Summary
يقدم هذا البروتوكول التفاصيل التشغيلية لربط وثقب cecal (CLP) في نموذج فأر من الإنتان. CLP هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع لإنشاء نموذج حيواني للإنتان. لذلك ، يلزم وجود بروتوكول CLP موحد لتحقيق نتائج بحثية موثوقة.
Abstract
الإنتان هو مرض خطير يهدد الحياة ويتطور بسرعة ويسبب ملايين الوفيات سنويا في جميع أنحاء العالم. بذل الباحثون جهودا هائلة لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية للإنتان باستخدام نماذج حيوانية مختلفة. يستخدم نموذج الفأر للإنتان الناجم عن ربط وثقب cecal (CLP) على نطاق واسع في المختبرات. الجوانب التقنية الثلاثة التي تؤثر على شدة وتكرار نموذج CLP هي النسبة المئوية للعرقور المربوط ، وحجم الإبرة المستخدمة في ثقب cecal ، وحجم البراز المعصور في تجويف البطن. التشخيص السريع والمحدد للإنتان هو عامل حاسم يؤثر على النتيجة. المعيار الذهبي لتشخيص الإنتان هو الثقافة الميكروبية. ومع ذلك ، فإن هذه العملية تستغرق وقتا طويلا وأحيانا غير دقيقة. يتم الكشف عن المؤشرات الحيوية الخاصة بالإنتان بسرعة ، لكن المؤشرات الحيوية الحالية غير مرضية بسبب عمر النصف القصير ، وعدم الخصوصية ، والحساسية غير الكافية. لذلك ، هناك حاجة ملحة لعلامة حيوية موثوقة للإنتان في المراحل المبكرة. تشير المنشورات السابقة إلى أن مصائد العدلات خارج الخلية المفرطة (NETs) تحدث في الإنتان. يتم رفع هيستون H3 (CitH3) ، كمكون NET ، في كل من الصرف الصحي والمرضى ، ووجود CitH3 هو علامة حيوية تشخيصية موثوقة للإنتان. تهدف الدراسة الحالية إلى وصف نموذج فأر موحد للإنتان الناجم عن CLP وإنشاء علامة حيوية موثوقة للدم للإنتان. قد يساهم عملنا في التشخيص المبكر والدقيق للإنتان في المستقبل.
Introduction
يعرف الإنتان بأنه خلل وظيفي في الأعضاء يهدد الحياة ناتج عن استجابة المضيف غير المنظمة للعدوى1 ، والصدمة الإنتانية هي السبب الرئيسي للوفاة في الحالات الشديدة من الإنتان2. يتسبب الإنتان والصدمة الإنتانية في ملايين الوفيات في جميع أنحاء العالم كل عام3. المفتاح لتحسين نتائج المرضى الذين يعانون من الإنتان هو البدء الفوري للعلاجات مثل المضادات الحيوية4. الطريقة القياسية الذهبية لتشخيص الإنتان هي الثقافة الميكروبية. ومع ذلك ، فإن الثقافة الميكروبية تستغرق وقتا طويلا ويمكن أن تؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة وسلبية كاذبة ، مما يحد بشكل كبير من الأهمية السريرية5. وبالتالي ، فمن المستحسن للغاية تحديد علامة حيوية الدم من الإنتان. يعرف البروكالسيتونين بأنه علامة حيوية مثالية للإنتان ولكن له فعالية تشخيصية محدودة لأنه غير قادر على التمييز بين الإنتان والأمراض المعقمة6.
يشيع استخدام ربط وثقب الفأر (CLP) لإنشاء نموذج للإنتان في البحث العلمي. CLP هو أحد أكثر نماذج الإنتان استخداما لأنه يحاكي التهاب الصفاق متعدد الميكروبات ، وينشط كل من الاستجابات المناعية الالتهابية والمضادة للالتهابات7. من المقبول جيدا أن CLP يخلق نموذج تعفن الدم أكثر ملاءمة سريريا من التقنيات البديلة ، مثل حقن السموم الداخلية البكتيرية. لذلك ، يعتبر CLP نموذج الإنتان الكلاسيكي للاستخدام في البحث8. ومع ذلك ، فإن العيب الرئيسي ل CLP هو قابليته للتكاثر ، حيث تتأثر شدة النموذج بعدة عوامل مثل النسبة المئوية لربط الأعور ، وحجم الإبرة ، وعدد الثقوب ، وتقنية فتح البطن. لذلك ، هناك حاجة لتوحيد نموذج الإنتان الناجم عن CLP. تصف الدراسة الحالية تفاصيل بروتوكول نموذج الإنتان الناجم عن CLP لإظهار الإجراء الموحد وزيادة قابليته للتكاثر.
تحدث الاستجابة الالتهابية في المرحلة المبكرة من الإنتان ، حيث تطلق العدلات كميات زائدة من المؤكسدات والبروتياز التي تسبب تلف الأعضاء8. أحد العوامل الرئيسية في الفيزيولوجيا المرضية للإنتان هو تكوين مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) ، والتي تطلق مكونات نووية وخلوية مثل الحمض النووي ، وهيستون الحمضيات ، والبروتينات المضادة للميكروبات9. تشير الدراسات الحديثة إلى أن التوليد المفرط للشبكات يتوسط في أمراض الإنتان. وفي الوقت نفسه ، فإن انخفاض NETs ، من خلال التثبيط الأنزيمي للببتيديل أرجينين ديميناز (PAD) بواسطة مواد كيميائية مثل YW3-56 أو Cl-amidine ، يمارس تأثيرا مؤيدا للبقاء في نماذج الفئران من الإنتان10,11. تم تحديد هيستون H3 (CitH3) كبروتين خاص بالإنتان في عام 201112 ، وقد أظهرت المنشورات اللاحقة أن تركيز CitH3 المتداول هو علامة حيوية تشخيصية موثوقة للإنتان13,14. يعتبر CitH3 علامة حيوية أكثر حساسية وطويلة الأمد من البروكالسيتونين ، وهو أكثر تحديدا في تمييز الإنتان من السيتوكينات الالتهابية13.
في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم علامة حيوية تشخيصية موثوقة للإنتان في نموذج فأر ناتج عن CLP للإنتان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة من قبل لجنة مراجعة الحيوانات في مستشفى Xiangya وجامعة سنترال ساوث (رقم 202103149).
1. التحضير
- حدد ذكور الفئران C57BL / 6J (الوزن: 20-25 جم ؛ العمر: 8-12 أسبوعا) والمنزل لمدة 3 أيام قبل تنفيذ أي إجراءات.
- وزن الماوس.
- تخدير الفأر بنسبة 1.5٪ إيزوفلوران عن طريق الاستنشاق وقرص أصابع القدم للتحقق من عمق التخدير.
- ثبت الماوس على وسادة التدفئة. ضع كريم مزيل الشعر على البطن واتركه لمدة لا تزيد عن 1 دقيقة قبل إزالة الكريم والشعر.
ملاحظة: يجب الحفاظ على درجة حرارة الجسم الطبيعية عن طريق وضع وسادة دافئة تحت الفأر المخدر أثناء الجراحة.
2. العملية
- إعداد أدوات جراحية معقمة مناسبة لجراحة القوارض. ارتداء قفازات معقمة وقناع للوجه وثوب جراحي لضمان ظروف معقمة.
- تطهير جلد البطن مع مناديل اليود ثلاث مرات على الأقل. قم بتغطية المنطقة الجراحية الجراحية بستائر جراحية معقمة.
- استخدم مقص جراحي معقم لعمل شق بطول 2 سم تقريبا في جدار البطن على طول خط ألبا.
ملاحظة: لا تتلف الأعضاء. - تحديد وعزل الأعور من التجويف البريتوني مع ملاقط معقمة.
- ربط 75 ٪ من حجم الأعور مع 4-0 خيوط الحرير. لا تقم بربط الأوعية الدموية المساريقية.
ملاحظة: تحدد النسبة المئوية للأعور المربوط شدة الإنتان. - ثقب الأعور عن طريق إنشاء ثقب واحد من خلال ومن خلال (فتحتين) مع إبرة 21 G (من جانب واحد من خلال جدار cecal إلى الجانب الآخر) في نقطة المنتصف بين نهاية الذيل ومجموعة الربط.
- تخلص من الإبرة. اضغط برفق على قطرة صغيرة من البراز من الأعور من خلال ثقوب الاختراق.
ملاحظة: يجب أن تكون كمية البراز التي يتم ضغطها في التجويف البريتوني متسقة ، لأن هذا يحدد أيضا شدة الإنتان. يجب تخطي الخطوات 2.5-2.7 للفئران الوهمية. - استبدل الأعور برفق في تجويف البطن.
- أغلق عضلات البطن والجلد بشكل منفصل باستخدام 6-0 خيوط حريرية.
- تطهير شق مع اليود.
- حقن كيتوبروفين (5 ملغ / كغ) في الربع السفلي الأيسر من البطن لتجنب الأعور. ضع الماوس على وسادة دافئة حتى يتعافى تماما من المخدر.
- ضع الفأر في قفص في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها (22 درجة مئوية) وامنح حرية الوصول إلى الطعام والماء. تحقق من الماوس كل 6 ساعات للأسبوع الأول بعد الجراحة.
- القتل الرحيم للفأر بجرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون عندما تلتقي أعراض الإنتان بنقاط النهاية المحددة مسبقا.
3. العلاج
- قسم الفئران عشوائيا إلى مجموعة وهمية ، ومجموعة CLP ، ومجموعة CLP + YW3-56 (الشكل 2 أ) ، ومجموعة CLP + Cl-amidine (الشكل 1).
ملاحظة: خضعت المجموعة الوهمية لنفس الإجراءات التي خضعت لها مجموعات CLP باستثناء CLP. تم إعطاء YW3-56 (5 ملغ/كغ) أو كل-أميدين (40 ملغ/كغ) عن طريق الحقن البريتوني بعد ساعة واحدة من الخطوة 2.9 عند خياطة طبقة العضلات والجلد. - حصاد العينة
- حصاد الدم المحيطي من الضفيرة خلف المنظار15 24 ساعة بعد العملية.
- حضري المصل بالطرد المركزي (1000 × جم ، 5 دقائق) واحفظيه في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- قم بقياس تركيز CitH3 باستخدام مجموعة ELISA شطيرة غير مباشرة كما هو موضح سابقا13.
- قم بتغطية الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل CitH3 على صفيحة من 96 بئرا لالتقاط بروتين CitH3.
- عالج المصل باستخدام DNase I (150 وحدة / مل ، 37 درجة لمدة 1 ساعة) واحتضانه في الآبار (20 ميكرولتر ، درجة حرارة الغرفة).
- أضف الجسم المضاد متعدد النسيلة المضاد ل CitH3 (0.33 ميكروغرام / مل ، 100 ميكرولتر ، 2 ساعة) للكشف عن بروتين CitH3 الذي تم التقاطه.
- احتضان الجسم المضاد الثانوي المسمى بالبيروكسيديز المضاد للأرانب (0.02 ميكروغرام / مل ، 100 ميكرولتر ، 1 ساعة) في الآبار.
- بعد الغسيل الشامل ، قم بتطوير الآبار باستخدام 3،3 '، 5،5'-رباعي ميثيل بنزيدين (100 ميكرولتر ، 20 دقيقة).
ملاحظة: تم توفير مزيد من تفاصيل البروتوكول لمجموعة ELISA في المنشور السابق13.
- التحليل الإحصائي
- قم بإجراء تحليل ANOVA بطريقة واحدة لتحليل الاختلافات بين المجموعات الثلاث ، متبوعا باختبار Bonferroni اللاحق للمقارنات المتعددة. استخدم برنامجا إحصائيا لإجراء التحليل. واعتبرت قيم p البالغة 0.05 أو أقل ذات دلالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كما هو موضح في الشكل 2A ، لم يتم اكتشاف CitH3 في المجموعة الوهمية عن طريق النشاف الغربي. زاد تركيز CitH3 في المصل بشكل ملحوظ بعد CLP ، وتم حظر هذه الزيادة عن طريق تثبيط تكوين NET عن طريق إعطاء YW3-56 ، مثبط PAD10. يوضح الشكل 2B تركيزات المصل CitH3 التي تحددها ELISA. في 24 ساعة بعد CLP ، تم زيادة تركيز مصل CitH3 في مجموعات CLP مقارنة بالمجموعة الوهمية (p = 0.0008) ، وتم تخفيف هذه الزيادة في CitH3 بشكل كبير بواسطة Cl-amidine ، مثبط PAD الذي يحد من تكوين NET (p = 0.0028).
الشكل 1: التجميع التجريبي. تم تقسيم الفئران عشوائيا إلى مجموعة وهمية ، ومجموعة CLP ، ومجموعة CLP + YW3-56 (A) ، ومجموعة CLP + Cl-amidine (B). تم تنفيذ CLP كما هو موضح في البروتوكول. تم إعطاء YW-3-56 (5 ملغ/كغ) أو كل أميدين (40 ملغ/كغ) عن طريق الحقن البريتوني بعد 1 ساعة من CLP. خضعت المجموعة الصورية لنفس الإجراءات التي خضعت لها مجموعات CLP باستثناء CLP. تم جمع الدم في نقاط زمنية مختلفة ، وتم تحضير المصل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. YW3-56 و Cl-amidine كلاهما مثبطات الببتديل أرجينين ديميناز التي تحد بشكل كبير من تكوين مصائد العدلات خارج الخلية. الاختصارات: CitH3 = هيستون سيترولين H3 ؛ CLP = ربط وثقب cecal. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: زاد تركيز مصل CitH3 بشكل ملحوظ في نموذج الإنتان الناجم عن CLP وتم تخفيفه عن طريق تثبيط PAD . (أ) تم إجراء النشاف الغربي لاختبار تركيز CitH3 في المصل. لم يتم الكشف عن CitH3 في المجموعة الوهمية. تم زيادة تركيز CitH3 بشكل ملحوظ في مجموعات CLP ، وتم حظر هذه الزيادة بواسطة علاج YW3-56. (ب) تم قياس تركيزات مصل CitH3 بواسطة ELISA. لم يتم اكتشاف أي CitH3 تقريبا في المجموعة الوهمية. أظهرت مجموعات CLP زيادات ملحوظة في CitH3 ، والتي تم تخفيفها من خلال إدارة Cl-amidine. YW3-56 و Cl-amidine كلاهما مثبطات PAD التي تحد بشكل كبير من تكوين مصائد العدلات خارج الخلية. الاختصارات: CitH3 = هيستون سيترولين H3 ؛ CLP = ربط وثقب cecal ؛ PAD = الببتيد أرجينين ديميناز. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يدخل CLP مسببات الأمراض في البطن لإنشاء نموذج ما قبل السريري للإنتان. عند إجراء CLP ، من المهم استخدام ظروف معقمة للقضاء على تداخل البكتيريا الخارجية واستخدام جرعات دقيقة من التخدير16. الجوانب التقنية الثلاثة ل CLP التي تؤثر على شدة نموذج الإنتان وإمكانية تكراره هي النسبة المئوية لربط الأعور ، وحجم الإبرة المستخدمة في ثقب cecal ، وحجم البراز الذي يتم ضغطه في تجويف البطن. يؤدي ربط ما يقرب من 75٪ من الأعور إلى تعفن الدم الشديد ، ويؤدي ربط 50٪ إلى تعفن الدم المعتدل ، ويؤدي ربط 25٪ أو أقل إلى تعفن الدمالخفيف 17. يحدد عدد الثقوب وحجم الإبرة معدل الوفيات18 ، ويتم الحصول على أفضل نتيجة عن طريق الثقب من خلال وعبر. كمية صغيرة (قطرة) من البراز تكفي للتسبب في التهاب الصفاق الجرثومي ، والحذر مطلوب عند الضغط على البراز. يستغرق CLP حوالي 10 دقائق عند تنفيذه من قبل فرد متمرس.
نموذج الفأر للإنتان الناجم عن CLP الموصوف في هذه الدراسة له العديد من القيود. أولا ، قد يكون الفأر صغيرا جدا للحصول على عينات دم كافية لتحليل الدم المحيطي وقياس السيتوكين. ثانيا ، لا يمكن إجراء CLP في الحيوانات حديثة الولادة. ثالثا ، لا يزال التباين يحدث ، وقد لا يتم الحصول على نتائج قابلة للتكرار. من المهم التأكد من أن الجراحين لديهم ممارسة كافية في أداء CLP قبل إجراء اختبارات البحث.
يخلق CLP نموذجا واقعيا سريريا للإنتان يحاكي العملية الفيزيولوجية المرضية وملامح السيتوكين وقد استخدم على نطاق واسع في القوارض. يمكن التلاعب بشدة CLP لتحقيق أغراض الدراسة المختلفة عن طريق ضبط حجم الإبرة والنسبة المئوية للطرف المربوط. وفقا لنتائجنا التي تم الحصول عليها باستخدام نموذج CLP ، فإن اكتشاف تركيز CitH3 المتداول يتيح التشخيص المبكر للإنتان في الفئران. تتيح القيمة التشخيصية لتركيز CitH3 في المصل البدء الفوري للعلاجات المضادة للإنتان التي تحسن بشكل كبير من نتائج الأفراد المصابين بالإنتان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر البروفيسور وانغ وي والدكتور ليو شواي للمساعدة في التجارب. تم تمويل هذا العمل من خلال منح من تمويل أبحاث الشباب في مستشفى Xiangya ، جامعة سنترال ساوث (رقم 2019Q10) ، ومن المؤسسة الوطنية والعلوم في مقاطعة هونان (رقم 2020JJ4902) ، ومن المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82202394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
References
- Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Shankar-Hari, M., et al. Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).
- Fleischmann-Struzek, C., et al. Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis. Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).
- Evans, L., et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021. Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).
- Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol. Systematic Reviews. 7 (1), 216 (2018).
- Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Hotchkiss, R., Karl, I. The pathophysiology and treatment of sepsis. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
- Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis. Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Liang, Y., et al. Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia. European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).
- Deng, Q., et al. Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice. Frontiers in Immunology. 10, 2957 (2019).
- Li, Y. Q., et al. Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock. Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).
- Pan, B., et al. CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock. Scientific Reports. 7 (1), 8972 (2017).
- Park, Y., et al. An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils. Small. 16 (1), 1905611 (2020).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Brook, B., et al. A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis. Journal of Visualized Experiments. (143), e58574 (2019).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).
