Summary
该协议介绍了脓毒症小鼠模型中盲肠结扎和穿刺（CLP）的操作细节。CLP是创建脓毒症动物模型的最广泛使用的技术之一。因此，需要标准化的CLP协议才能获得可靠的研究结果。
Abstract
脓毒症是一种严重危及生命且发展迅速的疾病，每年在全世界造成数百万人死亡。研究人员付出了巨大的努力，使用各种动物模型阐明脓毒症的病理生理学;盲肠结扎和穿刺（CLP）诱导的脓毒症小鼠模型在实验室中被广泛使用。影响CLP模型的严重程度和可复制性的三个技术方面是盲肠结扎的百分比，用于盲肠穿刺的针头的大小以及挤入腹腔的粪便量。脓毒症的快速和特异性诊断是影响结局的关键因素。脓毒症诊断的金标准是微生物培养;但是，此过程非常耗时，有时甚至不准确。脓毒症特异性生物标志物的检测速度快，但由于半衰期短、非特异性和敏感性不足，现有的生物标志物不能令人满意。因此，迫切需要在早期阶段获得可靠的脓毒症生物标志物。以前的出版物表明，脓毒症中发生过多的中性粒细胞细胞外陷阱（NET）。瓜氨酸组蛋白 H3 （CitH3） 作为 NET 成分，在脓毒症动物和患者中均升高，CitH3 的存在是脓毒症的可靠诊断生物标志物。本研究旨在描述CLP诱导的脓毒症的标准化小鼠模型，并建立可靠的脓毒症血液生物标志物。我们的工作可能有助于将来脓毒症的早期和准确诊断。
Introduction
脓毒症被定义为宿主对感染1 的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍，脓毒性休克是严重脓毒症2 病例死亡的主要原因。脓毒症和脓毒性休克每年在全世界造成数百万人死亡3。改善脓毒症患者预后的关键是及时开始抗生素等治疗4。诊断脓毒症的金标准方法是微生物培养;然而，微生物培养耗时长，可导致假阳性和假阴性结果，极大地限制了临床意义5。因此，非常希望鉴定脓毒症的血液生物标志物。降钙素原被认为是理想的脓毒症生物标志物，但由于无法区分脓毒症和无菌性疾病，因此诊断效果有限6。
小鼠盲肠结扎和穿刺（CLP）通常用于在科学研究中创建脓毒症模型。CLP 是使用最广泛的脓毒症模型之一，因为它模仿多种微生物腹膜炎，激活促炎和抗炎免疫反应7。众所周知，CLP 创建的脓毒症模型比替代技术（如注射细菌内毒素）更具临床相关性。因此，CLP 被认为是用于研究的经典脓毒症模型8.然而，CLP 的一个主要缺点是其可重复性，因为模型的严重程度受多种因素的影响，例如盲肠结扎的百分比、针头尺寸、穿刺次数和剖腹手术技术。因此，有必要对CLP诱导的脓毒症模型进行标准化。本研究描述了CLP诱导的脓毒症模型的方案细节，以显示标准化程序并提高其可重复性。
炎症反应发生在败血症的早期阶段，中性粒细胞释放过量的氧化剂和蛋白酶，导致器官损伤8。脓毒症病理生理学的一个关键因素是中性粒细胞细胞外陷阱 （NET） 的形成，其释放核和胞质成分，例如 DNA、瓜氨酸组蛋白和抗菌蛋白酶9。最近的研究表明，NETs的过度生成介导了脓毒症的病理学;同时，通过YW3-56或Cl-脒等化学物质对肽基精氨酸脱亚胺酶（PAD）的酶促抑制，NETs的减少在脓毒症10，11小鼠模型中发挥促生存作用。瓜氨酸组蛋白H3（CitH3）在2011年被鉴定为脓毒症特异性蛋白12，随后的出版物已经证明循环CitH3浓度是脓毒症的可靠诊断生物标志物13，14。CitH3 被认为是比降钙素原更敏感、更持久的生物标志物，在区分脓毒症方面比炎性细胞因子更具特异性13。
在这项研究中，我们在CLP诱导的败血症小鼠模型中评估了脓毒症的可靠诊断生物标志物。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物实验均按照湘雅医院和中南大学动物审查委员会批准的指南（第202103149号）进行。
1. 准备
- 选择雄性C57BL / 6J小鼠（重量：20-25g;年龄：8-12周）并在执行任何程序之前放置3天。
- 称量鼠标。
- 吸入用1.5%异氟醚麻醉小鼠，捏住脚趾以检查麻醉深度。
- 将鼠标固定在加热垫上。在腹部涂抹脱毛膏，放置不超过 1 分钟，然后去除乳膏和头发。
注意：在手术过程中，应通过在麻醉小鼠下方放置温暖的垫来维持正常的体温。
2. 操作
- 准备适合啮齿动物手术的无菌手术器械。戴上无菌手套、口罩和手术服，以确保无菌条件。
- 用碘湿巾消毒腹部皮肤至少三次。用无菌手术窗帘覆盖手术区域。
- 使用无菌手术剪刀沿白线在腹壁上做一个约 2 厘米的切口。
注意：不要损坏器官。 - 用无菌镊子识别并分离盲肠。
- 用4-0丝缝线连接盲肠体积的75%。不要结扎肠系膜血管。
注意：盲肠结扎的百分比决定了败血症的严重程度。 - 通过在尾端和结扎组之间的中点用 21 G 针（从一侧穿过盲肠壁到另一侧）创建一个贯穿式穿孔（两个孔）刺穿盲肠。
- 丢弃针头。通过穿透孔轻轻地将一小滴粪便从盲肠中挤出。
注意：挤入腹膜腔的粪便量应一致，因为这也决定了败血症的严重程度。假小鼠应跳过步骤2.5-2.7。 - 轻轻地将盲肠置入腹腔。
- 用6-0丝线分别闭合腹部肌肉和皮肤。
- 用碘消毒切口。
- 在腹部左下象限注射酮洛芬（5毫克/千克），以避免盲肠。将鼠标放在温暖的垫子上，直到它从麻醉剂中完全恢复。
- 将鼠标放在温控室（22°C）的笼子中，并自由获取食物和水。术后第一周每6小时检查一次小鼠。
- 当败血症症状达到预定终点时，通过二氧化碳过量对小鼠实施安乐死。
3. 治疗
- 将小鼠随机分为假手术组、CLP组、CLP + YW3-56组（图2a）和CLP + Cl-脒组（图1）。
注：除中电外，假小组与 CLP 组经历了相同的过程。在步骤2.9缝合肌肉和皮肤层后1小时通过腹膜注射 给予 YW3-56（5mg / kg）或Cl-脒（40mg / kg）。 - 样品收获
- 手术后15 24小时从球后丛中采集外周血。
- 通过离心（1，000× g，5分钟）制备血清，并储存在-80°C直至使用。
- 如前所述，使用间接夹心ELISA试剂盒测量CitH3浓度13。
- 将抗 CitH3 单克隆抗体包被在 96 孔板上以捕获 CitH3 蛋白。
- 用 DNase I（150 单位/mL，37°持续 1 小时）处理血清，并在孔中孵育（20 μL，室温）。
- 加入抗 CitH3 多克隆抗体（0.33 μg/mL、100 μL、2 小时）以检测捕获的 CitH3 蛋白。
- 在孔中孵育抗兔过氧化物酶标记的二抗（0.02μg/ mL，100μl，1小时）。
- 彻底洗涤后，用3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（100μL，20分钟）冲洗孔。
注意：ELISA试剂盒的进一步方案详细信息在先前的出版物13中提供。
- 统计分析
- 执行单向方差分析以分析三组之间的差异，然后进行邦弗朗尼事后检验以进行多重比较。使用统计软件执行分析。0.05或更小的 p 值被认为是显著的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
如图2A所示，通过蛋白质印迹在假组中未检测到CitH3。CLP后血清CitH3浓度显着升高，并且通过给予PAD抑制剂YW3-56抑制NET形成而阻断了这种增加。图2B显示了ELISA测定的血清CitH3浓度。CLP后24 h，CLP组血清CitH3浓度比假手术组升高（p = 0.0008），并且CitH3增加被Cl-脒（一种限制NET形成的PAD抑制剂）显着减弱（p = 0.0028）。
图 1：实验分组。 小鼠随机分为假手术组、CLP组、CLP +YW3-56组（A）和CLP + Cl-脒组（B）。CLP 按照协议中的描述执行。CLP后1小时通过腹膜注射 给予 YW-3-56（5mg / kg）或Cl-脒（40mg / kg）。除中电外，假小组与中电组经历了相同的程序。在不同时间点收集血液，制备血清并在-80°C下储存直至使用。YW3-56和Cl-脒都是肽基精氨酸脱亚胺酶抑制剂，可显着限制中性粒细胞细胞外陷阱的形成。缩写：CitH3 = 瓜氨酸组蛋白 H3;CLP = 盲肠结扎和穿刺。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：在 CLP 诱导的脓毒症模型中，血清 CitH3 浓度显著升高，并通过 PAD 抑制得到缓解 。 （A）进行蛋白质印迹以测试血清CitH3浓度。假手术组未检测到CitH3。CLP组CitH3浓度显著升高，YW3-56处理阻断该增加。（B）通过ELISA测量血清CitH3浓度。在假组中几乎没有检测到CitH3。CLP组显示CitH3显着增加，CitH3因施用Cl-脒而减弱。YW3-56和Cl-脒都是PAD抑制剂，可显着限制中性粒细胞细胞外陷阱的形成。缩写：CitH3 = 瓜氨酸组蛋白 H3;CLP = 盲肠结扎和穿刺;PAD = 肽基精氨酸脱亚胺酶。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CLP 将病原体引入腹部以创建脓毒症的临床前模型。在进行CLP时，重要的是使用无菌条件来消除外源性细菌的干扰并使用准确剂量的麻醉剂16。影响脓毒症模型严重程度和可复制性的CLP的三个技术方面是盲肠结扎的百分比，用于盲肠穿刺的针头的大小以及挤入腹腔的粪便量。结扎约 75% 的盲肠会导致重度脓毒症，50% 结扎会导致中度脓毒症，25% 或更少的结扎会导致轻度脓毒症17。穿刺次数和针头尺寸决定了死亡率18，通过穿刺获得最佳结果。少量（一滴）粪便足以引起细菌性腹膜炎，挤出粪便时需要小心。由有经验的人执行 CLP 大约需要 10 分钟。
本研究中描述的CLP诱导的败血症的小鼠模型有几个局限性。首先，小鼠可能太小而无法获得足够的血液样本进行外周血分析和细胞因子测量。其次，CLP不能在新生动物身上进行。第三，变异性仍然存在，可能无法获得可重复的结果。在进行研究测试之前，重要的是要确保外科医生在进行CLP方面有足够的实践。
CLP创建了一个临床现实的脓毒症模型，模拟病理生理过程和细胞因子谱，并已广泛用于啮齿动物。可以通过调整针头的大小和盲肠结扎的百分比来操纵CLP的严重程度以满足不同的研究目的。根据我们使用CLP模型获得的结果，检测循环的CitH3浓度可以早期诊断小鼠的败血症。血清 CitH3 浓度的诊断价值有助于及时开始抗脓毒症治疗，显著改善脓毒症患者的预后。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
未声明利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢王伟教授和刘帅博士对实验的帮助。本研究由中南大学湘雅医院青年科研基金（编号：2019Q10）、湖南省国家自然科学基金（编号：2020JJ4902）和国家自然科学基金（编号：82202394）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
References
- Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Shankar-Hari, M., et al. Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).
- Fleischmann-Struzek, C., et al. Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis. Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).
- Evans, L., et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021. Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).
- Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol. Systematic Reviews. 7 (1), 216 (2018).
- Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Hotchkiss, R., Karl, I. The pathophysiology and treatment of sepsis. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
- Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis. Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Liang, Y., et al. Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia. European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).
- Deng, Q., et al. Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice. Frontiers in Immunology. 10, 2957 (2019).
- Li, Y. Q., et al. Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock. Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).
- Pan, B., et al. CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock. Scientific Reports. 7 (1), 8972 (2017).
- Park, Y., et al. An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils. Small. 16 (1), 1905611 (2020).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Brook, B., et al. A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis. Journal of Visualized Experiments. (143), e58574 (2019).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).
