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Perfil de todo el genoma de las interacciones de unión al factor de transcripción-ADN en Candida albicans: un método cut&RUN completo y un flujo de trabajo de análisis de datos

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63655
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2,4, 3, 1,4, 1,4
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Department of Applied Mathematics, University of California, Merced, 4Health Sciences Research Institute, University of California, Merced
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo describe un método experimental y un flujo de trabajo de análisis de datos para la escisión bajo objetivos y la liberación utilizando nucleasa (CUT&RUN) en el patógeno fúngico humano Candida albicans.

Abstract

Los factores de transcripción reguladores controlan muchos procesos biológicos importantes, incluida la diferenciación celular, las respuestas a las perturbaciones y tensiones ambientales, y las interacciones huésped-patógeno. Determinar la unión de todo el genoma de los factores de transcripción reguladores al ADN es esencial para comprender la función de los factores de transcripción en estos procesos biológicos a menudo complejos. La escisión bajo objetivos y la liberación mediante nucleasa (CUT&RUN) es un método moderno para el mapeo de todo el genoma de las interacciones de unión proteína-ADN in vivo que es una alternativa atractiva a la inmunoprecipitación de cromatina tradicional y ampliamente utilizada seguida por el método de secuenciación (ChIP-seq). CUT&RUN es susceptible de una configuración experimental de mayor rendimiento y tiene un rango dinámico sustancialmente más alto con menores costos de secuenciación por muestra que ChIP-seq. Aquí, se describe un protocolo cut&RUN completo y el flujo de trabajo de análisis de datos que lo acompaña adaptado para el análisis de todo el genoma de las interacciones de unión al factor de transcripción-ADN en el patógeno fúngico humano Candida albicans . Este protocolo detallado incluye todos los procedimientos experimentales necesarios, desde el etiquetado de epítopos de genes codificantes de factores de transcripción hasta la preparación de bibliotecas para la secuenciación; además, incluye un flujo de trabajo computacional personalizado para el análisis de datos CUT&RUN.

Introduction

Candida albicans es un patógeno fúngico humano polimórfico clínicamente relevante que existe en una variedad de modos diferentes de crecimiento, como el modo de crecimiento planctónico (flotante libre) y como comunidades de células estrechamente adheridas protegidas por una matriz extracelular, conocida como el modo de crecimiento de biopelícula 1,2,3. Al igual que otros procesos de desarrollo y celulares, el desarrollo de biopelículas es un rasgo importante de virulencia de C. albicans que se sabe que está controlado a nivel transcripcional por factores de transcripción reguladores (TF) que se unen al ADN de una manera específica de la secuencia4. Recientemente, los reguladores de cromatina y los modificadores de histonas también han surgido como importantes reguladores de la formación de biopelículas de C. albicans 5 y la morfogénesis6 al mediar la accesibilidad del ADN. Para comprender la compleja biología de este importante patógeno fúngico, son valiosos los métodos efectivos para determinar la localización de todo el genoma de TF específicos durante distintos procesos de desarrollo y celulares.

La inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación (ChIP-seq) es un método ampliamente utilizado para investigar las interacciones proteína-ADN en C. albicans 5,6 y ha reemplazado en gran medida el método de inmunoprecipitación de cromatina más clásico seguido de microarray (ChIP-chip)9. Sin embargo, tanto los métodos ChIP-seq como ChIP-chip requieren un gran número de células de entrada10, lo que puede ser un factor complicado cuando se investigan TF en el contexto de muestras y modos de crecimiento específicos, como biopelículas recolectadas de pacientes o modelos animales de infección. Además, el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) a menudo produce una cantidad significativa de señal de fondo en todo el genoma, lo que requiere un alto nivel de enriquecimiento para que el objetivo de interés separe suficientemente la señal del ruido. Si bien el ensayo de chip ChIP está en gran medida desactualizado hoy en día, las profundidades de secuenciación necesarias para ChIP-seq hacen que este ensayo sea prohibitivamente costoso para muchos investigadores, particularmente aquellos que estudian múltiples TF y / o proteínas asociadas a la cromatina.

La escisión bajo objetivos y la liberación mediante nucleasa (CUT&RUN) es una alternativa atractiva a ChIP-seq. Fue desarrollado por el laboratorio Henikoff en 2017 para eludir las limitaciones de la escisión endógena ChIP-seq y la cromatina seguida de la secuenciación ChEC-seq11,12, otro método para identificar las interacciones proteína-ADN a nivel de todo el genoma, al tiempo que proporciona un mapeo de alta resolución de todo el genoma de TF y proteínas asociadas a la cromatina13 . CUT&RUN se basa en la digestión dirigida de la cromatina dentro de los núcleos permeabilizados utilizando nucleasas microcócicas atadas, seguidas de la secuenciación de los fragmentos de ADN digeridos 9,10. Como los fragmentos de ADN se generan específicamente en los loci que están unidos por una proteína de interés, en lugar de generarse en todo el genoma a través de la fragmentación aleatoria como en los ensayos ChIP, el enfoque CUT&RUN da como resultado señales de fondo muy reducidas y, por lo tanto, requiere 1/10de la profundidad de secuenciación en comparación con ChIP-seq11,13, 14. Estas mejoras conducen en última instancia a reducciones significativas en los costos de secuenciación y reducciones en el número total de células de entrada necesarias como material de partida para cada muestra.

Aquí, se describe un robusto protocolo CUT&RUN que ha sido adaptado y optimizado para determinar la localización de todo el genoma de TF en células de C. albicans aisladas de biopelículas y cultivos planctónicos. También se presenta una tubería de análisis de datos exhaustiva, que permite el procesamiento y análisis de los datos de secuencia resultantes y requiere que los usuarios tengan una experiencia mínima en codificación o bioinformática. Brevemente, este protocolo describe el etiquetado de epítopos de genes codificantes de TF, la recolección de biopelículas y células planctónicas, el aislamiento de núcleos permeabilizados intactos, la incubación con anticuerpos primarios contra la proteína específica o la proteína marcada con epítopos de interés, la vinculación de las proteínas de fusión quiméricas de nucleasa microcócica A / G (pAG-MNasa) a los anticuerpos primarios, la recuperación del ADN genómico después de la digestión de la cromatina y la preparación de bibliotecas de ADN genómico para la secuenciación.

El protocolo experimental CUT&RUN es seguido por una tubería de análisis de datos especialmente diseñada, que toma lecturas de secuenciación de ADN en bruto en formato FASTQ e implementa todos los pasos de procesamiento requeridos para proporcionar una lista completa de loci significativamente enriquecidos unidos por el TF de interés (dirigido por el anticuerpo primario). Tenga en cuenta que varios pasos del protocolo de preparación de bibliotecas descrito se han adaptado y optimizado específicamente para el análisis CUT&RUN de TF (a diferencia de los nucleosomas). Si bien los datos presentados en este manuscrito se generaron utilizando adaptaciones específicas de TF de un kit comercial CUT&RUN, estos protocolos también se han validado utilizando componentes de origen individual (es decir, enzima pAG-MNasa y perlas de purificación de ADN magnético) y tampones preparados internamente, lo que puede reducir significativamente el costo experimental. Los protocolos experimentales y de análisis de datos completos se describen en detalle a continuación en un formato paso a paso. Todos los reactivos y equipos críticos, así como las recetas de tampón y medios, se enumeran en la Tabla de Materiales y el Archivo Complementario 1, respectivamente.

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Protocol

1. Etiquetado de epítopos de cepas de C. albicans

  1. Cargue el gen de interés, junto con sus secuencias de flanqueo ascendentes y descendentes de 1 kb, desde la base de datos del genoma de Candida a la herramienta de diseño de imprimación (consulte la Tabla de materiales). Diseñe un ARN guía (ARNg) resaltando 50 pb aguas arriba y aguas abajo del codón de parada, y haga clic en la herramienta de selección de ARNg a la derecha. Seleccione Diseñar y analizar guías. Utilice el genoma de Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploide)) y un motivo adyacente (PAM) del protoespaciador NGG (SpCas9, 3' side) para los parámetros de la guía, y haga clic en Finalizar. La Figura 1 describe el flujo de trabajo para el etiquetado de epítopos de un gen de interés de C. albicans con proteína fluorescente verde mejorada (eGFP).
    1. En la página siguiente, confirme la región de destino para el diseño de ARNg y presione el botón verde. Ordenar los gRNAs por la puntuación on-target.
      NOTA: La herramienta de diseño de imprimación calcula las puntuaciones en el objetivo y fuera del objetivo para cuantificar la especificidad de los gRNAs. Una guía ideal tiene una puntuación en el objetivo de >60, una puntuación fuera del objetivo de ~ 33 y se superpone al codón de parada. Esto permite una alta especificidad de gRNA mientras se ablaciona la orientación de gRNA después de la integración de GFP. Un ARNg con una puntuación fuera del objetivo de ~50 indica variación alélica; por lo tanto, solo un alelo será reconocido por el ARNg.
    2. Agregue las secuencias (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') y (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') a los extremos 5' y 3', respectivamente, de la secuencia diana de ARNg de 20 pb, creando un cebador/oligonucleótido de 60 pb. Alternativamente, copie la secuencia de 20 pb a la calculadora de ARNg suministrada por Nguyen et al.15. Solicite el oligonucleótido gRNA personalizado de 60 pb.
    3. Amplificar el "fragmento A universal" con 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCC-3') y 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') y el "fragmento B único" con el oligonucleótido gRNA personalizado de 60 pb (100 mM) del paso 1.1.2. y 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGGGTTTAAACACCG-3') utilizando pADH110 (ID de repositorio de plásmidos Nº 90982) y pADH139 (ID de repositorio de plásmidos Nº 90987), respectivamente, como ADN de plantilla. Utilice las condiciones de reacción y ciclo de PCR proporcionadas en la Tabla 1.
      NOTA: pADH139 es específico para cepas que llevan el marcador heterólogo Candida maltosa LEU2 . Si utiliza una cepa con una sola copia del gen C. albicans LEU2 , sustituya pADH119 (repositorio de plásmidos ID# 90985) en lugar de pADH139.
    4. Confirme la amplificación exitosa verificando 5 μL de la PCR en un gel de agarosa al 1%. Busque ~1 kb A y B fragmentos amplicones.
    5. Mezcle 1 μL cada uno de los fragmentos A y B y coselos utilizando las condiciones de reacción y ciclo de PCR proporcionadas en la Tabla 2 para crear un fragmento C de longitud completa.
    6. Añadir 0,5 μL de 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') y 0,5 μL de 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3') a cada reacción de PCR, mezclar bien mediante pipeteo y completar las condiciones de ciclo enumeradas en la Tabla 3.
      NOTA: Si utiliza pADH119 en lugar de pADH139, sustituya AHO1238 (5'-TGTATTTTTTTTTTTTAAAATTTTAGTGACTGTTTC-3') en lugar de AHO1453.
    7. Confirme la costura y amplificación adecuadas del fragmento de C comprobando 5 μL de la PCR en un gel de agarosa al 1%. Busque un amplicon de ~2 kb. Guarde el fragmento C a -20 °C hasta que esté listo para su uso.
      NOTA: Si la costura y la amplificación dan como resultado múltiples bandas inespecíficas o frotis, realice una limpieza por PCR de los fragmentos A y B y repita el paso 1.1.5.
  2. Agregue toda la eGFP monomérica optimizada para CTG con secuencia enlazadora (RIPLING)16 (pCE1, repositorio de plásmidos ID# 174434) inmediatamente aguas arriba del codón de parada del gen de interés utilizando la herramienta de diseño de imprimación, creando una fusión traslacional C-terminal. Utilice este constructo para diseñar oligonucleótidos para amplificar el ADN del donante (dDNA) a partir de pCE1.
    1. Diseñe un oligonucleótido hacia adelante con homología de 18-22 pb a la secuencia enlazadora y homología de >50 pb al extremo 3' del marco de lectura abierto (ORF).
      NOTA: La homología de 18-22 pb crea una temperatura de recocido para la amplificación entre 55 °C y 58 °C. Si el oligonucleótido de longitud completa forma dímeros de imprimación, ajuste la homología a la secuencia del enlazador / GFP o al genoma en consecuencia.
    2. Cree un oligonucleótido inverso con homología de 18-22 pb al extremo 3' de GFP y homología de >50 pb a la secuencia no codificante aguas abajo del ORF a etiquetar.
    3. Ordene estos oligonucleótidos y amplifique el dDNA utilizando las condiciones de ciclo de PCR de aterrizaje proporcionadas en la Tabla 4.
  3. Diseñar dos conjuntos de oligonucleótidos de PCR de colonias (cPCR) para confirmar la integración de GFP mediante la amplificación a través de los sitios de integración de flanqueo. Primero, seleccione el oligonucleótido dDNA hacia adelante utilizando la herramienta de diseño de imprimación y haga clic en el botón Imprimación a la derecha.
    1. Haga clic en Crear cartillas | | del asistente Tm Param y confirmar que el algoritmo está configurado en SantaLucia 1998. Haga clic en Usar selección para introducir las coordenadas del oligonucleótido directo diseñado en 1.2.1 como secuencia de destino.
    2. Ajuste la temperatura óptima de imprimación a 55 °C y el tamaño máximo del amplicó a 900 pb, y haga clic en el botón Generar imprimaciones en la parte superior derecha.
    3. Seleccione el par de oligonucleótidos con la puntuación de penalización más baja y confirme que los cebadores se amplifican en el sitio de integración de 5'. Asegúrese de que el cebador cPCR hacia adelante se encuentra aguas arriba de la secuencia del cebador dDNA hacia adelante y el cebador cPCR inverso completamente dentro de la etiqueta eGFP o la secuencia del enlazador.
    4. Repita los pasos 1.3-1.3.3. con el oligonucleótido dDNA inverso para crear el segundo conjunto de oligonucleótidos cPCR que se amplifican a través del sitio de integración 3'. Asegúrese de que el cebador cPCR hacia adelante se encuentre completamente dentro de la etiqueta eGFP o la secuencia del enlazador y el cebador cPCR inverso aguas abajo de la secuencia del cebador dDNA inverso.
    5. Ordene estos oligonucleótidos.
  4. Digest 2.500 ng de pADH140, que contiene Cas9 (repositorio de plásmidos ID# 90988), con enzima de restricción para cada gen que debe ser marcado con GFP. Establecer el volumen total de cada digestión en 15 μL; ajustar el volumen de agua en consecuencia en función de la concentración de plásmidos pADH140. Utilice las condiciones de digestión especificadas en la Tabla 5. Guarde el plásmido digerido a -20 °C hasta que esté listo para su uso.
    NOTA: Si transforma una cepa con una sola copia del gen C. albicans LEU2 , en lugar del marcador heterólogo C. maltosa LEU2 , sustituya pADH137 (repositorio de plásmidos ID# 90986) en lugar de pADH140.
  5. Desnaturalizar 12 μL de ADN de espermatozoides de salmón de 10 mg/ml para cada gen que será marcado con GFP a 99 °C durante 10 min y se enfriará rápidamente a ≤4 °C. Conservar a -20 °C hasta que esté listo para su uso.
  6. Coloque una cepa sensible a la nourseotricina hemicigota LEU2 de C. albicans sobre placas de levadura peptona dextrosa (YPD) e incube a 30 °C durante dos días.
  7. Seleccione una sola colonia y transfiérala a 4 ml de YPD líquido. Incubar durante 12-16 h a 30 °C con agitación a 250 rpm.
  8. Mida la densidad óptica a 600 nm (OD600) del cultivo nocturno (12-16 h) en un espectrofotómetro utilizando una cubeta desechable (1 ml, 1 cm de longitud de trayectoria).
  9. Diluya el cultivo nocturno en un matraz Erlenmeyer a un OD600 de 0.1 en YPD. Tenga en cuenta 5 ml por reacción e incluya 5 ml adicionales para verificar el OD600 más tarde.
    NOTA: El volumen de la cultura depende del número de reacciones de transformación.
  10. Incubar el cultivo diluido durante la noche en una incubadora de agitación a 30 °C con agitación a 250 rpm hasta que alcance un OD600 de 0.5-0.8.
  11. Centrifugadora a 4.000 × g a temperatura ambiente durante 5 min; retire y deseche el sobrenadante.
  12. Resuspenda el pellet celular en 1 ml de agua estéril mediante una mezcla suave de pipetas con puntas de filtro y transfiéralo a un tubo de microfuge estéril de 1,5 ml.
  13. Pellet de las células mediante centrifugación a 4.000 × g a temperatura ambiente durante 1 min; retire y deseche el sobrenadante. Resuspend en 1 ml de agua estéril y repetir durante un total de dos lavados.
  14. Resuspend el pellet en 1/100del volumen utilizado en el paso 1.10. Por ejemplo, si se utilizaron 15 ml, resuspenda el pellet en 150 μL de agua estéril.
  15. En un tubo separado para cada reacción de transformación, mezcle 50 μL de fragmento C, 50 μL de dDNA, 2.500 ng de pADH140 digerida por enzimas de restricción y 10 μL de ADN de espermatozoides de salmón desnaturalizados.
  16. Añadir 50 μL de la suspensión celular del paso 1.14 y mezclar mediante pipeteo.
  17. Haga un inventario de la mezcla de placas (Archivo Suplementario 1) para transformaciones n + 1.
  18. Agregue 1 ml de la mezcla de placas a la mezcla de células / ADN y mezcle invirtiendo 5 veces.
    NOTA: Toque la parte inferior de los tubos mientras invierte para desalojar cualquier líquido restante.
  19. Coloque la mezcla en una incubadora a 30 °C durante la noche (12-16 h) sin agitar.
  20. Choque térmico de las células durante 15 min a 44 °C en un baño de agua.
  21. Centrifugar los tubos de microfuge de 1,5 ml a 5.000 × g a temperatura ambiente durante 2 min.
  22. Retire la mezcla PLATE por aspiración al vacío utilizando puntas de pipeta estériles, teniendo cuidado de no molestar el pellet celular.
  23. Resuspendir el pellet celular en 1 mL de YPD, pellet por centrifugación a 4.000 × g a temperatura ambiente durante 1 min, y retirar y desechar el sobrenadante. Repita para un segundo lavado, vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de YPD y transfiera la suspensión a un tubo de cultivo desechable de fondo redondo de 10 ml que contenga 1 ml adicional de YPD (2 ml de volumen final). Recuperar las células a 30 °C con agitación a 250 rpm durante 5 h.
  24. Centrifugar los tubos a 4.000 × g a temperatura ambiente durante 5 min; retire y deseche el sobrenadante.
  25. Resuspend el pellet celular en 100 μL de agua estéril y placa en YPD suplementado con 200 μg/mL de nourseotricina (NAT200). Incubar a 30 °C durante 2-3 días.
  26. Alícuota 100 μL de 20 mM naOH en los pozos de una placa PCR de 96 pocillos, con cada pozo correspondiente a una colonia individual que creció en las placas NAT200. Usando un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta, elija colonias transformadas individuales, aplíquelas en una nueva placa NAT200 y agite las células restantes en un pozo con 20 mM NaOH. Repita para las colonias restantes para crear el lisado celular utilizado como plantilla de ADN para la reacción cPCR.
  27. Selle la placa de PCR e incube durante 10 min a 99 °C en un termociclador con tapa caliente.
  28. Configure dos reacciones de cPCR con los oligonucleótidos diseñados en los pasos 1.3-1.3.5. Aumente el número de reacciones según sea necesario. Realizar la reacción de PCR con el lisado celular preparado en el paso 1.26 siguiendo las condiciones de ciclo y las mezclas de reacción de PCR de la Tabla 6. Ejecute 10-20 μL de cada pozo en un gel de agarosa al 1%. Busque colonias con amplificación de los dos conjuntos de cebadores cPCR que indiquen GFP dDNA incorporado correctamente.
  29. Colonias restreak que incorporaron GFP en medios sintéticos completos (SC) carentes de leucina. Incubar en una incubadora de 30 °C durante 2-3 días. Elija colonias individuales y aplique parches en YPD e YPD complementados con placas de nourseotricina (NAT400) de 400 μg / ml. Identifique las colonias que no crecen en las placas NAT400 después de 24 h como aquellas que han perdido con éxito los componentes CRISPR.
  30. Confirme que la etiqueta GFP se conserva repitiendo los pasos 1.25-1.28 utilizando celdas de la placa de parche YPD. Si las bandas correctas están presentes, inocule en 4 ml de YPD y crezca durante la noche (12-16 h), como se describe en el paso 1.7.
  31. Mezcle el cultivo nocturno de la nueva cepa marcada con GFP con glicerol al 50% esterilizado por filtro en una proporción de 1: 1 en un criotubo estéril. Conservar a -80 °C y volver a colocar en placas YPD según sea necesario.
    NOTA: Se recomienda validar las cepas marcadas con GFP confirmando la localización nuclear de la TF marcada a través de microscopía fluorescente y confirmando un fenotipo de tipo salvaje en un ensayo fenotípico apropiado.

2. Preparación de muestras de cultivos de biopelículas

  1. Streak C. albicans cepa(s) marcada(s) con GFP en placas de agar YPD e incubar a 30 °C durante 2-3 días. Usando una sola colonia aislada de la placa de agar, inocule en 4 ml de medio líquido YPD. Incubar a 30 °C con agitación durante la noche (12-16 h). Determinar el OD600 de la(s) cultura(s) nocturna(s).
    NOTA: Se recomienda utilizar tres réplicas biológicas por muestra para los experimentos CUT&RUN.
  2. Inocular una placa de cultivo celular estéril de 12 pocillos sin tratar con el cultivo nocturno a un OD600 final de 0.5 (equivalente a 2 × 107 células / ml) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medio a un volumen final de 2 ml. Incubar durante 90 min a 37 °C en una incubadora de microplacas con agitación a 250 rpm.
    NOTA: Se recomienda utilizar una placa de cultivo celular de 12 pocillos por cepa con un pocillo sin ininocular como control de contaminación medio solo. Este protocolo se ha aplicado con éxito utilizando tan solo 1/10 de una placa de cultivo celular de 12 pocillos (o tan solo 5 millones de células). El uso de un mayor número de células aumenta el rendimiento total de ADN, lo que generalmente resulta en bibliotecas de secuenciación de alta calidad.
  3. Retire las células sin herrar por aspiración utilizando puntas de pipeta estériles unidas a través de tubos de plástico flexibles a un aparato trampa de vacío. Lave las células adheridas una vez con 2 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) 1x. Añadir 2 ml de medio RPMI-1640 fresco a los pocillos e incubar durante 24 h a 37 °C con agitación a 250 rpm.
    NOTA: Cambie las puntas de las pipetas entre pozos de diferentes cepas y/o condiciones. No raspe el fondo del pozo con la punta mientras aspira.
  4. Al final de la incubación de 24 horas, recolecte y agrupe el material líquido y de biopelícula de cada uno de los 11 pozos inoculados en un solo tubo cónico estéril de 50 ml. Repita según sea necesario con grupos independientes si procesa más de una cepa o condición de crecimiento al mismo tiempo.
    NOTA: Raspe los fondos y bordes de cada pozo con una punta de filtro de pipeta para desalojar las celdas que permanecen adheridas a la superficie. Utilice la pipeta para homogeneizar las biopelículas.
  5. Muestras de pellets por centrifugación a 4.000 × g a temperatura ambiente durante 5 min. Decantar la mayor cantidad posible del sobrenadante, teniendo cuidado de minimizar la interrupción del pellet. Congele el pellet en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C inmediatamente después de la recolección o continúe directamente con el paso 4 (aislamiento de núcleos).

3. Preparación de muestras de cultivos planctónicos

  1. Streak C. albicans cepa(s) marcada(s) con GFP en placas de agar YPD e incubar a 30 °C durante 2-3 días. Usando una sola colonia aislada de la placa de agar, inocule en 4 ml de medio líquido YPD. Incubar a 30 °C con agitación durante la noche (12-16 h). Determinar el OD600 de la(s) cultura(s) nocturna(s).
  2. Volver a diluir los cultivos durante la noche a OD600 de 0,1 en 50 ml de medio líquido RPMI-1640 e incubar a 30 °C con agitación a 225 rpm durante 2-5 h hasta que OD600 esté entre 0,5 y 0,8.
    NOTA: Las células deben pasar por al menos dos duplicaciones antes de ser cosechadas. Las condiciones utilizadas para los cultivos planctónicos se pueden ajustar según sea necesario.
  3. Pellet las muestras por centrifugación a 4.000 × g a temperatura ambiente durante 5 min. Decantar la mayor cantidad posible del sobrenadante, teniendo cuidado de minimizar la interrupción del pellet. Congele el pellet en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C inmediatamente después de la recolección o continúe directamente con el paso 4 (aislamiento de núcleos).

4. Aislamiento de núcleos

NOTA: El día del experimento, prepare Ficoll Buffer fresco, agregue 2-mercaptoetanol e inhibidor de proteasa a las alícuotas del Tampón de Resuspensión y agregue el inhibidor de proteasa a las alícuotas del Tampón SPC (consulte el Archivo Suplementario 1). Para resuspendir los gránulos, pipetee suavemente usando puntas de pipeta de 200 μL o 1 ml para evitar dañar las células o los núcleos. Antes de comenzar el aislamiento de los núcleos, encienda el bloque de calor para precalentarlo a 30 °C. Todas las puntas y tubos de pipeta para el resto de este protocolo deben estar certificados libres de ADN / ARN y DNasa / RNasa, y se recomienda el uso de puntas de filtro para todos los pasos posteriores de pipeteo.

  1. Resuspend pellet(s) en 1 mL de Tampón de Resuspensión a temperatura ambiente y transfiéralo a un tubo estéril de microfuge de 1,5 mL. Pellet a 2.000 × g a temperatura ambiente durante 2 min en una centrífuga de mesa y retira el sobrenadante.
    NOTA: Retire el sobrenadante con la punta de pipeta de 200 μL o 1 ml, teniendo cuidado de minimizar la interrupción de los gránulos.
  2. Resuspend el gránulo(s) en 200 μL de Tampón de Resuspensión a temperatura ambiente. Del pellet resuspendido, transfiera una alícuota de 5 μL a un nuevo tubo de PCR y guárdela a 4 °C para su uso posterior.
    NOTA: Esta alícuota se utilizará como control durante un paso posterior de control de calidad para evaluar la calidad de los núcleos aislados.
  3. Pellet a 2.000 × g durante 2 min y retira y desecha el sobrenadante con una pipeta. Repita el paso de lavado dos veces con 200 μL de tampón de resuspensión.
  4. Centrifugar a 2.000 × g a temperatura ambiente durante 2 min y retirar el sobrenadante. Añadir 300 μL de tampón de resuspensión y 10 μL de solución de liticasa (50 mg/ml, consulte la Tabla de materiales). Incubar durante 30 min a 30 °C en un bloque de calor.
    NOTA: Alternativamente, también se puede usar un baño de agua calentado a 30 ° C en lugar de un bloque de calor. Las condiciones de esferoplastación utilizadas aquí se han optimizado para ser efectivas tanto para la levadura como para las células hifales de C. albicans. Se recomienda optimizar las condiciones de esferoplastación al aplicar este protocolo a células de C. albicans con mutaciones que afectan la integridad de la pared celular u otras morfologías celulares. Durante este paso de incubación de 30 minutos, el usuario tiene la opción de completar el paso 5 (Concanavalin A Bead Activation) con anticipación para ahorrar tiempo.
    1. PASO CRÍTICO: Después de la etapa de incubación de 30 minutos, transfiera una alícuota de 5 μL a un nuevo tubo de PCR. A los 5 μL de núcleos aislados y a la alícuota de 5 μL de células intactas almacenadas a 4 °C a partir del paso 4.2, añadir 1 μL de calcofluor blanco (un colorante fluorescente de la pared celular) y 1 μL de SYTO 13 (una tinción de ácido nucleico). Incubar a 30 °C en la oscuridad durante 30 min.
    2. Inspeccione visualmente la integridad y pureza de los núcleos aislados utilizando un microscopio de fluorescencia. Busque núcleos aislados que muestren núcleos intactos prominentemente teñidos (utilizando un filtro de excitación de 488-509 nm) y asegúrese de que no haya tinción en la pared celular por el tinte blanco calcofluor (utilizando un filtro de excitación de 390-420 nm). En las células de control intactas, busque una tinción prominente de la pared celular mediante el tinte blanco calcofluor (utilizando un filtro de excitación de 390-420 nm) y núcleos intactos teñidos (utilizando un filtro de excitación de 488-509 nm).
  5. Centrifugar a 2.000 × g a 4 °C durante 5 min y retirar el sobrenadante. Resuspend el pellet en 500 μL de Tampón de Resuspensión helado usando puntas de filtro de 1 ml pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Centrifugar a 2.000 × g a 4 °C durante 5 min, y retirar el sobrenadante con una pipeta de 1 ml. Resuspender el pellet con 1 ml de Ficoll Buffer helado recién hecho.
    NOTA: Mantenga las muestras y los búferes en hielo desde este punto en adelante.
  6. Centrifugar las muestras a 5.000 × g a 4 °C durante 10 min y retirar el sobrenadante. Resuspend el pellet en 500 μL de tampón SPC helado.
    NOTA: A partir de este momento, manipule los núcleos con extrema suavidad para evitar dañarlos.
  7. Centrifugar las muestras a 5.000 × g a 4 °C durante 10 min y retirar la mayor cantidad posible del sobrenadante sin interrumpir el pellet. Coloque los tubos que contienen los núcleos granulados sobre hielo y proceda al paso 5. Si el paso 5 ya se completó antes de tiempo en el paso 4.4, continúe con el paso 6 o congele los gránulos en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 ° C inmediatamente después de la recolección.

5. Activación de cuentas de Concanavalin A

NOTA: Este es un paso crítico. A partir de este momento, los usuarios tienen la opción de continuar con el protocolo utilizando un kit CUT&RUN disponible comercialmente o componentes clave de origen individualmente y preparar búferes internamente. Si utiliza el kit comercial, todos los tampones y reactivos utilizados a continuación se incluyen en el kit a menos que se indique lo contrario. Los números de catálogo individuales para el abastecimiento de reactivos de forma independiente también se proporcionan en la Tabla de materiales. Enfríe todos los tampones en hielo antes de usarlos. Una vez que se completa el paso 5, se recomienda proceder al paso 6 inmediatamente. Evite la congelación y descongelación múltiple de núcleos aislados, ya que se sabe que aumenta el daño al ADN y podría conducir a resultados de mala calidad.

  1. Resusped suavemente las cuentas de concanavalina A (ConA) usando una pipeta. Transfiera 22 μL de suspensión de perlas ConA por muestra para ser procesada en un solo tubo de microfuge de 1,5 ml. Coloque el tubo en una rejilla magnética hasta que la suspensión de cuentas esté clara; retire y deseche el sobrenadante con una pipeta.
    NOTA: Al realizar CUT&RUN para un total de 10 muestras, por ejemplo, transfiera 220 μL de la suspensión de perlas ConA a un tubo de microfuge de 1,5 ml.
  2. Retire el tubo que contiene las perlas ConA de la rejilla magnética e inmediatamente agregue 200 μL de búfer de activación de perlas helado y mezcle suavemente con una pipeta. Coloque el tubo en la rejilla magnética hasta que la suspensión de cuentas esté clara; retire y deseche el sobrenadante con una pipeta. Repita este paso para un total de dos lavados.
  3. Resuspendir las perlas en 22 μL de Bead Activation Buffer helado por muestra de núcleos a procesar. Mantenga las cuentas en hielo hasta que sea necesario.
    NOTA: El rendimiento de los pasos siguientes depende del número y la capacidad de los bastidores de tubos magnéticos disponibles. El procesamiento de 32 muestras en dos bastidores de tubos de 16 pocillos es un número manejable para la mayoría de los usuarios de este protocolo. Sin embargo, un mayor rendimiento es posible para usuarios más experimentados, o si hay sistemas robóticos de manejo de líquidos disponibles.

6. Unión de núcleos a perlas activadas

NOTA: Enfríe todos los tampones en hielo antes de usarlos. Todos los tampones suplementados con inhibidores de la proteasa deben prepararse frescos el día del experimento. Se recomienda utilizar tubos de tira de 0,2 ml en los pasos siguientes.

  1. Resuspend los núcleos granulados del paso 4 en 100 μL de SPC Buffer helado y transfiéralos a una nueva tira de 8 tubos y 0,2 ml. Agregue 20 μL de las perlas activadas a cada muestra y pipetee suavemente para mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min sin agitación.
  2. Coloque los tubos en la rejilla magnética hasta que la suspensión esté clara; retire y deseche el sobrenadante con una pipeta. Retire los tubos de la rejilla magnética y agregue 200 μL de tampón de lavado helado a cada muestra. Resuspend las cuentas canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Transfiera 100 alícuotas de μL de cada muestra a una nueva tira de 8 tubos y 0,2 ml.
    1. PASO CRÍTICO: Divida cada muestra de CUT&RUN en dos alícuotas separadas. Use una de las alícuotas para el anticuerpo de control negativo (por ejemplo, anticuerpo de control negativo IgG) y la otra para el anticuerpo objetivo contra la proteína de interés (por ejemplo, anticuerpo anti-GFP).
      NOTA: Ambas muestras son necesarias para que la canalización computacional identifique con precisión las señales de enriquecimiento específicas del TF de interés. También se puede realizar un control adicional utilizando anticuerpos anti-GFP con una cepa no etiquetada. Este control ha mostrado resultados comparables al uso de anticuerpos IgG en una cepa marcada con GFP. Por lo tanto, para simplificar, se recomienda utilizar el control IgG estándar para todos los experimentos.

7. Unión primaria a anticuerpos

NOTA: La proteína de fusión pAG-MNasa se une bien a los anticuerpos IgG de conejo, cabra, burro, conejillo de indias y ratón17. En general, la mayoría de los anticuerpos comerciales certificados por ChIP-seq son compatibles con los procedimientos CUT&RUN. La cantidad de anticuerpo primario utilizado depende de la eficiencia del anticuerpo, y la titulación del anticuerpo (por ejemplo, dilución final 1:50, 1:100, 1:200 y 1:400) puede ser necesaria si el anticuerpo de interés no se ha probado previamente en experimentos ChIP o CUT&RUN. Enfríe todos los tampones en hielo antes de usarlos. Todos los tampones utilizados para los pasos de unión de anticuerpos deben prepararse frescos el día del experimento.

  1. Coloque los tubos en una rejilla magnética y espere hasta que la suspensión esté completamente clara; retire y deseche el sobrenadante con una pipeta. Añadir 50 μL del antibody Buffer y mezclar suavemente mediante pipeteo.
  2. Añadir 3 μL del anticuerpo policlonal anti-GFP (o 0,5 μg si se utiliza un anticuerpo no probado). Incubar los tubos en una batidora nutating a 4 °C durante 2 h.
    NOTA: Algunos protocolos CUT&RUN informan un mayor rendimiento al agregar un anticuerpo secundario antes de la adición de pAG-MNasa14; sin embargo, no se observó una mejoría significativa con este paso adicional y, por lo tanto, no está incluido en este protocolo.
  3. Centrifugar brevemente los tubos a 100 × g a temperatura ambiente durante 5 s, colocar los tubos en una rejilla magnética y, una vez que la suspensión esté clara, retirar y desechar el sobrenadante con una pipeta. Mientras los tubos que contienen las perlas todavía están en el bastidor magnético, agregue 200 μL de tampón de permeabilización celular helado directamente sobre las cuentas. Retire y deseche el sobrenadante con una pipeta. Repita para un total de dos lavados con el tampón de permeabilización celular helado.
  4. Agregue 50 μL de tampón de permeabilización celular helado a cada tubo y mezcle suavemente mediante pipeteo.
    NOTA: Las cuentas a menudo se agregan en este punto, pero se pueden dispersar fácilmente mezclando suavemente con una pipeta de 200 μL.

8. Unión de la pAG-MNasa al anticuerpo

  1. Añadir 2,5 μL de la pAG-Mnase (20x stock) a cada muestra y mezclar suavemente mediante pipeteo. Coloque las muestras (ligeramente elevadas en un ángulo de ~45°) en un nutator a 4 °C. Encienda el nutator e incube las muestras durante 1 h.
  2. Centrifugar brevemente los tubos de la tira a 100 × g a temperatura ambiente durante 5 s, colocar los tubos en una rejilla magnética y, una vez que la suspensión esté despejada, retirar y desechar el sobrenadante con una pipeta.
    NOTA: Este paso es crítico. El anticuerpo de arrastre que queda en la tapa o los lados de los tubos después de este paso aumentará significativamente la cantidad de señal de fondo.
  3. Mientras los tubos que contienen las perlas todavía están en el bastidor magnético, agregue 200 μL de tampón de permeabilización celular helado, permita que la suspensión se despeje y retire y deseche el sobrenadante con una pipeta. Repita este paso para un total de dos lavados con el tampón de permeabilización celular.
  4. Agregue 100 μL del tampón de permeabilización celular helado a las muestras y pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces.

9. Digestión y liberación de cromatina dirigida

  1. Incubar los tubos que contienen la(s) muestra(s) en un baño de hielo húmedo durante 5 min. Añadir 3 μL de CaCl2 de 100 mM a cada muestra utilizando una pipeta multicanal. Pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces, devuelva inmediatamente los tubos al baño de hielo húmedo e incube durante 30 minutos.
  2. Agregue 66 μL del Stop Buffer a cada muestra y mezcle suavemente el vórtice. Incubar muestras durante 10 min a 37 °C en un baño seco.
    NOTA: Se recomienda agregar 1,5 pg de ADN heterólogo de E. coli por muestra en el Stop Buffer. La adición de 1.5 pg de ADN de pico de E. coli da como resultado 1,000-10,000 lecturas de pico mapeadas para 1-10 millones de lecturas experimentales mapeadas14. El PICO de ADN se utiliza para calibrar la profundidad de secuenciación y es especialmente importante para comparar muestras en una serie. La adición de E. coli es muy recomendable, pero no esencial. El kit comercial CUT&RUN incluye ADN de pico de E. coli , pero también se puede comprar por separado.
  3. Coloque los tubos en el bastidor magnético y transfiera 160 μL del sobrenadante a un tubo de microfuge de 1,5 ml. Transfiera 80 μL de la muestra a un nuevo tubo de microfugio de 2 ml y guárdelo a -20 °C en caso de que se necesite una muestra de respaldo. Continúe con el paso 10 con la muestra de 80 μL.

10. Limpieza de muestras de ADN recogidas

NOTA: Incubar perlas de purificación de ADN a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso. Prechill 100% isopropanol sobre hielo. Al mezclar las muestras, pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces.

  1. Perlas de purificación de ADN de vórtice para homogeneizar la suspensión de cuentas. Agregue 50 μL (~ 0.6x volumen de muestra) de las perlas resuspendidas a cada muestra. Mezcle con pipeta e incube las muestras en un nutator durante 5 min a temperatura ambiente.
    NOTA: La proporción de perlas de purificación de ADN con respecto a la muestra utilizada es crítica. El uso de un volumen de 0,6 veces de solución de perla de purificación de ADN en relación con la muestra permite que las perlas magnéticas se unan a grandes fragmentos de ADN liberados de núcleos dañados. Los fragmentos de ADN enriquecidos con CUT&RUN son mucho más pequeños que estos grandes fragmentos de ADN y, por lo tanto, se retienen en el sobrenadante en este paso.
  2. Coloque los tubos en un bastidor magnético y transfiera 130 μL del sobrenadante que contiene el ADN a una tira de 8 tubos de 0,2 ml. Agregue 30 μL adicionales de perlas de purificación de ADN a la(s) muestra(s) (el volumen total es de 160 μL).
  3. Agregue 170 μL (~ 1x volumen de muestra) de isopropanol 100% helado, mezcle bien mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10 veces, e incube en hielo durante 10 minutos.
    NOTA: Es fundamental que se utilice isopropanol 100% frío para este paso para que las perlas de purificación de ADN capturen eficientemente los pequeños fragmentos enriquecidos con CUT&RUN.
  4. Coloque los tubos en la rejilla magnética y, una vez que la suspensión se haya despejado, retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
  5. Mientras los tubos están en el estante magnético, agregue 200 μL de etanol recién preparado al 80% a temperatura ambiente a los tubos e incube a temperatura ambiente durante 30 s. Retire con cuidado y deseche el sobrenadante con una pipeta. Repita este paso para un total de dos lavados con etanol al 80%.
  6. Gire rápidamente los tubos a 100 × g, vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética y retire el etanol residual con una pipeta después de que la suspensión se haya eliminado. Seque al aire las perlas durante 5 minutos mientras los tubos permanecen en la rejilla magnética con la tapa abierta.
    NOTA: No exceda los 5 minutos de tiempo de secado, ya que esto puede reducir significativamente el rendimiento final de ADN.
  7. Retire los tubos del bastidor magnético y eluya el ADN de las perlas agregando 17 μL de 0.1x Tris-EDTA (TE) a pH 8. Mezclar bien e incubar los tubos durante 5 min a temperatura ambiente.
  8. Coloque los tubos en la rejilla magnética hasta que la suspensión se aclare. Una vez que la suspensión se haya eliminado, transfiera cuidadosamente 15 μL del sobrenadante a un tubo de PCR estéril de 0,2 ml.
  9. Mida la concentración del ADN recolectado usando un fluorómetro siguiendo el protocolo del fabricante.
    NOTA: Típicamente, la concentración del ADN recolectado es de ~1 ng/μL. A veces, la concentración del ADN recolectado es demasiado baja para cuantificarla usando un fluorómetro. Esto no es un indicador de un experimento fallido. Continúe con la preparación de la biblioteca independientemente de la concentración del ADN recolectado.
  10. Continúe con el paso 11 o guarde las muestras a -20 °C hasta que estén listas.

11. Preparación de la biblioteca para la secuenciación

NOTA: Los pasos siguientes utilizan un kit de preparación de biblioteca disponible comercialmente. Al realizar los pasos con la Mezcla Maestra de Ligación, minimice tocar los tubos y manténgalos siempre en hielo.

  1. Usando 0.1x TE a pH 8, eleve el volumen total del ADN CUT&RUN a 50 μL. Haga una mezcla maestra de 3 μL de End Prep Enzyme Mix y 7 μL de End Prep Reaction Buffer por muestra. Agregue 10 μL de mezcla maestra al ADN CUT&RUN y mezcle bien canalizando hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
  2. Realice un giro rápido a 100 × g para recoger todo el líquido de los lados del tubo. Coloque los tubos en un termociclador con la tapa calefactada configurada a ≥75 °C y ejecute las condiciones de ciclo en la Tabla 7.
    NOTA: Dependiendo de las concentraciones iniciales de ADN de entrada recogidas del paso 10, siga la dilución del adaptador requerida de la Tabla 8.
  3. Añadir 2,5 μL de adaptador por muestra y mezclar bien mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
    NOTA: Es fundamental que el adaptador se agregue a la muestra y se mezcle a fondo antes de agregar la mezcla maestra de ligadura.
  4. Haga una mezcla maestra de 30 μL de Ligation Master Mix y 1 μL de Ligation Enhancer. Añadir 31 μL de la mezcla maestra a la(s) muestra(s). Mezclar bien mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
  5. Incubar a 20 °C durante 15 min en un termociclador con la tapa caliente apagada.
    NOTA: Es fundamental que las muestras se mantengan en hielo y se transfieran al termociclador solo después de que el termociclador haya alcanzado los 20 °C.
  6. Realice un giro rápido a 100 × g para recoger todo el líquido de los lados del tubo, agregue 3 μL de enzima de escisión de uracilo e incube los tubos en el termociclador a 37 ° C durante 15 minutos con la tapa calentada a ≥47 ° C.
    NOTA: Este es un punto de parada seguro; conservar las muestras a -20 °C o continuar directamente hasta el paso 11.7. Si continúa directamente con el paso 11.7, incube las perlas de purificación de ADN a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso.
  7. Agregue 154.4 μL (~ 1.6x volumen de muestra) de las perlas de purificación de ADN a la reacción de ligadura del adaptador del paso 11.6. Pipete-mezclar e incubar las muestras durante 5 min a temperatura ambiente.
  8. Coloque los tubos en la rejilla magnética y una vez que la suspensión se haya despejado, retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
  9. Añadir 200 μL de etanol recién preparado, a temperatura ambiente al 80% a los tubos e incubar a temperatura ambiente durante 30 s. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y repita este paso durante un total de dos lavados con etanol al 80%.
  10. Gire los tubos brevemente a 100 × g. Vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética y retire el etanol residual con una pipeta. Seque al aire las perlas durante 5 minutos mientras los tubos permanecen en la rejilla magnética con la tapa abierta.
    NOTA: No exceda los 5 minutos de tiempo de secado, ya que esto puede reducir significativamente el rendimiento final de ADN.
  11. Retire los tubos del bastidor magnético y eluya el ADN de las perlas agregando 17 μL de 0.1x TE a pH 8. Mezclar bien e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  12. Coloque los tubos en la rejilla magnética hasta que la suspensión se aclare. Una vez que la suspensión se haya eliminado, transfiera cuidadosamente 15 μL del sobrenadante a un tubo de PCR estéril de 0,2 ml.
  13. Haga una mezcla maestra de 25 μL de DNA Polymerase Master Mix y 5 μL de Universal Forward Library Amplification Primer (10 μM) por muestra.
    NOTA: Prepare una muestra adicional de mezcla maestra para tener en cuenta las pérdidas de pipeteo.
  14. Agregue 30 μL de la mezcla maestra a los 15 μL de la muestra de ADN ligada por el adaptador. Agregue 5 μL de imprimación de amplificación de biblioteca indexada de forma única inversa (10 μM) a cada muestra para llevar el volumen final a un total de 50 μL. Mezcle bien canalizando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Realizar las condiciones de ciclo de PCR en la Tabla 9.
    NOTA: Incubar las perlas de purificación de ADN a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso.
  15. Vórtice las cuentas de purificación de ADN para resuspend. Agregue 35 μL (~ 0.7x volumen de muestra) de las perlas resuspendidas a las muestras de ADN amplificadas por PCR. Mezclar e incubar las muestras en un nutator durante 5 min a temperatura ambiente.
  16. Coloque los tubos en el bastidor magnético y, una vez que la suspensión esté despejada, transfiera el sobrenadante que contiene el ADN a un nuevo tubo de tira de PCR de 8 pocillos de 0,2 ml.
  17. Agregue 119 μL (~ 1.4x volumen de muestra) de cuentas a la muestra y mezcle mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Incubar las muestras en un nutator durante 5 min a temperatura ambiente.
  18. Coloque los tubos en la rejilla magnética y una vez que la suspensión se haya despejado, retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
  19. Añadir 200 μL de etanol recién preparado, a temperatura ambiente al 80% a los tubos e incubar a temperatura ambiente durante 30 s. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta; repita el paso para un total de dos lavados con etanol al 80%.
  20. Gire los tubos brevemente a 100 × g. Vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética y retire el etanol residual con una pipeta. Seque al aire las perlas durante 5 minutos mientras los tubos permanecen en la rejilla magnética con la tapa abierta.
    NOTA: No exceda los 5 minutos de tiempo de secado, ya que esto puede reducir significativamente el rendimiento final de ADN.
  21. Retire los tubos del bastidor magnético y eluya el ADN de las perlas agregando 14 μL de 0.1x TE a pH 8. Mezclar bien e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  22. Coloque los tubos en la rejilla magnética hasta que la suspensión se aclare. Una vez que el purín se haya eliminado, transfiera cuidadosamente 13 μL del sobrenadante a un tubo de PCR estéril de 0,2 ml.
  23. Prepare 1x Tris-borate-EDTA fresco (TBE) e inserte gel de TBE de acrilamida al 10% prefabricado y comercial en el aparato de electroforesis en gel lleno de 1x TBE.
  24. En el primer pozo, agregue 2 μL de escalera de ADN de bajo rango. Mezclar 3 μL de colorante de carga 6x con 13 μL de la muestra previamente recogida en el paso 11.22. Agregue cuidadosamente 15 μL en cada pocillo del gel. Pasar el gel durante 90 min a 70 V.
    NOTA: Se recomienda dejar un pozo en el gel vacío entre cada muestra, ya que esto reduce la probabilidad de contaminación cruzada de la muestra. Los usuarios experimentados pueden encontrar apropiado usar todos los pozos evitando cuidadosamente la contaminación cruzada, particularmente cuando procesan una gran cantidad de muestras.
  25. Retire el gel yeso de la caja de gel. Abra el molde de gel según las instrucciones del fabricante, retire suavemente el gel del molde de gel y colóquelo dentro de una bandeja de retención de gel que contenga 100 ml de 1x TBE.
    NOTA: Asegúrese de quitar suavemente el gel del molde de gel para evitar rasgar el gel, ya que es delgado y frágil. Es fundamental prewet guantes y el gel con 1x TBE siempre que se manipule el gel. La bandeja de sujeción del gel debe ser ligeramente más grande que el tamaño del gel (aproximadamente 0.5 "en cada lado). Las tapas de plástico provistas con cajas de almacenamiento de tubos de PCR de 96 pocillos son bandejas de sujeción convenientes para tamaños de mini gel estándar.
  26. Agregue 10 μL de la mancha de gel de ácido nucleico a la bandeja y revuelva suavemente. Cubra con papel de aluminio para proteger de la luz e incube estáticamente a temperatura ambiente durante 10 min.
  27. Enjuague el gel dos veces con 100 ml de agua del grifo desionizada. Imagine el gel bajo iluminación de luz azul usando una cubierta de filtro ámbar (Figura 2).
    NOTA: Las bibliotecas exitosas muestran una mancha entre 100 y 500 pb. También habrá una banda prominente de dímero adaptador ~ 125. La presencia de dímeros adaptadores no es un indicador de mala calidad de la biblioteca. Esta cantidad de dímeros adaptadores es inevitable para los experimentos CUT&RUN realizados en TF de baja abundancia y es una consecuencia de la baja cantidad de material de entrada utilizado para preparar estas bibliotecas. No use luz ultravioleta, que puede dañar el ADN.
  28. Como se muestra en la Figura 2, para cada biblioteca, corte el gel ligeramente por encima de la banda prominente del dímero del adaptador de ~ 125 pb (asegurándose de evitar tocar la banda del dímero del adaptador) y por debajo de la marca de la escalera de 400 pb.
    NOTA: Es fundamental evitar la banda del dímero del adaptador ~ 125. Incluso pequeñas cantidades de dímeros adaptadores reducirán significativamente la calidad de la biblioteca.
  29. Perfore la parte inferior de un tubo de 0,65 ml con una aguja de 22 G y coloque el tubo perforado dentro de un tubo de microfugio estéril de 2 ml. Transfiera la rodaja de gel al tubo perforado dentro del tubo de microfuge de 2 ml.
  30. Centrifugar el tubo de microfuge de 2 ml que contiene el tubo perforado de 0,65 ml y la muestra a 10.000 × g a temperatura ambiente durante 2 minutos para recoger la suspensión de gel dentro del tubo de microfugio de 2 ml.
    NOTA: El tubo perforado ahora debe estar vacío y se puede desechar. Si el tubo perforado todavía tiene gel restante en el interior, coloque el tubo perforado de nuevo dentro del tubo de microfuge de 2 ml y centrífique nuevamente a 10,000 × g a temperatura ambiente durante 2 minutos adicionales.
  31. A la suspensión de gel dentro del tubo de microfuge de 2 ml, agregue 300 μL de tampón de elución de gel helado y mezcle en un nutator a temperatura ambiente durante un mínimo de 3 h o durante la noche (12-16 h).
  32. Transfiera toda la suspensión de líquido y gel a una columna de filtro de 0,22 μm. Centrifugadora a 10.000 × g a temperatura ambiente durante 1 min; el volumen recolectado debe ser de ~300 μL.
  33. Agregue 450 μL (~ 1.5x volumen de muestra) de perlas de purificación de ADN, incube a temperatura ambiente durante 5 minutos en un nutator y luego coloque la muestra en el estante magnético hasta que la suspensión esté clara.
    NOTA: Incubar las perlas de purificación de ADN a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso.
  34. Retire y deseche 500 μL del sobrenadante, asegurándose de no interrumpir las perlas.
  35. Retire la muestra del bastidor magnético y mezcle las perlas mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Transfiera 200 μL de la muestra a un nuevo tubo de tira de PCR.
  36. Coloque el tubo de tira en la rejilla magnética y, una vez que la suspensión se haya despejado, retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
  37. Añadir 200 μL de etanol recién preparado, a temperatura ambiente al 80% a los tubos e incubar a temperatura ambiente durante 30 s. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta; repita este paso para un total de dos lavados con etanol al 80%.
  38. Gire los tubos brevemente a 100 × g. Vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética y retire el etanol residual con una pipeta. Seque al aire las perlas durante un máximo de 5 minutos mientras los tubos permanecen en la rejilla magnética con la tapa abierta.
    NOTA: No exceda los 5 minutos de tiempo de secado, ya que esto puede reducir significativamente el rendimiento final de ADN.
  39. Retire los tubos del bastidor magnético y eluya el ADN de las perlas agregando 17 μL de 0.1x TE a pH 8. Mezclar bien e incubar los tubos durante 5 min a temperatura ambiente.
  40. Coloque los tubos en la rejilla magnética hasta que la suspensión se aclare. Una vez que la suspensión se haya eliminado, transfiera cuidadosamente 15 μL del sobrenadante a un tubo de PCR estéril de 0,2 ml.
  41. Mida la cantidad final de la biblioteca utilizando el fluorómetro; utilice esta biblioteca final para la secuenciación.
    NOTA: Se pueden agrupar y secuenciar hasta 48 bibliotecas en un solo carril utilizando una plataforma de secuenciación que proporciona al menos 300 millones de lecturas de extremo pareado de 40 pb o más.

12. Análisis de secuencia CUT&RUN

NOTA: En esta sección se presenta el protocolo computacional utilizado para analizar los datos de secuencia cut&RUN. El protocolo comienza con la configuración del entorno virtual computacional y guía a los usuarios a través de la ejecución de los comandos en su máquina local. Este protocolo funcionará en todos los recursos computacionales, como máquinas locales, servidores virtuales en la nube y clústeres de computación de alto rendimiento. Se puede acceder a todos los datos de CUT&RUN presentados en este documento en NCBI GEO con el número de acceso GSE193803.

  1. Descargue el código fuente para el análisis CUT&RUN desde https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis.
    NOTA: El flujo de trabajo funcionará mejor en un sistema operativo MacOS o Linux. Los usuarios de Windows pueden ejecutar el flujo de trabajo con GitBash (consulte la Tabla de materiales).
    1. Descargue directamente el código de la página de GitHub haciendo clic en el botón verde Código | Descargar opción ZIP . Descomprima la carpeta en una ubicación relevante en el equipo local.
  2. Instale el entorno Conda (consulte la Tabla de materiales) y ejecútelo solo una vez.
    NOTA: Este flujo de trabajo utiliza el entorno de herramientas de línea de comandos de Conda para instalar todo el software y las herramientas necesarias.
  3. Una vez instalado Conda (ejecutarse solo una vez), cree un entorno virtual utilizando el archivo complementario 2 proporcionado con el siguiente comando:
    conda create --name --file Supplementary_File_2.txt
  4. Active el entorno virtual cada vez que se vaya a ejecutar este flujo de trabajo utilizando:
    conda activate
  5. Organice los archivos FASTQ sin procesar de entrada en una sola carpeta, idealmente una carpeta por experimento CUT&RUN.

13. Generación del archivo del genoma para la alineación

  1. Genere el archivo del genoma para la alineación (ejecute solo una vez para cada archivo del genoma). Cree una carpeta para guardar todos los archivos del genoma de C. albicans , como:
    mkdir ca_genome_files

14. Descarga del ensamblaje del genoma de C. albicans 21

  1. Descargue el ensamblaje del genoma de C. albicans 21 de la base de datos del genoma de Candida utilizando herramientas wget o curl (consulte la Tabla de materiales)18.
    NOTA: El ensamblaje 21 de C. albicans se utilizó aquí para comparar los resultados de CUT&RUN con los resultados de chIP-chip publicados anteriormente, que se alinearon con el ensamblaje 21. Los usuarios pueden descargar otras versiones de ensamblaje y ejecutar comandos similares para generar archivos de genoma relevantes para sus necesidades de alineación.

15. Generar una base de datos de índice Bowtie 2 (nombre de la base de datos: ca21)

  1. Utilice lo siguiente:
    bowtie2-build C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
    pajarita2-inspeccionar -s ca21

16. Ejecute la canalización de análisis cut&RUN

  1. Lea la sección de ayuda para familiarizarse con los parámetros de la canalización.
    bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. Ejecute el archivo cut_n_run_pipeline.sh con los parámetros relevantes

  1. Ejecute el script:
    bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y y y > /path/to/output.log 2>&1
    NOTA: Los parámetros relevantes con descripciones detalladas en las líneas 19-36 del código se describen en la página de GitHub https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh.

18. Organizar archivos de salida

  1. Combine picos significativos de todas las réplicas llamadas por MACS2 ubicadas en /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 utilizando la función de combinación de BedTools19.
    cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files ordenar -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o last,mean,first,mean,mean,mean,mean > /path/to/merged_output.bed
    NOTA: Para obtener información adicional y mejores prácticas sobre la evaluación de picos superpuestos en muestras replicadas, consulte Landt et al.20 y Boyd et al.21.

19. Elimine las coincidencias en las regiones genómicas listadas en bloque utilizando la función de restar de BedTools

  1. Utilice lo siguiente: subtractBed -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
    NOTA: Las regiones bloqueadas en el genoma de C. albicans se proporcionan como un archivo .bed en el archivo complementario 3. La lista consiste principalmente en elementos y regiones de secuencia altamente repetitivos, como repeticiones teloméricas y centrómeros que comúnmente producen resultados falsos positivos en conjuntos de datos de C. albicans CUT&RUN, ChIP-seq y ChIP-chip. Por lo tanto, se recomienda eliminar las regiones bloqueadas. Sin embargo, para ciertos objetivos de proteínas, puede ser inapropiado o indeseable excluir estos loci. Los usuarios pueden omitir este paso para conservar las señales contenidas en estas regiones bloqueadas o crear sus propias regiones bloqueadas.

20. Combinar archivos BigWig de réplicas utilizando la función UCSC bigWigMerge22

  1. Utilice lo siguiente: bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
  2. Convierta la salida de BedGraph de bigWigMerge a BigWig utilizando la función BEDGraphToBigWig de UCSC.
    bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

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Representative Results

Este robusto protocolo CUT&RUN fue adaptado y optimizado para investigar la localización de todo el genoma de TF específicos en biopelículas de C. albicans y cultivos planctónicos (ver Figura 2 para una visión general del enfoque experimental). También se incluye una tubería de análisis de datos exhaustiva para facilitar el análisis de los datos de secuenciación CUT&RUN resultantes y requiere que los usuarios tengan una experiencia mínima en codificación o bioinformática (consulte la Figura 3 para obtener una descripción general de la canalización de análisis). Contrariamente a los métodos ChIP-chip y ChIP-seq, CUT&RUN se lleva a cabo utilizando núcleos intactos y permeabilizados preparados a partir de un número significativamente reducido de células de entrada, sin reticulación de formaldehído. Aislar núcleos intactos de esferoplastos de C. albicans es un paso crítico en el protocolo. La esferoplastación eficiente a través de la digestión de la pared celular de C. albicans utilizando liticasa puede ser un desafío, ya que las condiciones de reacción de digestión enzimática deben optimizarse para cada tipo de célula. Por lo tanto, para garantizar un experimento CUT&RUN exitoso con resultados de secuenciación de alta calidad, se incluye un paso de control de calidad temprano y se verifica la presencia de núcleos intactos utilizando un microscopio de fluorescencia estándar.

La digestión de la pared celular y la integridad nuclear se evalúan regularmente visualizando tanto las células intactas de control como los núcleos aislados teñidos con la pared celular fluorescente y las tinciones de ácido nucleico. A diferencia de los núcleos intactos aislados, donde no se observa tinción de la pared celular, tanto los núcleos como las paredes celulares están marcados fluorescentemente en las células de control intactas (Figura 4A). Por último, antes de la secuenciación, la distribución del tamaño del fragmento de las bibliotecas CUT&RUN se evalúa utilizando un instrumento de electroforesis capilar. Este paso de control de calidad es una medida confiable para evaluar la calidad de las bibliotecas CUT&RUN. Como se ve en el rastro de electroforesis en el panel superior de la Figura 4B, las bibliotecas exitosas generadas para experimentos que investigan TF muestran un alto enriquecimiento para fragmentos menores de 280 pb. El rastro de electroforesis en el panel inferior de la Figura 4B representa los resultados de un experimento CUT&RUN fallido.

Aquí, el pico de ~ 2,000 pb surgió principalmente del ADN no digerido liberado de núcleos ampliamente dañados o rotos durante el experimento CUT&RUN. También se recomienda evaluar la distribución del tamaño de fragmento de las bibliotecas agrupadas finales para confirmar la eliminación completa de los dímeros adaptadores contaminantes (Figura 4C). Por lo general, 5-10 millones de lecturas de extremo pareado (~ 40 longitud de lectura base) por biblioteca proporcionan suficiente profundidad de secuenciación para la mayoría de los experimentos tf CUT&RUN en C. albicans. Las longitudes de lectura de secuenciación alternativas, ya sea de extremo pareado o de un solo extremo, se pueden utilizar para secuenciar bibliotecas CUT&RUN. Por ejemplo, las longitudes de lectura de extremo pareado entre 25 y 150 pb no deben afectar la calidad de los resultados. Las lecturas de un solo extremo mayores o iguales a 150 pb también deberían funcionar para los experimentos TF CUT&RUN. Sin embargo, la canalización de análisis de datos que la acompaña debe modificarse para adaptarse a las lecturas de un solo extremo.

Este protocolo CUT&RUN y la tubería de análisis de datos que lo acompaña se validaron mediante la investigación de dos TF, Ndt80 y Efg1, que controlan la formación de biopelículas de C. albicans . Como se muestra en la Figura 4D, Ndt80 está unido a regiones intergénicas (resaltadas por las barras negras que indican loci de chip ChIP Ndt80 significativamente enriquecidos) aguas arriba del ORF EFG1 . Esta región intergénica aguas arriba de EFG1 se demostró previamente que estaba altamente enriquecida para la unión a Ndt80 durante la formación de biopelículas por ChIP-chip4. Sin embargo, los experimentos CUT&RUN identificaron significativamente más picos dentro de esta región que los experimentos con chip ChIP (10 picos frente a 4 picos). Los motivos de unión al ADN Ndt80 se enriquecen en todos los loci unidos a Ndt80 identificados por CUT&RUN (Figura suplementaria 1), lo que indica que los picos adicionales identificados por esta metodología son probablemente sitios de buena fe unidos a Ndt80. Un análisis comparativo sistemático indicó que este protocolo CUT&RUN presentado identificó con éxito la mayoría de los eventos de unión previamente conocidos para Ndt80 y Efg1 durante la formación de biopelículas4 (Figura 5).

Además, muchos nuevos eventos de enlace tf que no fueron capturados en los experimentos de chip ChIP publicados anteriormente se identificaron utilizando CUT&RUN (Figura 5). En general, tanto Ndt80 como Efg1 se unieron a loci superpuestos con datos de chip ChIP publicados anteriormente y a loci identificados solo utilizando el método CUT&RUN (las superposiciones entre estos datos cut&RUN y los datos de chip ChIP publicados previamente para Ndt80 y Efg1 se resumen en los diagramas de Venn en la Figura 5). Además, la fracción de lecturas dentro de picos significativamente llamados (puntuaciones FRiP) fue consistentemente mayor en las muestras marcadas con GFP que en sus muestras de IgG de control (ver Figura suplementaria 2). En resumen, estos resultados muestran que el protocolo CUT&RUN descrito aquí es un método robusto optimizado para investigar las interacciones de unión TF-ADN de C. albicans a partir de muestras de baja abundancia.

Figure 1
Figura 1: Etiquetado de epítopos de TF de C. albicans . (A) Identificar un gen TF de interés (NDT80 en este caso) y seleccionar un gRNA para apuntar al corte de Cas9 (representado por la forma naranja) en el extremo 3' del ORF. (B) La eGFP optimizada para clado Candida con homología de >50 pb aguas arriba y aguas abajo del sitio de corte proporcionará el dDNA para reparar el DSB. (C) Utilice la PCR de colonias para examinar colonias individuales para confirmar la integración prevista. Los cebadores se indican con flechas rojas, y los amplicones se denotan con cuadros discontinuos. Esta figura fue creada usando BioRender.com. Abreviaturas: TF = factor de transcripción; ARNg = ARN guía; ORF = marco de lectura abierto; eGFP = proteína fluorescente verde mejorada; DSB = rotura de doble cadena; US = aguas arriba; DS = aguas abajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Descripción general esquemática del protocolo experimental CUT&RUN. Las células de C. albicans recolectadas de condiciones de cultivo de biopelícula o planctónica se permeabilizan para aislar núcleos intactos. Las cuentas de ConA se activan, y los núcleos intactos se unen a las cuentas de ConA activadas. El anticuerpo de interés se añade a los núcleos unidos a perlas y se incuba a 4 °C. A continuación, se agrega pAG-MNasa y se permite que se una al anticuerpo objetivo. Después de la adición de CaCl2, se activa la pAG-MNasa y la digestión de cromatina dirigida procede hasta la adición del reactivo quelante para inactivar la pAG-MNasa. Se permite que el complejo de anticuerpos unidos a la pAG-MNasa se difunda fuera de los núcleos permeabilizados, y el ADN resultante se extrae y limpia. Las bibliotecas de secuenciación se preparan a partir de los fragmentos de ADN enriquecidos con CUT&RUN, y las bibliotecas resultantes se ejecutan en un gel PAGE al 10% para separar y eliminar los dímeros adaptadores contaminantes antes de la secuenciación. Esta figura fue creada usando BioRender.com. Abreviaturas: CUT&RUN = escisión bajo objetivos y liberación usando nucleasa; ConA = concanavalina A; PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Descripción general esquemática de la canalización de análisis de datos cut&RUN. El flujo de trabajo comienza realizando comprobaciones de calidad en los archivos FASTQ sin procesar utilizando FastQC, seguido de recortes para eliminar los adaptadores de secuenciación. Las lecturas recortadas se alinean con el genoma de referencia, y las lecturas alineadas se filtran en función de su tamaño para enriquecer las señales de unión del tamaño de TF (20 pb ≤ lectura alineada ≤ 120 pb). Las lecturas seleccionadas por el tamaño se calibran contra las lecturas de Escherichia coli con picos, y las lecturas calibradas se utilizan para llamar a los picos utilizando MACS2. El símbolo <> es una representación visual para indicar que los recuentos de lectura de C. albicans se calibraron utilizando recuentos de lectura de E. coli para cada muestra. Abreviaturas: CUT&RUN = escisión bajo objetivos y liberación usando nucleasa; TF = factor de transcripción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Pasos de control de calidad críticos para el éxito de los experimentos CUT&RUN. (A) Las células se tiñen con manchas fluorescentes de pared celular (azul) y ácido nucleico (verde) antes y después del aislamiento de núcleos y se visualizan utilizando un microscopio de fluorescencia. (B) Las bibliotecas cut&RUN TF se analizan utilizando un instrumento de electroforesis capilar. Las bibliotecas CUT&RUN TF exitosas (indicadas por la marca de verificación verde) se enriquecen para fragmentos cortos menores de 200 pb. Las bibliotecas CUT&RUN TF subóptimas (indicadas por la "X" roja) muestran enriquecimiento para fragmentos de ADN grandes. (C) 48 bibliotecas CUT&RUN se agrupan y analizan utilizando un instrumento de electroforesis capilar. Las bibliotecas agrupadas de alta calidad (indicadas por la marca de verificación verde) están libres de dímeros adaptadores (carril 1), mientras que las bibliotecas agrupadas de baja calidad (indicadas por la "X" roja) retienen pequeñas cantidades de dímeros adaptadores (carril 2). (D) Pistas IGV representativas de conjuntos de datos CUT&RUN (incluido el control Ndt80 IgG, pista inferior) que muestran un enriquecimiento significativo para la unión Ndt80 (pista superior) en la región intergénica aguas arriba del ORF EFG1 (Orf19.610). Las barras negras representan picos de unión Ndt80 significativamente enriquecidos identificados por experimentos de chip ChIP publicados anteriormente4. Las barras azules representan picos de unión Ndt80 significativamente enriquecidos identificados en los experimentos CUT&RUN presentados aquí. Barras de escala = 50 μm (A). Abreviaturas: CUT&RUN = escisión bajo objetivos y liberación usando nucleasa; TF = factor de transcripción; GFP = proteína fluorescente verde; ORF = marco de lectura abierto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Evaluación de picos enriquecidos con Ndt80 y Efg1 identificados utilizando el protocolo CUT&RUN presentado y la tubería de análisis de datos en biopelículas de Candida albicans . Los diagramas de Venn en la fila superior ilustran el grado de superposición entre los sitios de unión Ndt80 y Efg1 identificados a través de CUT&RUN con datos de chip ChIP publicados previamente4. Las señales CUT&RUN para todos los eventos de enlace para Ndt80 y Efg1 se muestran en la fila inferior como mapas de calor de color (rojo = señal de pico alto; azul = señal de pico bajo / sin pico; barra de color indica señal IgG restada de señal GFP); Las regiones de 1.000 pb aguas arriba (-1,0 kb) y aguas abajo (+1,0 kb) se muestran en los mapas de calor. La intensidad de la señal (es decir, el enriquecimiento) como un gráfico de perfil se muestra sobre los mapas de calor. Se evaluaron tres réplicas biológicas para Ndt80 y Efg1 para visualizar el enriquecimiento de CUT&RUN. Abreviaturas: ChIP = inmunoprecipitación de cromatina; CUT&RUN = escisión bajo objetivos y liberación usando nucleasa; GFP = proteína fluorescente verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Mezcla de reacción de PCR y condiciones de ciclo de PCR para amplificar fragmentos A universales y B únicos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Mezcla de reacción de PCR y condiciones de ciclo de PCR para coser fragmentos A y B para crear el fragmento C de longitud completa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Condiciones de ciclo de PCR a PCR amplifican el fragmento C de longitud completa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Mezcla de reacción de PCR y condiciones de ciclo de PCR para amplificar la etiqueta GFP de ADN del donante. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 5: Mezcla de reacción de digestión de plásmidos y condiciones de reacción para las reacciones de digestión de plásmidos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 6: Mezcla de reacción de PCR y condiciones de ciclo de PCR para PCR de colonias. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 7: Condiciones de ciclo de PCR para la etapa final de reparación de la biblioteca en preparación para la secuenciación. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 8: Recomendaciones de dilución del adaptador para el ADN de entrada para preparar bibliotecas de secuenciación. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 9: Condiciones de ciclo de PCR a PCR amplifican el ADN ligado por adaptador. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura complementaria 1: Enriquecimiento del motivo de la secuencia de unión al ADN Ndt80. Puntuaciones acumulativas de enriquecimiento de motivos Ndt80 para loci enlazados a Ndt80 identificados en datos de biofilm ChIP-chip (línea punteada azul oscuro) o datos CUT&RUN (línea punteada azul claro) comparados con loci intergénicos aleatorios (línea punteada roja). El eje Y de la izquierda indica el porcentaje de loci total para cada conjunto de datos que contiene una puntuación de motivo acumulativa correspondiente en el eje X. Las líneas discontinuas indican la importancia del enriquecimiento de la puntuación del motivo (-log10 P-value, eje Y a la derecha) en cada punto del eje X, en relación con los loci de control intergénico aleatorio. Las puntuaciones de motivos acumulativos y los valores P se determinaron utilizando MochiView23 (ver Tabla de Materiales). Todos los loci enlazados a Ndt80 se muestrearon como ventanas de 500 pb centradas debajo de cada pico de unión a Ndt80 dentro de los conjuntos de datos ChIP-chip y CUT&RUN y se compararon con loci intergénicos de 500 pb seleccionados al azar para controlar las diferencias de longitud. Abreviaturas: ChIP = inmunoprecipitación de cromatina; ChIP-chip = inmunoprecipitación de cromatina seguida de microarray; CUT&RUN = escisión bajo objetivos y liberación usando nucleasa. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Fracción de lecturas dentro de una puntuación máxima por muestra. Gráfico de barras que representa la puntuación FRiP para cada réplica. Las puntuaciones FRiP se calculan como el número de lecturas mapeadas dentro de un pico dividido por el número total de lecturas mapeadas en una muestra CUT&RUN. Los diferentes colores de barra representan muestras de réplicas biológicas individuales, como se indica a lo largo del eje X. Como se esperaba, las puntuaciones FRiP de las muestras positivas de GFP son consistentemente más altas que las de las muestras de IgG negativas. Todas las muestras muestran umbrales FRiP aceptables (>1%), según las recomendaciones establecidas por Landt et al.20. Abreviaturas: FRiP = fracción de lecturas dentro de un pico; CUT&RUN = escisión bajo objetivos y liberación usando nucleasa. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: Recetas para todos los búferes y soluciones utilizados. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo Complementario 2: Herramientas bioinformáticas necesarias para la canalización de análisis de datos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Regiones bloqueadas recomendadas en el genoma de C. albicans . Esta lista de loci listados en bloque contiene principalmente elementos y regiones de secuencia altamente repetitivos, como repeticiones telomóricas y centrómeros que históricamente han producido resultados falsos positivos en experimentos anteriores de unión a todo el genoma. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este protocolo presenta una tubería experimental y computacional integral para la localización de todo el genoma de TF reguladores en C. albicans. Está diseñado para ser altamente accesible para cualquier persona con capacitación estándar en microbiología y biología molecular. Al aprovechar los requisitos de alto rango dinámico y bajo ingreso de muestra del ensayo CUT&RUN e incluir optimizaciones para la localización de las interacciones de unión TF-DNA en cultivos de biopelícula y planctónica de C. albicans, este protocolo presenta una alternativa poderosa y de bajo costo a los enfoques tradicionales de ChIP-seq. En comparación con ChIP-seq, CUT&RUN produce una sensibilidad significativamente mayor, con una mayor proporción de lecturas de secuenciación asignadas a picos enlazados, es más susceptible a un alto rendimiento, requiere números de celdas de entrada sustancialmente más bajos, no requiere el uso de agentes de reticulación tóxicos y requiere diez veces menos lecturas de secuenciación por muestra para producir resultados de alta calidad 13,14,17, 23,24. Para reducir aún más el costo por muestra de este protocolo, se incluyen recetas de tampón y medios junto con una lista detallada de reactivos para facilitar la preparación interna de todos los tampones y medios necesarios, así como el abastecimiento masivo de reactivos esenciales. Como la formación de biopelículas de C. albicans, la conmutación fenotípica y el comensalismo están regulados por complejas redes transcripcionales entrelazadas26, este protocolo CUT&RUN robusto, fácil y rentable proporciona una nueva y poderosa herramienta para comprender estos y muchos otros procesos celulares en este importante patógeno fúngico humano.

Los TF no son tan abundantes como las histonas u otras proteínas asociadas a la cromatina, lo que crea un desafío único para investigar las interacciones de unión TF-ADN a través de CUT&RUN. Para abordar este desafío, se realizaron ajustes y optimizaciones críticas al protocolo experimental estándar CUT&RUN13. Como la mayoría de los experimentos cut&RUN exitosos dirigidos a TF producen una pequeña cantidad de ADN que es demasiado diluido para cuantificar y a menudo se enriquece para fragmentos menores de 150 pb13,23, las condiciones de reacción de preparación de la biblioteca también se optimizaron para favorecer a estos fragmentos más pequeños27. Incluso con este paso de optimización, las bibliotecas amplificadas por PCR resultantes contienen una proporción significativa de dímeros adaptadores, que no se eliminan por completo utilizando métodos de selección de tamaño de ADN basados en perlas magnéticas. Para solucionar este problema, se incluyó un paso de selección de tamaño de gel PAGE para generar bibliotecas finales listas para la secuenciación que carecen en gran medida de dímeros de adaptador. Este es un paso crítico del protocolo, ya que la eliminación de los dímeros adaptadores mientras se conservan los fragmentos CUT&RUN derivados de TF más pequeños es esencial para obtener resultados de alta calidad.

Además, la canalización computacional detallada filtra los datos de secuenciación para centrarse en las lecturas más pequeñas derivadas de las interacciones de unión TF-DNA en el ensayo CUT&RUN. Debido a estos ajustes específicos de TF, este protocolo no se recomienda para perfilar grandes complejos asociados a la cromatina, como los nucleosomas. Si bien es teóricamente posible adaptar el protocolo para este propósito siguiendo el protocolo de preparación de la biblioteca estándar incluido con el kit de preparación de la biblioteca disponible comercialmente, el usuario tendría que ajustar la selección del tamaño de la secuencia posterior incluida en la canalización computacional. Específicamente, en la sección de filtrado de tamaño en el archivo de código cut_n_run_pipeline.sh, los usuarios tendrían que reemplazar el valor actual de "14400" (120 bp * 120 bp) con el cuadrado de la longitud de fragmento deseada para permitir que la canalización de análisis analice los resultados de secuenciación generados para otros tipos de interacciones de unión cromatina-ADN.

Otro paso clave en un experimento CUT&RUN exitoso incluye la elección de parámetros óptimos de análisis de datos posteriores a la secuenciación. Si bien la mayor parte de la canalización computacional está diseñada para ser estandarizada y aplicable al estudio de cualquier TF regulatorio de interés en C. albicans, hay dos consideraciones importantes que el usuario debe evaluar mientras ejecuta la tubería. La primera consideración es si se deben incluir o eliminar lecturas duplicadas de los datos de secuenciación antes de la identificación de los sitios de destino enlazados. Como los TF de baja abundancia generalmente producirán datos de secuenciación que contienen un porcentaje significativo de lecturas que se derivan de la duplicación de PCR durante el paso de amplificación de la biblioteca, la eliminación de duplicados de PCR puede tener un impacto significativamente negativo en los resultados. Sin embargo, con TF muy abundantes o proteínas asociadas a la cromatina, los duplicados de PCR generalmente representan una porción más pequeña del número total de lecturas y a menudo se eliminan para suprimir el ruido de fondo en los datos. En última instancia, esta decisión de mantener o eliminar duplicados de PCR depende del TF de interés y de la profundidad de los datos de secuenciación obtenidos. Por lo tanto, la canalización genera automáticamente archivos de salida independientes para los datos derivados con o sin lecturas duplicadas de PCR, por lo que el usuario puede decidir qué archivos de salida producen los mejores resultados para cada experimento.

La segunda consideración es si identificar y eliminar los loci problemáticos que producen un enriquecimiento significativo, pero altamente variable, tanto en muestras experimentales (anticuerpos contra la proteína de interés) como de control negativo (IgG). El algoritmo de llamada de pico utiliza MACS2 para identificar loci significativamente enriquecidos tanto en las muestras experimentales como en las de control y excluye los que aparecen en ambas. Si bien este enfoque generalmente elimina la mayoría de los loci problemáticos, algunos aparecen ocasionalmente como picos significativos en ciertos experimentos, a pesar de que la experiencia previa indica que es poco probable que sean verdaderos sitios positivos de enriquecimiento de TF. Por lo tanto, se proporciona un paso de filtrado opcional para eliminar estos loci problemáticos, conocidos como loci "bloqueados". La lista de loci listados en bloque contiene principalmente elementos y regiones de secuencia altamente repetitivos, como repeticiones teloméricas y centrómeros que históricamente han arrojado resultados falsos positivos en ensayos previos de unión a todo el genoma. Esta es una lista muy conservadora de loci asignados como problemáticos con alta confianza. Sin embargo, cada usuario debe evaluar si este filtro es apropiado para sus experimentos caso por caso. Una alternativa potencial al control negativo de IgG sería realizar CUT&RUN contra una proteína nuclear-localizada que no se une al ADN. Se ha demostrado que este enfoque es un control ideal para los experimentos ChIP28, y vale la pena considerar un enfoque similar para CUT&RUN.

CUT&RUN se ha convertido en una opción popular para investigar las interacciones proteína-ADN en eucariotas superiores y la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae. Aquí, se ha adaptado con éxito para investigar las interacciones de unión TF-ADN de todo el genoma en el patógeno fúngico clínicamente relevante C. albicans. Este protocolo proporciona métodos detallados para todos los procedimientos experimentales y computacionales necesarios, desde la ingeniería de cepas que expresan TF marcados con epítopos, hasta el análisis computacional de los datos de secuenciación CUT&RUN resultantes. En general, este protocolo y la tubería de análisis de datos que lo acompaña producen perfiles robustos de unión a TF-DNA, incluso cuando se utilizan poblaciones multimórficas complejas de células aisladas de muestras de biopelícula de baja abundancia y proporciona una calidad de datos superior a un costo general más bajo que las metodologías ChIP-seq.

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Disclosures

Clarissa J. Nobile es cofundadora de BioSynesis, Inc., una compañía que desarrolla diagnósticos y terapias para infecciones por biopelículas.

Acknowledgments

Agradecemos a todos los miembros pasados y presentes de los laboratorios Nobile y Hernday por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) número de premio R35GM124594 y por la familia Kamangar en forma de una silla dotada a C.J.N. Este trabajo también fue apoyado por el premio número R15AI137975 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) de los NIH a A.D.H.C.L.E. fue apoyado por el número de beca F31DE028488 del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial de los NIH (NIDCR). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa las opiniones de los financiadores. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio; en la recopilación, análisis o interpretación de datos; en la redacción del manuscrito; o en la decisión de publicar los resultados.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filter Millipore Sigma SLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubes VWR 490003-190
1 M CaCl2 Fisher Scientific 50-152-341
1 M PIPES Fisher Scientific AAJ61224AK
12-well untreated cell culture plates Corning 351143
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich 60-24-2
2% Digitonin Fisher Scientific CHR103MI
50 mL conical tubes VWR 89039-658
5x phusion HF buffer Fisher Scientific F530S Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
Agar Criterion C5001
Agencourt AMPure XP magnetic beads Beckman Coulter A63880
Agilent Bioanalyzer Agilent G2939BA Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific VWR 89133-910
Bacto peptone BD Biosciences 211677
Benchling primer design tool Benchling https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
Betaine Fisher Scientific AAJ77507AB
Calcofluor white stain Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
Candida Genome Database http://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads Polysciences  86057-3
Conda software https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl tool http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit Epicypher 14-1048 Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) New England Biolabs N0447S
Dextrose (D-glucose) Fisher Scientific D163
Difco D-mannitol  BD Biosciences 217020
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14-955-127
Disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x) Fisher Scientific R0611
DreamTaq green DNA polymerase Fisher Scientific EP0713 Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase buffer Fisher Scientific EP0713 Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNA Epicypher 18-1401
ELMI Microplate incubator ELMI TRMS-04 Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction Buffer Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proof VWR 89125-170
FastDigest MssI Fisher Scientific FD1344 Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI Buffer Fisher Scientific FD1344 Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400 Fisher BioReagents BP525-25
Fluorescence microscope User-dependent
Gel electrophoresis apparatus User-dependent
GeneRuler low range DNA ladder Fisher Scientific FERSM1192
GitBash workflow https://gitforwindows.org/
GitHub source code https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5 Boston BioProducts BBH-75-K
High-speed centrifuge User-dependent
Isopropanol Sigma-Aldrich PX1830-4
Lens paper VWR 52846-001
Ligation Enhancer Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrate MP Biomedicals 215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody Takara 632592 User-dependent
MACS2 https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes Epicypher 10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes Fisher Scientific MR02
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometer BioTek EPOCH2TC Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiView http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPS Sigma-Aldrich M3183
NaCl VWR 470302-522
NaOH Fisher Scientific S318-500
NCBI GEO https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) New England Biolabs E7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit New England Biolabs E7645S Referred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT) Goldbio N-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 well Fisher Scientific EC62755BOX
Nutating mixer VWR 82007-202
Nutrient broth Criterion C6471
pADH110 Addgene 90982 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119 Addgene 90985 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137 Addgene 90986 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139 Addgene 90987 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140 Addgene 90988 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNase Epicypher 15-1016 or 15-1116 50 rxn or 250 rxn
pCE1 Addgene 174434 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lid Fisher Scientific FB0875712
Phusion high fidelity DNA polymerase Fisher Scientific F530S Referred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350 VWR 10791-816
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kit Invitrogen Q33230
Qubit fluorometer Life Technologies Q33216 Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibody Epicypher 13-0042
RNase A Sigma-Aldrich 10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets Sigma-Aldrich 5056489001
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
Shaking incubator Eppendorf M12820004 User-dependent
Sorbitol Sigma-Aldrich S1876-500G
Spin-X centrifuge tube filters Fisher Scientific 07-200-385
Sterile inoculating loops VWR 30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stain Fisher Scientific S11494
SYTO 13 nucleic acid stain Fisher Scientific S7575 Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
Thermocycler User-dependent
ThermoMixer C Eppendorf 5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethane Sigma-Aldrich 252859-100G
Ultra II Ligation Master Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solution Invitrogen 15632011
USER Enzyme Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixer VWR 10153-834
wget tool http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
Yeast extract Criterion C7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) Fisher Scientific NC0439194

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References

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).
  3. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).
  4. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
  5. Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches. Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).
  6. Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch. Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).
  7. Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species. eLife. 10, 64682 (2021).
  8. Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).
  9. Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. Genetics and molecular biology in Candida albicans. Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).
  10. Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
  11. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
  12. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  13. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
  14. Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).
  15. Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans. American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).
  16. Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response. Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).
  17. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
  18. Skrzypek, M. S., et al. The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).
  19. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  20. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  21. Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors. BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).
  22. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  23. Homann, O. R., Johnson, A. D. MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis. BMC Biology. 8, 49 (2010).
  24. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  25. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
  26. Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).
  27. Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -C. CUT&RUNTools: a flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis. Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).
  28. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).

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Biología Número 182 Candida albicans CUT&RUN factores de transcripción métodos de unión a todo el genoma regulación transcripcional
Perfil de todo el genoma de las interacciones de unión al factor de transcripción-ADN en <em>Candida albicans</em>: un método cut&amp;RUN completo y un flujo de trabajo de análisis de datos
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Qasim, M. N., Valle Arevalo, A.,… More

Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Paropkari, A. D., Ennis, C. L., Sindi, S. S., Nobile, C. J., Hernday, A. D. Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow. J. Vis. Exp. (182), e63655, doi:10.3791/63655 (2022).

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