Summary
Este protocolo apresenta os detalhes operatórios da ligadura e punção cecal (FLP) em um modelo de sepse em camundongo. O CLP é uma das técnicas mais utilizadas para criar um modelo animal de sepse. Portanto, um protocolo CLP padronizado é necessário para a obtenção de resultados de pesquisa confiáveis.
Abstract
A sepse é uma doença grave com risco de vida e em rápido desenvolvimento que causa milhões de mortes anualmente em todo o mundo. Os pesquisadores fizeram enormes esforços para elucidar a fisiopatologia da sepse usando vários modelos animais; o modelo de sepse induzida por ligadura e punção cecal (FLP) em camundongos é amplamente utilizado em laboratórios. Os três aspectos técnicos que afetam a gravidade e a replicabilidade do modelo de FLP são a porcentagem de ceco ligado, o tamanho da agulha utilizada para punção cecal e o volume de fezes espremidas na cavidade abdominal. O diagnóstico rápido e específico da sepse é um fator crucial que afeta o desfecho. O padrão-ouro para o diagnóstico de sepse é a cultura microbiana; no entanto, esse processo é demorado e às vezes impreciso. A detecção de biomarcadores específicos de sepse é rápida, mas os biomarcadores existentes são insatisfatórios devido a uma meia-vida curta, inespecificidade e sensibilidade insuficiente. Portanto, há uma necessidade urgente de um biomarcador confiável de sepse nos estágios iniciais. Publicações anteriores sugerem que armadilhas extracelulares (TNEs) excessivas de neutrófilos ocorrem na sepse. A histona H3 citrulinada (CitH3), como componente NET, está elevada tanto em animais sépticos quanto em pacientes, e a presença de CitH3 é um biomarcador diagnóstico confiável de sepse. O presente estudo teve como objetivo descrever um modelo padronizado de sepse induzida por FLP em camundongos e estabelecer um biomarcador sanguíneo confiável de sepse. Nosso trabalho pode contribuir para o diagnóstico precoce e preciso da sepse no futuro.
Introduction
A sepse é definida como disfunção de órgãos com risco de vida causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção1, e o choque séptico é a principal causa de morte em casos graves de sepse2. A sepse e o choque séptico causam milhões de mortes em todo o mundo a cada ano3. A chave para melhorar o desfecho de pacientes com sepse é o início imediato de tratamentos como antibióticos4. O método padrão-ouro para o diagnóstico de sepse é a cultura microbiana; no entanto, a cultura microbiana é demorada e pode levar a resultados falso-positivos e falso-negativos, o que limita sobremaneira a significância clínica5. Assim, é altamente desejável identificar um biomarcador sanguíneo de sepse. A procalcitonina é reconhecida como um biomarcador ideal de sepse, mas tem eficácia diagnóstica limitada por ser incapaz de distinguir sepse de doenças estéreis6.
A ligadura e punção cecal de camundongos (CLP) é comumente usada para criar um modelo de sepse em pesquisas científicas. A FLP é um dos modelos de sepse mais utilizados, pois mimetiza a peritonite polimicrobiana, ativando respostas imunes pró-inflamatórias e anti-inflamatórias7. É bem aceito que a FLP cria um modelo de sepse clinicamente mais relevante do que técnicas alternativas, como a injeção de endotoxina bacteriana. Portanto, a FLP é considerada o modelo clássico de sepse para uso em pesquisas8. No entanto, uma grande desvantagem da FLP é sua reprodutibilidade, pois a gravidade do modelo é afetada por vários fatores, como a porcentagem de ceco ligado, o tamanho da agulha, o número de punções e a técnica de laparotomia. Portanto, há necessidade de padronizar o modelo de sepse induzida por FLP. O presente estudo descreve os detalhes do protocolo do modelo de sepse induzida por FLP para mostrar o procedimento padronizado e aumentar sua reprodutibilidade.
A resposta inflamatória ocorre no estágio inicial da sepse, com neutrófilos liberando quantidades excessivas de oxidantes e proteases que causam danos aos órgãos8. Um fator-chave na fisiopatologia da sepse é a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs), que liberam componentes nucleares e citosólicos, como DNA, histonas citrulinadas e proteinases antimicrobianas9. Estudos recentes sugerem que a geração excessiva de TNEs medeia a patologia da sepse; enquanto isso, uma diminuição dos TNEs, através da inibição enzimática da peptidil arginina deiminase (DAP) por substâncias químicas como YW3-56 ou Cl-amidina, exerce um efeito pró-sobrevivência em modelos de camundongos de sepse10,11. A histona Citrulina H3 (CitH3) foi identificada como uma proteína específica da sepse em 201112, e publicações subsequentes demonstraram que a concentração circulante de CitH3 é um biomarcador diagnóstico confiável de sepse13,14. O CitH3 é considerado um biomarcador mais sensível e duradouro que a procalcitonina, sendo mais específico na distinção entre sepse do que citocinas inflamatórias13.
Neste estudo, avaliamos um biomarcador diagnóstico confiável de sepse em um modelo de sepse induzido por FLP em camundongos.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de Revisão Animal do Hospital Xiangya e da Universidade Central do Sul (No. 202103149).
1. Preparação
- Selecione camundongos machos C57BL/6J (peso: 20-25 g; idade: 8-12 semanas) e hospede por 3 dias antes de realizar qualquer procedimento.
- Pese o mouse.
- Anestesiar o rato com isoflurano a 1,5% por inalação e beliscar os dedos dos pés para verificar a profundidade da anestesia.
- Fixe o mouse na almofada de aquecimento. Aplique creme depilatório no abdômen e deixe por não mais de 1 minuto antes de remover o creme e o cabelo.
NOTA: A temperatura corporal normal deve ser mantida colocando uma almofada quente sob o rato anestesiado durante a cirurgia.
2. Funcionamento
- Prepare instrumentos cirúrgicos estéreis adequados para cirurgia de animais roedores. Use luvas estéreis, uma máscara facial e um avental cirúrgico para garantir condições assépticas.
- Desinfete a pele abdominal com lenços umedecidos de iodo pelo menos três vezes. Cubra a área cirúrgica operatória com cortinas cirúrgicas estéreis.
- Use tesouras cirúrgicas estéreis para fazer uma incisão de aproximadamente 2 cm na parede abdominal ao longo da linha alba.
NOTA: Não danifique os órgãos. - Identifique e isole o ceco para fora da cavidade peritoneal com pinças estéreis.
- Ligue 75% do volume do ceco com suturas de seda 4-0. Não ligue os vasos sanguíneos mesentéricos.
NOTA: A percentagem do ceco que é ligado determina a gravidade da sépsis. - Perfure o ceco criando uma perfuração através de um através e através (dois furos) com uma agulha 21 G (de um lado através da parede cecal para o lado oposto) no ponto médio entre a extremidade da cauda e o conjunto de ligadura.
- Descarte a agulha. Esprema suavemente uma pequena gota de fezes para fora do ceco através dos orifícios de penetração.
NOTA: A quantidade de fezes espremidas na cavidade peritoneal deve ser consistente, pois isso também determina a gravidade da sepse. As etapas 2.5-2.7 devem ser ignoradas para camundongos simulados. - Substitua suavemente o ceco na cavidade abdominal.
- Feche o músculo abdominal e a pele separadamente com suturas de seda 6-0.
- Desinfete a incisão com iodo.
- Injete cetoprofeno (5 mg/kg) no quadrante inferior esquerdo do abdômen para evitar o ceco. Coloque o rato numa almofada quente até que tenha recuperado totalmente do anestésico.
- Coloque o rato numa gaiola numa sala com temperatura controlada (22 °C) e dê livre acesso a alimentos e água. Verifique o rato a cada 6 h para a primeira semana de pós-operatório.
- Eutanasiar o rato por overdose de dióxido de carbono quando os sintomas de sépsis satisfizerem os parâmetros de avaliação pré-definidos.
3. Tratamento
- Divida aleatoriamente os camundongos em grupo sham, grupo CLP, grupo CLP + YW3-56 (Figura 2a) e grupo CLP + Cl-amidine (Figura 1).
NOTA: O grupo simulado foi submetido aos mesmos procedimentos que os grupos FLP, exceto CLP. YW3-56 (5 mg/kg) ou Cl-amidina (40 mg/kg) foi administrada via injeção peritoneal 1 h após o passo 2.9 ao suturar a camada muscular e cutânea. - Colheita da amostra
- Colher sangue periférico do plexo retrobulbar15 24 h após a operação.
- Preparar o soro por centrifugação (1.000 x g, 5 min) e conservar a -80 °C até à sua utilização.
- Meça a concentração de CitH3 usando um kit ELISA sanduíche indireto, conforme descrito anteriormente13.
- Revestir o anticorpo monoclonal anti-CitH3 em uma placa de 96 poços para capturar a proteína CitH3.
- Tratar o soro com DNase I (150 unidade/mL, 37°por 1 h) e incubar nos poços (20 μL, temperatura ambiente).
- Adicionar anticorpo policlonal anti-CitH3 (0,33 μg/mL, 100 μL, 2 h) para detectar a proteína CitH3 capturada.
- Incubar o anticorpo secundário marcado com peroxidase de coelho (0,02 μg/mL, 100 μl, 1 h) nos poços.
- Após lavagem minuciosa, desenvolver os poços com 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (100 μL, 20 min).
NOTA: Mais detalhes do protocolo do kit ELISA são fornecidos na publicação anterior13.
- Análise estatística
- Realizar ANOVA unidirecional para analisar as diferenças entre os três grupos, seguida de teste post hoc de Bonferroni para comparações múltiplas. Use um software estatístico para realizar a análise. valores de p de 0,05 ou menos foram considerados significativos.
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Representative Results
Como mostrado na Figura 2A, nenhum CitH3 foi detectado no grupo sham por western blotting. A concentração sérica de CitH3 aumentou significativamente após a FLP, e esse aumento foi bloqueado pela inibição da formação de NET através da administração de YW3-56, um inibidor de DAP10. A Figura 2B mostra as concentrações séricas de CitH3 determinadas por ELISA. Às 24 h após a FLP, a concentração sérica de CitH3 foi aumentada nos grupos CLP em comparação com o grupo sham (p = 0,0008), e esse aumento de CitH3 foi significativamente atenuado pela Cl-amidina, um inibidor da DAP que limita a formação de NET (p = 0,0028).
Figura 1: Agrupamento experimental. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em grupo sham, grupo CLP, grupo CLP + YW3-56 (A) e grupo CLP + Cl-amidine (B). A FLP foi realizada conforme descrito no protocolo. YW-3-56 (5 mg/kg) ou Cl-amidina (40 mg/kg) foram administrados via injeção peritoneal 1 h após a FLP. O grupo simulado foi submetido aos mesmos procedimentos que os grupos FLP, exceto o CLP. O sangue foi coletado em vários momentos, e o soro foi preparado e armazenado a -80 °C até o uso. YW3-56 e Cl-amidina são ambos inibidores da peptidil arginina deiminase que limitam significativamente a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos. Abreviaturas: CitH3 = histona Citrulinada H3; CLP = ligadura e punção cecal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A concentração sérica de CitH3 foi significativamente aumentada no modelo de sepse induzida por FLP e foi aliviada pela inibição da DAP. (A) Western blotting foi realizado para testar a concentração sérica de CitH3. Nenhum CitH3 foi detectado no grupo simulado. A concentração de CitH3 foi significativamente aumentada nos grupos FLP, e esse aumento foi bloqueado pelo tratamento com YW3-56. (B) As concentrações séricas de CitH3 foram medidas por ELISA. Quase nenhum CitH3 foi detectado no grupo simulado. Os grupos FLP apresentaram aumentos acentuados na CitH3, que foi atenuada pela administração de Cl-amidina. YW3-56 e Cl-amidina são ambos inibidores da DAP que limitam significativamente a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos. Abreviaturas: CitH3 = histona Citrulinada H3; CLP = ligadura e punção cecal; DAP = peptidil arginina deiminase. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A FLP introduz patógenos no abdômen para criar um modelo pré-clínico de sepse. Ao realizar a FLP, é importante utilizar condições estéreis para eliminar a interferência de bactérias exógenas e utilizar dosagens precisas de anestésicos16. Os três aspectos técnicos da FLP que afetam a gravidade e a replicabilidade do modelo de sepse são a porcentagem do ceco ligado, o tamanho da agulha usada para punção cecal e o volume de fezes espremidas na cavidade abdominal. A ligadura de aproximadamente 75% do ceco resulta em sepse grave, 50% de ligadura resulta em sepse moderada e 25% de ligadura ou menos resulta em sepse leve17. O número de punções e o tamanho da agulha determinam a taxa de mortalidade18, e o melhor resultado é obtido pela punção completa. Uma pequena quantidade (uma gota) de fezes é suficiente para causar peritonite bacteriana, e é necessário cuidado ao espremer as fezes. A FLP leva aproximadamente 10 minutos quando realizada por um indivíduo experiente.
O modelo de camundongo de sepse induzida por FLP descrito neste estudo tem várias limitações. Primeiro, o rato pode ser demasiado pequeno para obter amostras de sangue suficientes para análise de sangue periférico e medição de citocinas. Em segundo lugar, a FLP não pode ser realizada em animais recém-nascidos. Em terceiro lugar, a variabilidade ainda ocorre e resultados reprodutíveis podem não ser obtidos. É importante garantir que os cirurgiões tenham tido uma prática adequada na realização de FLP antes de realizar testes de pesquisa.
A FLP cria um modelo clinicamente realista de sepse que imita o processo fisiopatológico e os perfis de citocinas e tem sido amplamente utilizado em roedores. A gravidade da FLP pode ser manipulada para cumprir diferentes propósitos de estudo, ajustando o tamanho da agulha e a porcentagem do ceco ligado. De acordo com nossos resultados obtidos utilizando o modelo CLP, a detecção da concentração circulante de CitH3 possibilita o diagnóstico precoce de sepse em camundongos. O valor diagnóstico da concentração sérica de CitH3 permite o início imediato de tratamentos anti-sepse que melhoram significativamente os resultados de indivíduos sépticos.
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Disclosures
Não foram declarados conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Professor Wang Wei e ao Doutor Liu Shuai por ajudarem com os experimentos. Este trabalho foi financiado por doações do Financiamento de Pesquisa Jovem do Hospital Xiangya, Universidade Central do Sul (No. 2019Q10), da Fundação Nacional e de Ciência da Província de Hunan (No. 2020JJ4902) e da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 82202394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
References
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