDX-modeller, är genetiska manipuleringar inte önskvärda eller möjliga. Det har också visats att närvaron av fluorescerande eller bioluminescerande proteiner i celler erkänns som främmande i musen, och inom immunkompetenta musmodeller minskar detta mängden metastasering på grund av svaret från värdimmunsystemet26,27. Slutligen upptar exogena fluorescerande proteiner eller fluorescerande färgämnen som används för rumslig kontext eller för att segmentera efterföljande data ofta primområden av ljusspektrumet som annars skulle kunna användas för att undersöka de fysiologiska interaktionerna av intresse.
Användningen av den inneboende signalen från ECM eller endogen fluorescens från celler i vävnaden representerar ett potentiellt universellt etikettfritt sätt att segmentera intravitala data för mer djupgående cellulär och rumslig analys. Andra harmoniska generationen (SHG) har länge använts för att visualisera ECM28. Med den efterföljande utvecklingen av viktiga verktyg för att hjälpa till vid karakteriseringen av fiberorganisationen 29,30,31 är det möjligt att karakterisera cellbeteende i förhållande till lokal ECM-struktur. Dessutom ger autofluorescens från den endogena metaboliten, NAD (P) H, ett annat etikettfritt verktyg för att dela upp tumörmikromiljön in vivo. NAD(P)H fluorescerar starkt i tumörceller och kan användas för att diskriminera gränserna för det växande tumörboet från dess omgivande stroma 21,32. Slutligen är vaskulaturen en viktig fysiologisk struktur i tumörmikromiljön och platsen för viktiga celltypsspecifika interaktioner 33,34,35. Excitationen av röda blodkroppar (RBC) eller blodplasma har använts för att visualisera tumörkärlen, och med hjälp av två- eller trefotonexcitation (2P; 3P) har mätningen av blodflödeshastigheter visat sig vara möjlig36. Men medan större blodkärl lätt kan identifieras med sina endogena fluorescenssignaturer, kräver identifieringen av subtila, variabla och mindre fluorescerande små blodkärl mer expertis. Dessa inneboende svårigheter hindrar optimal bildsegmentering. Lyckligtvis kan dessa källor till endogen fluorescens (dvs. röda blodkroppar och blodplasma) också mätas genom fluorescens livstidsavbildning37, som utnyttjar vaskulaturens unika fotofysiska egenskaper och representerar ett användbart tillskott till den växande intravitala verktygslådan.
I detta protokoll beskrivs ett arbetsflöde för segmentering av fyrdimensionell (4D) intravital avbildning som uttryckligen använder inneboende signaler som endogen fluorescens och SHG från förvärv till analys. Detta protokoll är särskilt relevant för longitudinella studier genom ett bröstavbildningsfönster där exogen fluorescens kanske inte är praktisk eller möjlig, vilket är fallet med PDX-modeller. Segmenteringsprinciperna som beskrivs här är dock i stort sett tillämpliga på intravitala användare som undersöker tumörbiologi, vävnadsutveckling eller till och med normal vävnadsfysiologi. Den rapporterade sviten av analysmetoder gör det möjligt för användarna att skilja cellulärt beteende mellan regioner med inriktade eller slumpmässiga kollagenfiberkonfigurationer, jämföra antal eller beteenden hos celler som bor i specifika regioner i tumörmikromiljön och kartlägga vaskulaturen till tumörmikromiljön med endast etikettfri eller inneboende signal. Tillsammans skapar dessa metoder en operativ ram för att maximera djupet av information som erhållits från 4D intravital avbildning av bröstkörteln samtidigt som behovet av ytterligare exogena etiketter minimeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som beskrivs godkändes av University of Wisconsin-Madisons institutionella djurvårds- och användningskommitté. Välbefinnande och smärtlindring i alla djurförsök är av största vikt. Således görs alla ansträngningar för att se till att djuret är bekvämt och välskött vid varje steg i proceduren.
1. Generering av fönstret för bröstavbildning (MIW)
- För att konstruera bröstbildsfönstret, tillverka en 14 mm ring av rostfritt stål av kirurgisk kvalitet.
- Rengör den bearbetade fönsterkarmen med en varm lösning av 5% rengöringsmedel, skölj i 10 minuter under rinnande avjoniserat vatten (DI), blötlägg i 100% etanol i 10 minuter och torka sedan under en värmelampa. Autoklavera den torkade MIW-ramen och lagra den för senare användning.
- Förbered MIW-täckglas enligt följande: Blötlägg det runda täckglaset #1.5 12 mm i 100% etanol i 10 minuter, torka under en värmelampa och fäst sedan på metallens MIW-ram med cyanoakrylatlim. Bota limet över natten.
- Rengör den monterade MIW av överflödigt lim med en acetonindränkt vattpinne och rengör genom att sänka ner den i 70% etanol i 10 minuter. Låt det rengjorda fönstret torka. Förbered MIW i förväg och förvara den i en steril petriskål före kirurgisk implantation.
2. Kirurgisk implantation av MIW
- Autoklaver kirurgiska verktyg och sanera ytor med 70% etanol innan operationen för fönsterimplantation påbörjas.
- Utför operation på en sanerad bordplatta med en uppvärmningsfilt täckt med ett sterilt fält. Ställ in värmefilten så att temperaturen som mäts ovanpå det sterila fältet är 40 °C.
- Använd extra kall belysning för att förhindra vävnadstorkning. Använd förstoringsglasögon för att underlätta det kirurgiska ingreppet. Använd personlig skyddsutrustning som består av en steril laboratorierock för engångsbruk, kirurgiska ärmar, handskar, ögonskydd och ansiktsmask enligt rekommendationerna i kirurgisk bästa praxis.
- Bedöva musen med en anestesiförångarmaskin med en isofluraninställning på 2,0% och en syreflödeshastighet på 2,0 L / min. Administrera smärtstillande medel (10 mg/kg meloxikam) genom subkutan injektion.
OBS: Ge ytterligare doser inom de första 24 h, helst var 8-12 timmar under de första 2 dagarna efter operationen. - När den är sövd (bekräftad av inget svar på tå-nypa), applicera en fuktgivande ögongel för att förhindra torkning av ögonen. Använd en hårborttagningskräm för att ta bort päls på operationsplatsen (4: e inguinal bröstkörteln) följt av sköljning med steril vattendränkt gasbindning.
- Förbered det depilerade kirurgiska stället för operation genom att sanera hudytan med 3 alternerande betadin- och etanolskrubb.
- För att påbörja operationen, lyft försiktigt huden över den 4: e bröstkörteln nummer 4 med pincett. När huden har dragits bort från kroppsväggen, ta bort en ~ 1 mm sektion av det dermala skiktet vid spetsen av pincetten med kirurgisk mikrosax. Om blödning uppstår, applicera försiktigt tryck med steril gasbindning tills blödningen slutar.
OBS: I allmänhet har större tumörer en större potential att blöda än mindre tumörer eller normala vävnader. - Lossa bröstkörteln från det dermala skiktet med mjuka rörelser av tången vid den kirurgiska öppningen för att undvika att skära den underliggande körteln.
- Skapa ett snitt på 10 mm och släpp bröstkörteln från det dermala skiktet i periferin så att suturer kan placeras utan att tränga in i bröstkörteln. Tillsätt PBS för att täcka den exponerade körteln / tumören och för att förhindra torkning.
- Skapa en snörpvadssträngsutur längs öppningens periferi med 5-0 silkeflätad sutur. Sätt i en kant på MIW så att det dermala skiktet engagerar sig i MIW: s mottagande hack.
- Sträck försiktigt epitelet på motsatt sida av MIW och tryck metallen MIW på plats så att det dermala skiktet helt engagerar mottagningsskåran runt hela MIW-omkretsen. Fäst handväskans snöre tätt för att dra in det dermala lagret i skåran och binda av det för att helt säkra MIW.
- Lägg till ett aktuellt antibiotikum till det dermala skiktet vid MIW och övervaka kontinuerligt musen tills den har återfått tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal belastning. Hus den MIW-implanterade musen separat på mjuka sängkläder med en igloo placerad i buren och låt musen återhämta sig i 48 timmar före avbildning.
3. Positionering och underhåll av musen på mikroskopstadiet för avbildning
- Ställ in värmekammaren på mikroskopsteget. Använd ett tvångsluftssystem inställt på 30 °C eller något annat liknande system. Använd en objektiv värmare för att undvika drift i z-fokus. Låt systemet komma i jämvikt i minst 1 timme före avbildning.
OBS: Bedövade möss är oförmögna att korrekt bibehålla sin kroppstemperatur, och därför är det nödvändigt att ha en uppvärmd miljö för eventuella time-lapse-förvärv . Den objektiva värmaren hjälper till att bekämpa effekterna av termisk expansion, ett fenomen som orsakar drift i z-fokus när objektivlinsen och vävnaden som avbildas kommer till termisk jämvikt. - När värmekammaren på mikroskopet har stabiliserats vid 30 °C, bedöva mottagarmusen med anestesimaskininställningar på 2% isofluran och syreflödeshastighet på 2 L/min.
- När musen är sederad (bekräftad av inget svar på tåklämman), rengör utsidan av MIW-glaset med en bomullsapplikator och glasrengörare, tillsätt ögonsalva för att förhindra torkning och sätt in en svansvenkateter om det behövs.
- För att upprätthålla korrekt hydrering, ge en initial injektion av 0,5 ml PBS subkutant eller 100 μL genom svansvenkatetern. Upprepa varannan timme under hela bildsessionen.
- När musen har förberetts ordentligt ställer du in mikroskopet för bildbehandling. För att minska avdunstningen under time-lapse-mätningar, använd en vattenbaserad gel istället för vatten för nedsänkningsmediet. Detta bör göras innan du placerar musen på scenen. Se materialförteckningen för detaljer om de optiska komponenterna.
- Lägg musen på mikroskopsteget, montera isofluranslangen och tryck in MIW:s krage i ett 14 mm mottagningshål i sceninsatsen för att stabilisera bilderna. Sätt bildfältet i fokus med hjälp av mikroskopokularen och använd ljusfältsbelysning för att observera vaskulaturen med blodflödet.
- Kontrollera synfältets stabilitet. Om andningsrörelseartefakter är närvarande, applicera mild kompression på baksidan av körteln med ett litet skumblock och en cincture-liknande bit tejp. När kompression har applicerats, kontrollera att blodflödet upprätthålls i hela synfältet.
- Justera regelbundet isoflurannivåerna i steg om 0,25% under avbildningssessionen för att upprätthålla en korrekt sederingsnivå genom att manuellt räkna djurens andning.
- Håll en hastighet på 36-40 andningsningar per minut (rpm) för att förbättra djurens livslängd och optisk bildbehandling. Lägre andningsfrekvenser kan leda till att musen inte överlever experimentet, medan andningshastigheter över 60 rpm kan resultera i dålig sedering, vilket kan öka andnings- och rörelseartefakterna i bilddata.
4. Ställ in för 4D, intensitetsbaserad, etikettfri intravital avbildning av dynamiskt cellbeteende
- När musen är sederad och säkert placerad på det inverterade mikroskopstadiet, börja lokalisera intressanta regioner.
- Använd en ljuskälla riktad mot MIW, använd mikroskopets okular för att identifiera potentiella områden för undersökning. Lägg till och spara x, y-positionerna i programvaran för att återgå till dessa positioner.
OBS: De fina detaljerna i tumören kommer inte att vara lätt synliga med denna typ av belysning. Målet är helt enkelt att identifiera regioner för vidare utredning. Fokus ligger på att se vaskulatur och blodflöde. - När flera positioner har sparats i programvaran förhandsgranskar du de valda synfälten med 890 nm excitation och FAD/SHG-filterkuben. Använd en maximal uppehållstid på 4 μs med lägre effekt och hög PMT-inställning. Målet är att förhandsgranska synfälten utan att överexponera vävnaden för överdrivet laserljus.
- När lämpliga effektnivåer har ställts in ställer du in z-staplarna. Observera utseendet på rikliga kollagenfibrer (SHG) vid 20-50 μm under glasytan på MIW. Kollagen kommer att bli mindre utbrett när mikroskopsektionerna djupare in i tumören (Figur 1B). Tomrum i SHG avslöjar platsen för tumörmassor.
- Ställ in den övre z-skivan, under skiktet av ensamma celler där de första kollagenfibrerna visas vid ~ 50-100 μm. Ställ in den nedre z-skivan på ~ 250 μm, där fibrerna bleknar ut och den dåliga signalen dominerar. Upprepa detta för alla x-y-positioner som sparats.
- När z-stack-intervallet är inställt, öka uppehållstiden (upp till 8 μs) och optimera effekt- och detektorinställningarna. Optimera effektnivåerna efter behov för att excitera vävnaden för varje experiment. Att använda effekter upp till 90 mW vid 750 nm eller 70 mW vid 890 nm vid målets bakre bländare ligger inom ett acceptabelt intervall.
OBS: Bilddjupet, mängden spridning i vävnaden, objektiva egenskaper och detektorkänslighet kommer alla att väsentligt påverka mängden kraft som behövs för att få en bild. - Justera tidsintervallen enligt experimentella mål. Börja med 10 minuters intervall mellan insamlingsplatserna för de flesta intravitala migreringsfilmer.
- Även om 2P-excitation är skonsam mot celler och vävnader, var medveten om tecken på fototoxicitet, som cellblebbing eller snabbt ökande autofluorescens och överdriven fotoblekning. Minska lasereffekten eller öka timelapse-intervallen som förhållandena indikerar.
5. Fluorescens livstidsavbildning (FLIM) av NAD(P)H
- Samtidigt som du bevarar x-y-positionerna från timelapse-förvärven, ställ in mikroskopet för att samla in en FLIM-stack. Sätt i ett 440/80-filter i en filterhållare framför GaAsP-detektorn och ställ in GaAsP-detektorspänningen till 800 i programvaran. Släck rumslamporna när detektorerna är på.
- I programvaran växlar du från galvanometerbaserad intensitetsavbildning till ett FLIM-bildläge.
- För att identifiera och maskera vaskulaturen, ställ in upplösningen på 512 x 512 pixlar. För att samla in kompletterande metabolisk information, ställ in upplösningen på 256 x 256 pixlar för att öka den tidsmässiga upplösningen för livstidssignaturen. Ställ in uppehållstiden på 4 μs och ställ in lasern till 750 nm.
- Börja förhandsgranska skanningen och börja justera lasereffekten. Justera lasereffekten tills avläsningen för den konstanta fraktionsdiskriminatorn (CFD) är mellan 1 x 105 och 1 x 106. Överskrid inte 1 x 106 eftersom detta kommer att resultera i fotonhög och dåliga övergripande resultat.
- När effektnivån är inställd ställer du in integrationstiden mellan 90 s och 120 s och startar FLIM-samlingen. Det kommer att förvärva fotoner från synfältet för den tilldelade tiden.
- Valfritt: När alla nödvändiga samlingar har gjorts och musen har tagits bort från scenen, samla in en instrumentresponsfunktion (IRF). Mät IRF genom att avbilda ytan på kommersiellt tillgängliga ureakristaller i en glasbottenskål med samma parametrar och ställa in som används för att avbilda vävnaden.
OBS: IRF står för eventuella förseningar eller reflektioner på grund av den elektroniska eller optiska installationen. IRF är invecklad i alla FLIM-förvärv, och att dekonvolvera den från data kan förbättra noggrannheten hos beräknade fluorescenssornedfallskurvor. Med det sagt kan de beräknade IRF: erna ofta rimligen replikera kvaliteten på fluorescensförfallskurvorna från uppmätt IRF. Det är god praxis att mäta IRF tills det har fastställts att den beräknade IRF kommer att ge ekvivalenta anfall av sönderfallskurvorna och på ett adekvat sätt approximera resultaten från den uppmätta IRF.
6. Analys av NADH Lifetime-bilder
- Öppna FLIM-programvaran och importera NAD(P)H-livstidsavbildningen från datauppsättningen. För mer information om hur du använder programvaran på rätt sätt, se de fluorescerande livstidshandböckerna (se Materialtabell).
- Börja med att definiera modellparametrarna i programvaran. Klicka på Alternativ > modell i menyraden. Markera följande rutor: Inställningar > Multi-Exponential Decay, Fit Method > MLE, Spatial Binning > Square, Threshold > Peak och markera Fix Shift Before Calculation Image.
- Klicka på Färg > A1 % i menyraden i rullgardinsmenyn. På höger sida av fönstret definierar du det som en trekomponentpassning. Ställ in lagerplatsstorlek > 3.
- Justera tröskelvärdet > ~ 10. Omvärdera tröskelvärdets noggrannhet efter att sönderfallsmatrisen har beräknats för första gången.
- Fixa τ1 till 200 ps. Detta representerar den korta livslängden för röda blodkroppar. Försök hitta det värde som bäst matchar flera fläckar i det större blodkärlet, vilket kan ses i intensitetsbilden. Fixa τ2 till 1200 ps. Detta representerar den långa livslängden för röda blodkroppar.
OBS: De inställda värdena är bara utgångspunkten. Värdena måste optimeras för att få fram vaskulaturen mer. I de flesta fall, men inte alltid, kommer dessa värden att minska. - Under Beräkna i menyraden väljer du Decay Matrix. Detta kommer att generera en initial A1% livstidsbilder med vaskulaturen med höga värden. Använd markören (hårkors) för att sväva över vaskulaturen. Systematiskt och en i taget, flyta (avmarkera rutan Fix ) τ1 och τ2. Spela in dessa värden eftersom de hjälper till att optimera de fasta parametrarna.
OBS: Målet är inte nödvändigtvis att få de mest exakta värdena i bilden, utan snarare att maximera skillnaden mellan vaskulaturen och vävnaden utan att dramatiskt minska det område som identifieras som vaskulatur. - När lämpliga parametrar för τ1 och τ2 har identifierats väljer du Beräkna > Batchbearbetning i menyraden. Kontrollera att de flesta inställningar är likartade mellan z-skivor.
- Se till att verifiera att det inte finns någon inställning som är grovt annorlunda än de andra. Om så är fallet, justera skiftet först och försök igen. Om problemet kvarstår kan du återställa med nya parametrar. En felaktig förskjutning kan vara en stor orsak till buller i passformerna och kan öka A1% värden i de intilliggande tumörregionerna.
- Spara filerna på menyfliken och exportera sedan A1% -filer. Ladda upp dessa filer i ImageJ för maskering och segmentering.
7. Bildsegmentering av vaskulaturen
- Öppna ImageJ och importera A1% -bilden som en textbild. Upprepa detta för alla bilder i stacken.
- När alla A1% -bilder har öppnats väljer du Image > Stack > Z-Project. Använd Max Intensity Projection och spara bilderna. Se Kompletterande data 1 för en representativ bild.
- Gå till Plugins > Segmentering. Välj det träningsbara PLUGIN-programmet WEKA segmentering38.
- När WEKA-fönstret öppnas använder du standardinställningarna och börjar träna programvaran genom att skapa två klasser och spåra linjer över vaskulaturen (höga A1% -regioner) och icke-vaskulatur (låga A1% -regioner).
- Fortsätt att lägga till nya spår till de två klasserna tills programvaran konsekvent identifierar de höga A1% -regionerna i vaskulaturen samtidigt som du eliminerar eventuella högre regioner med bakgrundsbrus. Se Kompletterande modell för representativ klassificeringsmodell.
- När den klassificerade bilden har producerats klickar du på Bild > Typ > 8 bitar. Tröskel bilden och skapa en mask. Om den tröskelförsedda bilden fortfarande behöver rensas ytterligare använder du funktionen Analysera partiklar .
- Justera storleken och cirkulariteten tills eventuella mindre och cirkulära regioner i den tröskelvärdede bilden utesluts. En ren mask med endast vaskulaturen och mycket liten bakgrund erhålls.
- Klicka på Redigera > urval > Skapa urval. Överför valet till ROI-hanteraren genom att klicka på Analysera > verktyg > ROI-hanterare.
- Duplicera den klassificerade bilden. Fortsätt till Bearbeta > binär. Om du vill expandera masken och definiera avståndet från vaskulaturen som ska ingå i bildsegmenteringen väljer du Utöka. Upprepa tills masken har expanderat till önskat intervall. Registrera denna intressanta region (ROI) i ROI-hanteraren.
OBS: Målet med detta steg är att kvantifiera mängden eller beteendet inom en viss närhet av blodkärlet (till exempel antalet celler som finns i X μm av blodkärlen). Mängden utvidgning som krävs bestäms helt av den vetenskapliga frågan. - Om du vill kvantifiera antalet celler inom de restriktiva regionerna markerar du det fönster (bild/kanal) som är av intresse. Detta kan vara vilket fönster som helst som delar samma synfält som kärlmasken. Använd båda ROI: erna med XOR-funktionen från rullgardinsmenyn.
OBS: Denna operation kommer att mäta föremålen inom önskat avstånd från vaskulaturen, exklusive själva vaskulaturen. Denna kombinerade ROI-metod kan sedan användas för att mäta en mängd parametrar, såsom intensitet, cellnummer eller migrering.
8. Bildsegmentering av tumörboet
- Öppna NADH-bilden från antingen en högupplöst intensivskanning eller FLIM-samling i ImageJ.
OBS: Detta kan göras på enskilda z-skivor, fulla staplar eller appliceras på z-projektioner av några skivor. - Gå till Plugins > Segmentering. Välj det träningsbara plugin-programmet för WEKA-segmentering.
- När WEKA-fönstret öppnas använder du standardinställningarna och börjar träna programvaran i två klasser av NADH-höga regioner och NADH-låga regioner. DE NADH-höga regionerna kommer att ha ett mycket urskiljbart mönster av celler med kärnor och programvaran kommer lätt att identifiera det.
- Fortsätt att växla fram och tillbaka med överlägget för att förfina algoritmen med ytterligare träning tills den känner igen alla regioner i tumören som bestäms av ögat och förkunskaper om tumörmorfologi. Detta är en iterativ process.
- När algoritmen känner igen alla tumörens regioner väljer du knappen Skapa resultat . Detta kommer att producera en ny bild. Duplicera den här bilden.
- Välj den första duplicerade bilden och konvertera den till en 8-bitars bild genom att välja Bild > Typ > 8 bitar. Tröskel den här bilden för att skapa en binär mask. Skapa sedan ett urval och överför det till ROI-hanteraren. Dessa ROI:er definierar stroma.
- Välj den andra av den duplicerade bilden och konvertera den till en 8-bitars bild. Invertera den här bilden genom att välja Bild > Redigera > Invertera och tröskel sedan den här bilden för att skapa en binär mask. Skapa återigen ett urval och överför det till ROI-hanteraren. Denna ROI kommer att definiera tumörboet.
9. Bildsegmentering efter fiberorganisation eller justering
- Börja med att öppna SHG-bilderna, förbereda eventuell z-projektion och bedöma behovet av eventuell förbehandling. För bra resultat krävs högkvalitativa bilder med urskiljbara fibrer och lågt brus.
- Valfritt: För förbehandling i ImageJ för att öka signal-till-brus (SNR) för SHG-kanalen, subtrahera bakgrunden med hjälp av en rullande bollsubtraktion. För de flesta applikationer, använd en rullande bollsubtraktion mellan 20 pixlar och 50 pixlar. Släta sedan ut bilden och spara den.
- Öppna plugin-programmet OrientationJ och ställ in bearbetningsparametrarna. I fönstret OrientationJ definierar du storleken på det lokala tensorfönstret. För en 20x bild av denna fiberdensitet, ställ in 10 pixlar till 15 pixlar som utgångspunkt.
- Välj Cubic Spline som gradientmodell och markera rutan Färgundersökning. Definiera färgundersökningen. Ställ in både nyans och mättnad som koherens och definiera sedan ljusstyrkan som originalbild, tryck på Kör.
- Utdatafilen för plugin är RGB-färgkarta. Justera värdet på det lokala tensorfönstret tills inriktade områden, som bestäms av ögat, är korrekt markerade med blå och magenta nyanser.
- När utgångsbilden är tillfredsställande, separera denna RGB-bild i tre kanaler. Välj Bild > Färg > Delad kanal.
- Om du vill förbättra utseendet på justerade regioner i maskeringssyfte använder du bildkalkylatorn genom att välja Process > Bildkalkylator. Använd den här operatorn och subtrahera den gröna bilden från den blå bilden. För en mer restriktiv mask, subtrahera den gröna bilden från den röda bilden. För slumpmässiga regioner subtraherar du den blå kanalen från den gröna kanalen.
- Tröskel den resulterande bilden med hjälp av Moments-algoritmen . I de flesta fall bör detta inte behöva ytterligare justeringar. Justera dock om det behövs. Detta kommer att producera en binär bild.
- När den binära bilden är gjord fyller du hålen genom att välja Process > Binary > Fill Holes mellan fibrer och runda ut maskens gränser med hjälp av ett medianfilter. Ett medianfilter på 10 är en bra utgångspunkt, justera det för att passa bra för data. Kontrollera masken manuellt för överenskommelse och ta bort eventuella AVKASTNINGAR som är felaktiga.
- När masken är tillfredsställande skapar du ett urval genom att välja Redigera > Markering > Skapa markering. Överför det här valet till ROI-hanteraren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Installationen av MIW och grundläggande experimentell planering är de första stegen i denna process. Denna speciella MIW-design och protokoll är mer mottagliga för longitudinella studier19 och har framgångsrikt använts med både upprättstående och inverterade mikroskop. I detta fall användes ett inverterat mikroskop eftersom det har resulterat i större bildstabilitet hos bröstkörteln med färre andningsartefakter. I figur 1A ger vi dimensionerna på den styva MIW och en grafisk översikt över implantationsprocessen.
Ett typiskt synfält inom en etikettfri MMTV-PyMT39 brösttumör (figur 1B-E, figur 3A) är mycket heterogen, bestående av kollagenfibrer, många stromaceller, massor av tumörceller och vaskulatur (figur 3A). I allmänhet är kollagenfibrer rikligare nära fönstret och minskar i överflöd djupare in i tumören (Figur 1B-E) Organisationen av fibrerna som omger tumörmassorna kan också vara ganska varierad, ofta med regioner med mer slumpmässig organisation i samma synfält som regioner med högre inriktning (Figur 2D,H och Figur 3I).
För att utveckla en analyspipeline som kan segmentera intravitala data i perivaskulära regioner, tumör och stroma, fokuserade detta protokoll på att använda signalen från endogena NAD (P) H och SHG. Medan identifiering av tumören och stroma kan vara enkel, kan identifieringen av perivaskulära regioner inom tumörmikromiljön vara utmanande. Vaskulaturen ligger ofta inom de smala banden av reducerad NAD (P) H-signal mellan de ljusa NAD (P) H + cancercellmassorna. Det är viktigt att notera att inte alla mörka gränser har vaskulatur; snarare är vissa mörka regioner helt enkelt tumörveck eller upptändning av intilliggande tumörlober (gul pil, figur 2G). Dessutom, medan ett kryddat öga kan extrahera blodkärlen med större diameter från tumören eftersom de har ett distinkt utseende, är denna skillnad inte alltid trivial. Detta gäller särskilt för kärl med mindre diameter där deras utseende kan vara mer subtilt och varierande. I detta fall kan användningen av fluorescenslivslängden för NAD(P)H hjälpa till vid positiv identifiering av vaskulaturen (figur 2B,F). Fluorescenslivslängd (FLIM) mäter inte fotonernas överflöd eller intensitet på en plats, utan den tid det tar för de exciterade molekylerna att avge en foton och sönderfalla till deras marktillstånd. Röda blodkroppar (RBC) och blodplasma har visat sig ha en karakteristiskt kort och distinkt fluorescenslivslängd 32,37 som kan utnyttjas för identifiering och segmentering av kärl i vävnader.
För att bestämma hur väl fluorescenslivslängden för NAD(P)H identifierar vaskulaturen intravitalt injicerades en 100 μL bolus av en rodaminmärkt dextran i svansvenen efter insamling av FLIM-bilden. Jämförelser av maximala intensitetsprognoser av NAD(P)H FLIM speglar nära de kärl som är märkta med en fluorescerande märkt dextran (figur 2I-J). Upprepande av detta tillvägagångssätt hos flera möss visade att det genomsnittliga maskområdet från FLIM-bilden över dextranmaskens område var 78.6% ± 12.3% (Figur 2L). Medan överlägget inte var 100%, kartlade denna teknik exakt hela kärlnätverket. De skillnader som observerats i de rapporterade områdena kan ofta hänföras till intravital drift eller registreringsproblem, tunnare kärlidametrar på grund av modellmontering eller förlust av fina kärl på grund av RBC-uteslutning av trycket från den växande massan. Viktigt är att denna teknik fungerar lika bra i närvaro av både genetiskt kodade fluoroforer som GFP eller etikettfria tumörmodeller (figur 2D, H), vilket ger ett mycket robust och brett tillämpligt sätt att identifiera vaskulaturen för bildsegmentering.
För att avgränsa gränserna för etikettfria tumörmassor användes NAD(P)H autofluorescens (figur 1C). Detta kan fångas genom att antingen självständigt samla in en NAD(P)H-bild eller sammanfatta NAD(P)H FLIM-data för att generera en intensitetsbild. Endera vägen möjliggör lämplig segmentering av tumörmikromiljön. Som en allmän observation framkallar tvåfoton excitation av NAD (P) H i cancerceller ljus autofluorescens som producerar en bild som visar skarpa enskilda celler med mörka kärnor (Figur 2E, G). Detta mönster kan användas för att definiera omfattningen av den växande massan. Medan enkel intensitetsbaserad tröskel för NAD (P) H är möjlig för att definiera gränsen för tumörfacket, fungerar ett träningsbart segmenteringsverktyg ofta bättre (figur 3B, E). Några andra vanliga avläsningar, som cellmigration eller cellulär utskjutningsanalys, kan dra nytta av genetiskt kodad exogen fluorescens inom musmodellen eller implantation av fluorescerande märkta cellinjer (Figur 2A). I dessa fall kan uppgiften att avgränsa massans gräns uppnås med enkel tröskel av det fluorescerande proteinet. Ibland kan uttrycket av fluoroforen bli ganska heterogent efter implantation. Detta bör inte orsaka segmenteringsproblem. Det har också ofta observerats att tumörer skapade av fluorescerande allografter eller xenotransplantat har mindre uppdelade regioner av kollagenfibrer än tumörer skapade av genetiska tumörmodeller som MMTV-PyMT16.
Stromalfacket omfattar regionerna utanför den växande massan eller mellan växande massor, och en mask för stroma erhålls genom att invertera tumöravkastningen (figur 3B-F). Stromalfacket kan sedan delas upp ytterligare i sub-ROI baserat på kollagenfiberarkitektur. Kollagenfibrer är en viktig egenskap i stroma och har en stor mångfald av fiberorganisationer, som är kända för att modulera cellbeteende40,41. Ofta finns det många lokala (<100 μm) regioner med inriktade eller slumpmässiga fibrer i bilden16. Därför identifierades regioner med relativt inriktad (röd / blå nyanser) eller slumpmässig (gröna nyanser) fiberorganisation (figur 3I) med OrientationJ-plugin. Med hjälp av OrientationJ koherensfärgkarta kan masker baserade på den lokala fiberorganisationen skapas för segmenteringsändamål (Figur 3J). Dessa masker kan sedan överlagras för att analysera differentiellt dynamiskt stromalcellbeteende (figur 3K) på grund av effekterna av specifik fiberorganisation (figur 3H, I).
Nu när ROI för de olika facken i tumörmikromiljön har definierats kan de appliceras på de enskilda ramarna eller kanalerna i den intravitala timelapse-filmen. Vid denna tidpunkt är det viktigt att betona att alla signaler som visas i figur 3A härrör helt från endogena källor. Denna bild visar den rika potentialen hos rumsliga och kontextuella ledtrådar som kan komma från rent endogena, allestädes närvarande och etikettfria källor. Här använde vi MMTV-PyMT-tumörmodellen som ett exempel för att illustrera metodens tillämplighet för att kvantifiera antalet och egenskaperna hos makrofager inom specifika platser för tumörmikromiljön (TME). En tidigare intravital studie42 har visat att celler som avger höga nivåer av FAD-autofluorescens (figur 3A, magentaceller, gula pilar) färgar positivt med F4/80-antikroppar och representerar en population av makrofager inom TME. Med hjälp av detta arbetsflöde för att segmentera bilden är det möjligt att effektivt och noggrant undersöka antalet, övervaka cell-cellinteraktioner över tid eller till och med observera de metaboliska egenskaperna hos denna delmängd av makrofager (magenta) inom olika fack i TME (Figur 3A, gula pilar). Till exempel kan beteendet hos FAD-höga makrofager som specifikt finns inom NAD (P) H-höga tumörboet karakteriseras (Figur 3E). På samma sätt kan makrofagernas beteenden med avseende på den lokala organisationen av fibrerna i stromaregionen undersökas. Några nya rapporter har visat att makrofager och andra migrerande celler i stroma svarar på mekaniska signaler från deras lokala mikromiljö 16,43,44. Med hjälp av fiberjusteringsmaskerna som produceras med denna metod är det möjligt att undersöka deras differentiella beteenden mellan regioner av slumpmässiga och anpassade kollagenorganisationer. Slutligen kan samma fokuserade analys också tillämpas för att bestämma antalet och beteendet hos makrofager lokaliserade inom en definierad närhet till vaskulaturen. I figur 3G kan vaskulaturen ses i rött, och makrofager kan återigen ses i magenta. En mask för vaskulaturen med NAD(P)H FLIM skapades och expanderades sedan genom utvidgning av 10 pixlar. Det valda avståndet var godtyckligt för demonstrationsändamål men kan optimeras för de specifika behoven hos det enskilda experimentet. Viktigt, medan den här bilden är av en enda z-skiva, kan denna procedur enkelt extrapoleras till 3D-staplar för att observera beteende runt hela fartygets volym.
Figur 1: Grafisk abstrakt av bröstfönsterimplantation och den underliggande organisationen av en MMTV-PyMT-tumör. (A) Dimensionerna på bröstbildsfönstret och schemat för den allmänna implantationsprocessen. (B-E) Detta är ett montage från en omärkt MMTV-PyMT-tumörrepresentant som börjar från 50 μm under ytan av MIW och fortsätter till ett djup av 80 μm. Djupvärdena anges under varje bild. Kollagenfibrer (grå) är vanligare vid tumörens yta (NAD (P) H, blå) än vid större djup. Skala stapel 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativ intravital bild av en GFP-märkt och etikettfri PyMT-tumör och validering av NAD(P)H FLIM som markör för vaskulaturen. En sammansatt bild (A) av en typisk allograft av GFP-4T1-celler i bröstfettkudden och en representativ brösttumör från en MMTV-PyMT-tumörmodell (E). NAD(P)H FLIM kartlägger vaskulaturen i båda modellerna (B,F). GFP-fluorescens (C) och NAD (P) H autofluorescens (G) användes för att identifiera tumören. Kollagen visualiserades av SHG (D,H). En sammansatt bild med NAD(P)H FLIM för att identifiera vaskulatur validerades genom att jämföra maximala intensitetsprojektioner av den intravitala stacken före och efter svansvenens injektion av fluorescerande dextran (I,J,K). Kvantifieringen av förhållandet mellan det område som bestäms av NAD(P)H FLIM över det område som identifieras genom dextraninjektion hos fyra möss (färg identifierar enskilda möss) och flera synfält (enskilda prickar i diagrammet) visas i (L). Skala staplar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativ bildsegmentering med endogen fluorescens inom etikettfri PyMT-tumör. En sammansatt bild (A) av en enda z-skiva från en typisk PyMT-brösttumör samlades in med endast inneboende signaler. SHG (grå) visualiserar tumörens kollagenfibrer. Fluorescens livstidsavbildning av NAD (P) H autofluorescens (Tau (τ) medelvärde) rapporterar cellernas metaboliska signaturer (gröna till orange nyanser) och placeringen av blodkärl (röd). FAD autofluorescens (magenta) identifierar makrofager. Med hjälp av segmenteringsschemat som beskrivs i detta protokoll segmenterades den etikettfria tumören i fack för tumörboet (B,E), stroma (C,F) och vaskulatur (D,G) med endast SHG och NAD (P)H autofluorescens. Stroma- och kollagenfibrerna (H) kan också klassificeras i lokala regioner av inriktade fibrer ((visas i magenta / blå), J, K). Skala staplar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande data 1: Representativ datauppsättning för monterad A1% från NAD(P)H FLIM. Detta är en maximal intensitetsprojektion av en monterad A1% från en typisk datauppsättning. Det är en representant för kvaliteten på identifieringen som är möjlig och en typisk bakgrundsnivå innan du använder den träningsbara klassificeraren. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande modell: Representativ klassificerare som används på monterad A1% för identifiering av vaskulaturen. Det här är en exempelklassificerarmodell för användning i det träningsbara plugin-programmet FÖR WEKA-segmentering i ImageJ. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
4D intravital avbildning är ett kraftfullt verktyg för att undersöka dynamiska fysiologiska interaktioner inom det rumsliga och tidsmässiga sammanhanget för den ursprungliga tumörmikromiljön. Detta manuskript ger en mycket grundläggande och anpassningsbar operativ ram för att dela upp dynamiska cellinteraktioner inom tumörmassan, den intilliggande stroma eller i närheten av det vaskulära nätverket med endast endogena signaler från andra harmoniska generationen eller NAD (P) H autofluorescens. Detta protokoll ger en omfattande steg-för-steg-metod från implantation av bildfönstret till bildförvärv, analys och segmentering. Vi tror att denna teknik kommer att bidra till ett nödvändigt analysramverk för att segmentera och kvantifiera 4D intravitala data.
Detta protokoll utvecklades för att vara i stort sett kompatibelt med många intravitala musmodeller, inklusive omärkta PDX-modeller. PDX är en otroligt informativ modell45 men utgör en utmaning för intravital avbildning eftersom PDX-modellens natur inte är väl lämpad för genetisk manipulation. Därför skulle det vara ganska fördelaktigt att ha en metod som kan visualisera och dela upp dynamiska interaktioner inom deras omärkta fysiologiska miljö med enbart endogena metaboliter som NAD (P) H och andra harmoniska generationen (SHG). Förutom att vara fördelaktig för PDX-modeller kan detta flerdimensionella tillvägagångssätt teoretiskt tillämpas på alla intravitala studier i cancer eller normal vävnad som behöver rumsligt och strukturellt sammanhang för att ta itu med en fysiologisk fråga. NAD (P) H autofluorescens och SHG från kollagenfibrer är allestädes närvarande för alla vävnader och representerar en universell och fri resurs i intravitala samlingar. Detta FLIM-tillvägagångssätt är också robust eftersom det kan identifiera vaskulaturen i närvaro av fluorescens från exogena källor som GFP. Detta tillvägagångssätt är också fördelaktigt eftersom SHG- och NAD (P) H-emission kan visualiseras i det blå spektrumet och därmed ligga i en våglängd som vanligtvis inte används vid avbildning av fluorescerande fusionskonstruktioner som annars kan behövas för studien.
Den aspekt av detta tillvägagångssätt som är ny och har ett särskilt mervärde är den etikettfria identifieringen av vaskulaturen. Medan andra metoder kan fungera, ger användningen av fluorescenslivslängden för NAD (P) H enkelt en tydlig signatur utan behov av ytterligare märkning. Uppgifterna visar att de livstidsdefinierade kärlen speglar vaskulaturen märkt från svansveninjektion av fluorescerande dextran, guldstandarden för vaskulaturavbildning. Vår teknik utmärker sig för att visualisera mindre blodkärl jämfört med enkel tvåfoton- eller trefoton-excitation, där större kärl lätt visualiseras, men mindre kräver mer expertis för att identifiera. Livstidssignaturen är entydig för alla fartyg, oavsett storlek. Dessutom kan detta ytterligare NAD(P)H FLIM-förvärv enkelt kombineras med andra markörer för segmentering av tumörmikromiljön. Genom ett enda FLIM-förvärv av NAD(P)H kan kraven för att definiera vaskulatur, tumörbo och stroma uppnås. FLIM-kollektionen kan införlivas i den befintliga experimentella designen genom att samla in ett enda förvärv i slutet eller början av en tidsserie eller interfoliera samlingarna genom hela 4D-förvärvet. Bestämning av lämplig mängd FLIM-bilder beror på specifika experimentella behov och begränsningar, som förvärvsintervall, experimentell varaktighet eller bildstabilitet, men minst en FLIM-samling per 4D-serie kommer att behövas för den här metoden.
Denna process för att använda NAD(P)H FLIM för identifiering av vaskulaturen kräver matematisk anpassning av FLIM-data till en exponentiell funktion av formen
med A1+A2+A3=1. Medan de flesta livstidsbilder av NAD (P) H som rapporteras i litteraturen är monterade som en bi-exponentiell, i denna applikation var NAD (P) H monterad som en tri-exponentiell där τ1 och τ2 är inställda på de rapporterade värdena för RBC: s och τ3 får flyta. Viktigt är att målet inte är att uppnå det mest exakta livstidsvärdet, utan snarare att ge en optimal bild för segmentering. När τ1- och τ2-värdena initialt fastställs till de rapporterade värdena för RBC: s32,46 och matrisen beräknas, kommer blodkärlen att sticka ut med A1% värden större än 60% i blodkärlen och A1% värden i allmänhet mindre än 40% i den intilliggande tumören. Nästa steg är att försöka maximera A1% i blodkärlen samtidigt som A1% i den intilliggande tumören minimeras. Detta är en iterativ process, och i slutet av den kommer A1% -värdena för blodkärlen att vara större än 90% med A1% -värdena för tumören mindre än 10%. När A1% -värdena för blodkärlen är jämnt höga och bakgrunden är jämnt låg, exportera dessa A1% -filer till ett träningsbart segmenteringsverktyg. Detta tar snabbt bort eventuellt kvarvarande brus och definierar avkastningen för vaskulaturen.
Eftersom bröstfettkudden ligger utanför kroppshålan är operationen minimalt invasiv och de bästa resultaten erhålls genom att implantera MIW över den 4: e inguinala bröstkörteln. Tidpunkten för fönsterimplantation och när experimentet kommer att genomföras är kritiskt. Det är bäst att tillåta 24 - 48 timmars läkning efter operationen före den fysiologiska tidpunkten som kommer att undersökas. Medan själva proceduren endast kräver ett litet snitt (≈ 10 mm) för att sätta in fönstret (figur 1A), kommer läkningstiden efter operationen att tillåta inflammation och vätskor som ackumulerats på grund av implantationsprocessen att rensa. Dessutom kommer det också att tillåta tumören att fortsätta växa in i fönstret. Båda faktorerna kommer att förbättra den totala bildkvaliteten genom att minska opaciteten/spridningen och öka bildstabiliteten. Nästa sak att tänka på är experimentets planerade totala varaktighet. Medan dessa fönster var utformade för längsgående studier, medför fönstrets styva natur en tidsgräns på 2 till 3 veckor. Efter den tidsperioden har fönstret en tendens att lossna från det dermala skiktet och därigenom förorena och avsluta experimentet. Om en longitudinell studie av bröstkörteln inte krävs kan andra intravitala metoder som en terminal hudflikprocedur22 som eliminerar kirurgisk implantation av en MIW vara ett bättre alternativ. Hudklaffproceduren ger bättre tillgång till hela körteln eftersom den inte begränsas av PLACERINGEN OCH DIMENSIONERNA AV MIW, OCH DET KAN GE STÖRRE BILDSTABILITET NÄR KÖRTELN DRAS BORT FRÅN KROPPSHÅLAN. Oavsett den intravitala avbildningsmetoden är segmenteringen av mikromiljön med användning av endogen fluorescens fortfarande i stort sett tillämplig för efterföljande bildanalys. Det sista att tänka på är varaktigheten av det enskilda bildexperimentet. Det är inte orimligt att skaffa filmer som varar 6-8 timmar. Men under de längre samlingarna blir hydrering ett problem, och noggrann övervakning av musens hälsa krävs.
En signifikant fördel med denna metod är att de olika bilderna av endogen fluorescens som krävs för segmentering av tumörmikromiljön kan samlas in relativt enkelt och utan ytterligare manipuleringar till musen. Med kombinationen filter/dikro som rapporteras här (Materialtabell) kan både SHG- och NADH-bilder förvärvas med samma filteruppsättning genom att byta våglängder från 890 nm till 750 nm. Även om detta skapar en fördröjning i förvärvet påverkar det inte efterföljande bildsegmentering. Det är också viktigt att komma ihåg att denna metod endast utgör en utgångspunkt för en segmenteringsteknik som använder endogen fluorescens, och mer avancerade optiska konfigurationer kan möjliggöra samtidiga förvärv om det behövs.
Det finns begränsningar med att använda FLIM för att identifiera vaskulaturen. FLIM-metoden kräver specialiserad elektronik, instrumentering och expertis för att samla in. Alla dessa krav integreras dock alltmer i moderna mikroskop och mer tillgängliga genom användning av bildkärnanläggningar. FLIM har blivit en mogen teknik och att skaffa bra data kräver inte mycket träning. En andra begränsning är att FLIM-förvärv är tidskrävande. Medan bildhastigheten för en bild som samlas in med fluorescerande dextran är ungefär en sekund eller mindre, kan den genomsnittliga FLIM-samlingen sträcka sig från 60 s till 120 s, vilket kan vara oöverkomligt om de fysiologiska tidspunkterna är kortare än så. FLIM-identifiering av vaskulaturen är inte avsedd att ersätta all injicerad fluorescerande dextran eller multifotonexcitation av vaskulaturen; snarare är det ännu ett tillvägagångssätt i den växande verktygslådan för intravital bildbehandling. Vidare räknar vi med att längre förvärvstider kommer att bli dramatiskt kortare under de kommande åren. Detektorerna och elektroniken förbättras snabbt, vilket minskar detektorns dödtid och kräver därmed kortare förvärvsperioder för att fånga samma antal fotoner. En annan anledning att vara optimistisk om kortare förvärvstider är framväxten av maskininlärningsprogramvara eller bildåterställningsalgoritm som CSBDeep47. Dessa algoritmer kan potentiellt tränas för att arbeta med kortare exponeringstider, vilket minskar antalet fotoner som behövs för att exakt identifiera strukturer för segmenteringsändamål. Tillsammans skulle detta snabbt kunna minska de tidsramar som behövs för dessa flerdimensionella förvärv.
Användningen av intravital avbildning kommer bara att bli viktigare när forskare försöker riva upp de många komplexa cell-cell- och cellmatrisinteraktionerna som uppstår inom den fysiologiska tumörmikromiljön. Därför behövs fortsatt utveckling av förvärvs-, segmenterings- och analysmöjligheterna. För detta ändamål är det viktigt att inte förbise potentialen hos endogen fluorescens för mikromiljösegmentering. I detta protokoll användes den endogena signalen från SHG och fluorescensmetaboliter, inklusive NAD(P)H-intensitet och FLIM, för segmenteringsändamål under intravital avbildning av TME-brösten. Andra endogena metaboliter eller inneboende egenskaper kan ge ytterligare signaler för att avslöja den dynamiska ömsesidigheten hos tumörceller och mikromiljön. Till exempel kan FAD användas för att övervaka rörelsen hos immunpopulationer42, 3P-generationen kan markera strukturella egenskaper som plasmamembran eller fett36, och elastinfluorescens kan användas för att separera artärer från vener46. Därför kommer endogen fluorescens att fortsätta att tillhandahålla en rik flerdimensionell plattform som bör utnyttjas till fullo när forskarsamhället fortsätter att bygga verktygslådan för intravital mikromiljösegmentering och analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna NCI R01 CA216248, CA206458 och CA179556 bidrag för finansiering av detta arbete. Vi vill också tacka Dr. Kevin Eliceiri och hans bildgrupp för deras tekniska expertis i den tidiga utvecklingen av vårt intravitala program. Vi tackar också Dr. Ben Cox och andra medlemmar i Eliceiri Fabrication Group vid Morgridge Institute for Research för deras viktiga tekniska design under de tidiga faserna av MIW. Dr Ellen Dobson hjälpte till med användbara samtal om ImageJ-träningsbart WEKA-segmenteringsverktyg. Dessutom vill vi tacka Dr. Melissa Skala och Dr. Alexa Barres-Heaton för snabb användning av deras mikroskop. Slutligen vill vi tacka Dr. Brigitte Raabe, D.V.M, för alla tankeväckande diskussioner och råd om vår mushantering och vård.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
| 1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
| 20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
| 27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
| 40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
| 5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
| Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
| Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
| cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
| fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
| forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
| GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
| heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
| heating chamber | home built | ||
| Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
| inverted microscope base | Nikon | ||
| Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
| Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
| Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
| multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
| NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
| Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
| objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
| SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
| Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
| SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
| surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
| surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
| Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
| TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
| Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
| two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
| ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
| Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |
References
- Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
- Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
- Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
- Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120 (2020).
- Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
- Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
- Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173 (2020).
- Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
- Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
- Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
- Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
- Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
- Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
- Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
- Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
- Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
- Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490 (2019).
- Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
- Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
- Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
- Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007 (2014).
- Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
- Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
- Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- von Au, A., et al.
- Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
- You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125 (2018).
- Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), Oxford, England. 2424-2426 (2017).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
- Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086 (2016).
- Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787 (2020).
- Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850 (2019).
- Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
- Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171 (2017).
- Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
