Candida albicans में प्रतिलेखन कारक-डीएनए बाइंडिंग इंटरैक्शन की जीनोम-वाइड प्रोफाइलिंग: एक व्यापक CUT&RUN विधि और डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो

Summary

यह प्रोटोकॉल लक्ष्य के तहत दरार के लिए एक प्रयोगात्मक विधि और डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो का वर्णन करता है और मानव कवक रोगज़नक़ कैंडिडा अल्बिकन्स में न्यूक्लिएज (CUT &RUN) का उपयोग करके जारी करता है।

Abstract

नियामक प्रतिलेखन कारक कई महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं, जिनमें सेलुलर भेदभाव, पर्यावरणीय गड़बड़ी और तनावों की प्रतिक्रियाएं, और मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन शामिल हैं। डीएनए के लिए नियामक प्रतिलेखन कारकों के जीनोम-वाइड बाइंडिंग का निर्धारण इन अक्सर जटिल जैविक प्रक्रियाओं में प्रतिलेखन कारकों के कार्य को समझने के लिए आवश्यक है। लक्ष्य के तहत दरार और न्यूक्लिएज (CUT&RUN) का उपयोग करके रिलीज विवो प्रोटीन-डीएनए बाइंडिंग इंटरैक्शन के जीनोम-वाइड मैपिंग के लिए एक आधुनिक विधि है जो पारंपरिक और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले क्रोमैटिन इम्यूनोप्रिसिपिटेशन के लिए एक आकर्षक विकल्प है, जिसके बाद अनुक्रमण (CHIP-seq) विधि है। CUT&RUN एक उच्च-थ्रूपुट प्रयोगात्मक सेटअप के लिए उपयुक्त है और इसमें CHIP-seq की तुलना में कम प्रति-नमूना अनुक्रमण लागत के साथ काफी अधिक गतिशील सीमा है। यहां, मानव कवक रोगज़नक़ कैंडिडा अल्बिकन्स में प्रतिलेखन कारक-डीएनए बाध्यकारी इंटरैक्शन के जीनोम-वाइड विश्लेषण के लिए एक व्यापक CUT &RUN प्रोटोकॉल और साथ डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो का वर्णन किया गया है। इस विस्तृत प्रोटोकॉल में सभी आवश्यक प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं शामिल हैं, प्रतिलेखन कारक-कोडिंग जीन के एपिटोप टैगिंग से लेकर अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय की तैयारी तक; इसके अतिरिक्त, इसमें CUT&RUN डेटा विश्लेषण के लिए एक अनुकूलित कम्प्यूटेशनल वर्कफ़्लो शामिल है.

Introduction

Candida albicans एक चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक, बहुरूपी मानव कवक रोगज़नक़ है जो विकास के विभिन्न तरीकों की एक किस्म में मौजूद है, जैसे कि विकास के प्लवक (मुक्त-फ्लोटिंग) मोड और एक बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स द्वारा संरक्षित कसकर पालन की गई कोशिकाओं के समुदायों के रूप में, जिसे विकास के बायोफिल्म मोड के रूप में जाना जाता^{है 1,2,3}। अन्य विकासात्मक और सेलुलर प्रक्रियाओं के समान, बायोफिल्म विकास एक महत्वपूर्ण सी एल्बिकन्स वायरस विशेषता है जिसे नियामक प्रतिलेखन कारकों (टीएफ) द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर नियंत्रित करने के लिए जाना जाता है जो डीएनए को अनुक्रम-विशिष्ट तरीके से^{बांधते हैं}। हाल ही में, क्रोमैटिन नियामकों और हिस्टोन संशोधक भी डीएनए पहुंच की मध्यस्थता करके सी अल्बिकन्स बायोफिल्म गठन⁵ और मॉर्फोजेनेसिस⁶ के महत्वपूर्ण नियामकों के रूप में उभरे हैं। इस महत्वपूर्ण कवक रोगज़नक़ के जटिल जीव विज्ञान को समझने के लिए, अलग-अलग विकासात्मक और सेलुलर प्रक्रियाओं के दौरान विशिष्ट टीएफ के जीनोम-वाइड स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए प्रभावी तरीके मूल्यवान हैं।

क्रोमैटिन immunoprecipitation अनुक्रमण (CHIP-seq) के बाद सी एल्बिकन्स ^5,6 में प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है और काफी हद तक माइक्रोएरे (CHIP-chip) ⁹ विधि के बाद अधिक शास्त्रीय क्रोमैटिन immunoprecipitation को बदल दिया है। हालांकि, CHIP-seq और CHIP-chip विधियों दोनों को बड़ी संख्या में इनपुट कोशिकाओं¹⁰ की आवश्यकता होती है, जो विशिष्ट नमूनों और विकास के तरीकों के संदर्भ में TFs की जांच करते समय एक जटिल कारक हो सकता है, जैसे कि रोगियों या संक्रमण के पशु मॉडल से एकत्र किए गए बायोफिल्म्स। इसके अलावा, क्रोमैटिन immunoprecipitation (CHIP) परख अक्सर जीनोम भर में पृष्ठभूमि संकेत की एक महत्वपूर्ण राशि उपज, ब्याज के लक्ष्य के लिए संवर्धन के एक उच्च स्तर की आवश्यकता के लिए पर्याप्त रूप से शोर से संकेत अलग करने के लिए. जबकि CHIP-चिप परख काफी हद तक आज पुरानी है, CHIP-seq के लिए आवश्यक अनुक्रमण गहराई इस परख कई शोधकर्ताओं के लिए निषेधात्मक रूप से महंगा बनाते हैं, विशेष रूप से कई TFs और / या क्रोमैटिन से जुड़े प्रोटीन का अध्ययन करने वाले।

लक्ष्य के तहत दरार और न्यूक्लिएज (CUT&RUN) का उपयोग करके रिलीज CHIP-seq के लिए एक आकर्षक विकल्प है। इसे 2017 में हेनिकॉफ लैब द्वारा CHIP-seq और क्रोमैटिन अंतर्जात दरार की सीमाओं को दरकिनार करने के लिए विकसित किया गया था, जिसके बाद ChEC-seq^11,12 अनुक्रमण किया गया था, जीनोम-वाइड स्तर पर प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की पहचान करने का एक और तरीका, जबकि टीएफ और क्रोमैटिन से जुड़े प्रोटीन¹³ के उच्च-रिज़ॉल्यूशन, जीनोम-वाइड मैपिंग प्रदान करते हुए . CUT&RUN टेदर किए गए माइक्रोकोकल न्यूक्लिएज का उपयोग करके परमेबिलाइज्ड नाभिक के भीतर क्रोमेटिन के लक्षित पाचन पर निर्भर करता है, जिसके बाद पचे हुए डीएनए टुकड़े ^9,10 का अनुक्रमण होता है। जैसा कि डीएनए टुकड़े विशेष रूप से लोकी पर उत्पन्न होते हैं जो ब्याज के प्रोटीन से बंधे होते हैं, बजाय इसके कि CHIP assays के रूप में यादृच्छिक विखंडन के माध्यम से पूरे जीनोम में उत्पन्न होने के बजाय, CUT & RUN दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप पृष्ठभूमि संकेतों में बहुत कम हो जाता है और इस प्रकार, CHIP-seq ^11,13 की तुलना में अनुक्रमण गहराई के^{1/10 वें भाग} की आवश्यकता होती ^{है, १४} । ये सुधार अंततः अनुक्रमण लागत में महत्वपूर्ण कटौती और प्रत्येक नमूने के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में आवश्यक इनपुट कोशिकाओं की कुल संख्या में कटौती का कारण बनते हैं।

यहां, एक मजबूत कट एंड रन प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जिसे बायोफिल्म्स और प्लवक संस्कृतियों से अलग सी अल्बिकन्स कोशिकाओं में टीएफ के जीनोम-वाइड स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए अनुकूलित और अनुकूलित किया गया है। एक संपूर्ण डेटा विश्लेषण पाइपलाइन भी प्रस्तुत की जाती है, जो परिणामी अनुक्रम डेटा के प्रसंस्करण और विश्लेषण को सक्षम बनाती है और उपयोगकर्ताओं को कोडिंग या जैव सूचना विज्ञान में न्यूनतम विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल टीएफ-कोडिंग जीन की एपिटोप टैगिंग, बायोफिल्म और प्लवक कोशिकाओं की कटाई, बरकरार परमेबिलाइज्ड नाभिक के अलगाव, विशिष्ट प्रोटीन या एपिटोप-टैग किए गए प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन, प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए चिमेरिक ए / जी-माइक्रोकोकल न्यूक्लिएज (पीएजी-एमएनेज) संलयन प्रोटीन के टेदरिंग, क्रोमैटिन पाचन के बाद जीनोमिक डीएनए वसूली, और अनुक्रमण के लिए जीनोमिक डीएनए पुस्तकालयों की तैयारी का वर्णन करता है।

प्रयोगात्मक CUT &RUN प्रोटोकॉल का पालन एक उद्देश्य-निर्मित डेटा विश्लेषण पाइपलाइन द्वारा किया जाता है, जो FASTQ प्रारूप में कच्चे डीएनए अनुक्रमण पढ़ता है और ब्याज के टीएफ (प्राथमिक एंटीबॉडी द्वारा लक्षित) द्वारा बाध्य काफी समृद्ध लोकी की पूरी सूची प्रदान करने के लिए सभी आवश्यक प्रसंस्करण चरणों को लागू करता है। ध्यान दें कि वर्णित लाइब्रेरी तैयारी प्रोटोकॉल के कई चरणों को विशेष रूप से अनुकूलित किया गया है और टीएफ के कट एंड रन विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया है (जैसा कि न्यूक्लियोसोम के विपरीत)। जबकि इस पांडुलिपि में प्रस्तुत डेटा एक वाणिज्यिक CUT & RUN किट के TF-विशिष्ट अनुकूलन का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, इन प्रोटोकॉल को व्यक्तिगत रूप से सोर्स किए गए घटकों (यानी, pAG-MNase एंजाइम और चुंबकीय डीएनए शुद्धिकरण मोती) और इन-हाउस-तैयार बफर का उपयोग करके भी मान्य किया गया है, जो प्रयोगात्मक लागत को काफी कम कर सकते हैं। व्यापक प्रयोगात्मक और डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल को चरण-दर-चरण प्रारूप में नीचे विस्तार से वर्णित किया गया है। सभी अभिकर्मकों और महत्वपूर्ण उपकरणों, साथ ही बफर और मीडिया व्यंजनों, क्रमशः सामग्री और पूरक फ़ाइल 1 की तालिका में सूचीबद्ध हैं।

Protocol

1. सी albicans उपभेदों के एपिटोप टैगिंग

1. कैंडिडा जीनोम डेटाबेस से प्राइमर डिजाइन टूल तक अपने 1 केबी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम फ्लैंकिंग अनुक्रमों के साथ ब्याज के जीन को अपलोड करें (सामग्री की तालिका देखें)। स्टॉप कोडोन से 50 बीपी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम को हाइलाइट करके एक गाइड आरएनए (जीआरएनए) डिज़ाइन करें, और दाईं ओर जीआरएनए चयन उपकरण पर क्लिक करें। डिज़ाइन और विश्लेषण मार्गदर्शिकाएँ चुनें. Ca22 (Candida albicans SC5314 असेंबली 22 (द्विगुणित)) जीनोम और एक NGG (SpCas9, 3' पक्ष) प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (PAM) गाइड पैरामीटर के लिए उपयोग करें, और समाप्तक्लिक करें। चित्रा 1 एपिटोप टैगिंग के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करता है एक सी एल्बिकन्स जीन को बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eGFP) के साथ ब्याज के जीन टैगिंग.
   1. बाद के पृष्ठ पर, gRNA डिज़ाइन के लिए लक्ष्य क्षेत्र की पुष्टि करें और हरे रंग का बटन दबाएँ. GRNAs को ऑन-टारगेट स्कोर के आधार पर सॉर्ट करें.
      नोट:: प्राइमर डिज़ाइन उपकरण gRNas की विशिष्टता को मापने के लिए ऑन-टारगेट और ऑफ-टारगेट स्कोर की गणना करता है। एक आदर्श गाइड में >60 का ऑन-टारगेट स्कोर, ~ 33 का ऑफ-टारगेट स्कोर होता है, और स्टॉप कोडोन को ओवरलैप करता है। यह उच्च gRNA विशिष्टता सक्षम बनाता है, जबकि gFP एकीकरण के बाद gRNA लक्ष्यीकरण ablating. ~ 50 के ऑफ-टारगेट स्कोर के साथ एक जीआरएनए एलेलिक भिन्नता को इंगित करता है; इस प्रकार, केवल एक एलील को जीआरएनए द्वारा पहचाना जाएगा।
   2. अनुक्रम (5'-CGTAAACTATTTTTTTTTTG-3') और (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') को क्रमशः 5 'और 3' सिरों पर 20 बीपी जीआरएनए लक्ष्य अनुक्रम के जोड़ें, जिससे 60 बीपी प्राइमर / ओलिगोन्यूक्लियोटाइड बनाया जा सके। वैकल्पिक रूप से, गुयेन एट ^अल.15 द्वारा आपूर्ति किए गए जीआरएनए कैलकुलेटर में 20 बीपी अनुक्रम की प्रतिलिपि बनाएँ। 60 बीपी कस्टम gRNA ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का आदेश दें।
   3. 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCCCCCGCGTTTAAACCGCC-3') और 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAAAATAGTTTACGCAAG-3') के साथ "सार्वभौमिक एक टुकड़ा" को बढ़ाएं और चरण 1.1.2 से कस्टम 60 bp gRNA ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड (100 mM) के साथ "अद्वितीय बी टुकड़ा"। और 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGGGTTTAAACACCG-3') pADH110 (प्लास्मिड रिपॉजिटरी ID# 90982) और pADH139 (प्लास्मिड रिपॉजिटरी ID# 90987) का उपयोग करते हुए, क्रमशः, टेम्पलेट डीएनए के रूप में। तालिका 1 में दी गई पीसीआर प्रतिक्रिया और साइकिल चालन की स्थिति का उपयोग करें।
      नोट: pADH139 उपभेदों है कि heterologous Candida maltosa LEU2 मार्कर ले जाने के लिए विशिष्ट है। यदि C. albicans LEU2 जीन की एक ही प्रति के साथ एक तनाव का उपयोग कर रहे हैं, तो pADH119 (प्लास्मिड रिपॉजिटरी ID# 90985) को pADH139 के स्थान पर प्रतिस्थापित करें।
   4. एक 1% agarose जेल पर पीसीआर के 5 μL की जांच करके सफल प्रवर्धन की पुष्टि करें। ~ 1 केबी ए और बी टुकड़ा amplicons के लिए देखो.
   5. ए और बी टुकड़ों में से प्रत्येक में 1 μL मिलाएं और उन्हें एक पूर्ण लंबाई सी टुकड़ा बनाने के लिए तालिका 2 में प्रदान की गई पीसीआर प्रतिक्रिया और साइकिल चालन स्थितियों का उपयोग करके एक साथ सिलाई करें।
   6. प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया में 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') का 0.5 μL और 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCCTCGACAATCGAATCG-3') का 0.5 μL जोड़ें, पिपेटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, और तालिका 3 में सूचीबद्ध साइकिल चालन की शर्तों को पूरा करें।
      नोट: यदि pADH139 के स्थान पर pADH119 का उपयोग कर रहे हैं, तो AHO1453 के स्थान पर AHO1238 (5'-TGTATTTTTTTTTTAAAATTTTAGTGTGACTGTTTC-3') को प्रतिस्थापित करें।
   7. एक 1% agarose जेल पर पीसीआर के 5 μL की जांच करके सी टुकड़ा के उचित सिलाई और प्रवर्धन की पुष्टि करें। एक ~ 2 kb amplicon के लिए देखो. उपयोग के लिए तैयार होने तक सी टुकड़ा को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।
      नोट:: यदि सिलाई और प्रवर्धन एकाधिक, nonspecific बैंड या smearing में परिणाम है, तो A और B टुकड़े की एक PCR क्लीनअप निष्पादित करें और चरण 1.1.5 से दोहराएँ।
2. लिंकर अनुक्रम (RIPLING)^{16 (pCE1} , प्लास्मिड रिपॉजिटरी आईडी # 174434) के साथ पूरे सीटीजी-अनुकूलित मोनोमेरिक ईजीएफपी को तुरंत प्राइमर डिजाइन उपकरण का उपयोग करके ब्याज के जीन के स्टॉप कोडोन के अपस्ट्रीम में जोड़ें, जिससे सी-टर्मिनल ट्रांसलेशनल संलयन बन जाएगा। पीसीई 1 से दाता डीएनए (डीडीएनए) को बढ़ाने के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स डिजाइन करने के लिए इस निर्माण का उपयोग करें।
   1. लिंकर अनुक्रम के लिए 18-22 बीपी होमोलॉजी के साथ एक आगे ओलिगोन्यूक्लियोटाइड डिजाइन करें और खुले रीडिंग फ्रेम (ओआरएफ) के 3 'अंत तक >50 बीपी होमोलॉजी)।
      नोट: 18-22 बीपी होमोलॉजी 55 डिग्री सेल्सियस और 58 डिग्री सेल्सियस के बीच प्रवर्धन के लिए एक एनीलिंग तापमान बनाता है। यदि पूर्ण लंबाई ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर डिमर बनाता है, तो तदनुसार लिंकर अनुक्रम / जीएफपी या जीनोम के लिए होमोलॉजी को समायोजित करें।
   2. जीएफपी के 3 'अंत तक 18-22 बीपी होमोलॉजी के साथ एक रिवर्स ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड बनाएं और ओआरएफ के डाउनस्ट्रीम नॉनकोडिंग अनुक्रम के लिए >50 बीपी होमोलॉजी को टैग किया जाना है।
   3. इन ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को ऑर्डर करें और तालिका 4 में प्रदान की गई टचडाउन पीसीआर साइक्लिंग स्थितियों का उपयोग करके डीडीएनए को बढ़ाएं।
3. फ्लैंकिंग एकीकरण साइटों में विस्तार करके जीएफपी के एकीकरण की पुष्टि करने के लिए कॉलोनी पीसीआर (सीपीसीआर) ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के दो सेट डिजाइन करें। सबसे पहले, प्राइमर डिजाइन टूल का उपयोग करके फॉरवर्ड डीडीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड का चयन करें और दाईं ओर प्राइमर बटन पर क्लिक करें।
   1. प्राइमर बनाएँ | क्लिक करें विज़ार्ड | Tm परम और पुष्टि करें कि एल्गोरिथ्म SantaLucia 1998 के लिए सेट किया गया है। लक्ष्य अनुक्रम के रूप में 1.2.1 में डिज़ाइन किए गए अग्रेषित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के निर्देशांक इनपुट करने के लिए चयन का उपयोग करें क्लिक करें.
   2. इष्टतम प्राइमर तापमान को 55 डिग्री सेल्सियस और अधिकतम एम्प्लिकॉन आकार को 900 बीपी पर सेट करें, और शीर्ष दाईं ओर प्राइमर जनरेट करें बटन पर क्लिक करें।
   3. सबसे कम दंड स्कोर के साथ ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जोड़ी का चयन करें और पुष्टि करें कि प्राइमर 5 'एकीकरण साइट पर बढ़ते हैं। सुनिश्चित करें कि आगे cPCR प्राइमर आगे dDNA प्राइमर अनुक्रम और रिवर्स cPCR प्राइमर पूरी तरह से eGFP टैग या linker अनुक्रम के भीतर के ऊपर की ओर स्थित है।
   4. चरण 1.3-1.3.3 दोहराएँ। रिवर्स dDNA ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ cPCR oligonucleotides का दूसरा सेट बनाने के लिए जो 3 'एकीकरण साइट पर प्रवर्धित होता है। सुनिश्चित करें कि आगे cPCR प्राइमर पूरी तरह से eGFP टैग या linker अनुक्रम और रिवर्स dDNA प्राइमर अनुक्रम के रिवर्स cPCR प्राइमर डाउनस्ट्रीम के भीतर है।
   5. इन ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का आदेश दें।
4. PADH140 के 2,500 ng को डाइजेस्ट करें, जिसमें Cas9 (प्लास्मिड रिपॉजिटरी ID # 90988) शामिल है, जिसमें प्रत्येक जीन के लिए प्रतिबंध एंजाइम GFP-टैग किया गया है। प्रत्येक पाचन की कुल मात्रा को 15 μL पर सेट करें; तदनुसार pADH140 प्लास्मिड एकाग्रता के आधार पर पानी की मात्रा को समायोजित करें। तालिका 5 में निर्दिष्ट पाचन स्थितियों का उपयोग करें। पचे हुए प्लास्मिड को -20 डिग्री सेल्सियस पर तब तक स्टोर करें जब तक कि उपयोग के लिए तैयार न हो जाए।
   नोट: यदि C. albicans LEU2 जीन की एक ही प्रतिलिपि के साथ एक तनाव को परिवर्तित कर रहा है, तो हेटरोलॉगस C. maltosa LEU2 मार्कर के बजाय, pADH140 के स्थान पर pADH137 (प्लास्मिड रिपॉजिटरी ID# 90986) को प्रतिस्थापित करें।
5. प्रत्येक जीन के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल सैल्मन शुक्राणु डीएनए के 12 μL को डीनेचर 12 μL जो 10 मिनट के लिए 99 डिग्री सेल्सियस पर जीएफपी-टैग किया जाएगा और ≤4 डिग्री सेल्सियस तक तेजी से ठंडा होगा। उपयोग के लिए तैयार होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
6. लकीर एक सी albicans LEU2 hemizygous nourseothricin-खमीर पेप्टोन डेक्सट्रोज (YPD) प्लेटों पर संवेदनशील तनाव और दो दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
7. एक एकल कॉलोनी का चयन करें और इसे तरल YPD के 4 mL में स्थानांतरित करें। 250 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
8. एक डिस्पोजेबल क्यूवेट (1 एमएल, 1 सेमी पथ लंबाई) का उपयोग करके एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में रात भर (12-16 एच) संस्कृति के_{600 एनएम (ओडी 600}) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें।
9. YPD में 0.1 के एक OD₆₀₀ के लिए एक Erlenmeyer फ्लास्क में रातोंरात संस्कृति को पतला करें। प्रति प्रतिक्रिया 5 एमएल के लिए खाता है और बाद में ओडी₆₀₀ की जांच के लिए एक अतिरिक्त 5 एमएल शामिल है।
   नोट:: संस्कृति की मात्रा परिवर्तन प्रतिक्रियाओं की संख्या पर निर्भर करता है।
10. 250 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में पतला रातोंरात संस्कृति को इनक्यूबेट करें जब तक कि यह_0.5-0.8 के ओडी 600 तक नहीं पहुंच जाता।
11. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4,000 × जी पर सेंट्रीफ्यूज; निकालें और supernatant को छोड़ दें।
12. फ़िल्टर युक्तियों के साथ कोमल पिपेट मिश्रण के माध्यम से बाँझ पानी के 1 मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
13. 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4,000 × जी पर सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा कोशिकाओं को गोली मार; निकालें और supernatant को छोड़ दें। बाँझ पानी के 1 मिलीलीटर में resuspend और दो धोने की कुल के लिए दोहराने.
14. चरण 1.10 में उपयोग की गई मात्रा के 1/100^{वें भाग} में गोली को फिर से निलंबित करें। उदाहरण के लिए, यदि 15 मिलीलीटर का उपयोग किया गया था, तो बाँझ पानी के 150 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
15. प्रत्येक परिवर्तन प्रतिक्रिया के लिए एक अलग ट्यूब में, सी टुकड़ा के 50 μL, dDNA के 50 μL, प्रतिबंध एंजाइम-पचा हुआ pADH140 के 2,500 ng, और विकृत सामन शुक्राणु डीएनए के 10 μL मिश्रण।
16. चरण 1.14 से सेल घोल के 50 μL जोड़ें और pipetting द्वारा मिश्रण।
17. n + 1 परिवर्तनों के लिए प्लेट मिश्रण (अनुपूरक फ़ाइल 1) का स्टॉक बनाएं।
18. सेल / डीएनए मिश्रण में प्लेट मिश्रण का 1 मिलीलीटर जोड़ें और 5 बार उलटा करके मिश्रण करें।
    नोट: किसी भी शेष तरल को हटाने के लिए उलटा करते समय ट्यूबों के बॉटम्स को टैप करें।
19. मिश्रण को एक इनक्यूबेटर में 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (12-16 घंटे) पर हिलाए बिना रखें।
20. गर्मी एक पानी के स्नान में 44 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं सदमे.
21. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 5,000 × ग्राम पर 1.5 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
22. बाँझ पिपेट युक्तियों का उपयोग करके वैक्यूम आकांक्षा द्वारा प्लेट मिश्रण को हटा दें, सेल गोली को परेशान करने से बचने के लिए सावधान रहें।
23. YPD के 1 मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4,000 × जी पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा गोली, और supernatant को हटा दें और छोड़ दें। एक दूसरे धोने के लिए दोहराएं, YPD के 1 mL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और निलंबन को 10 mL राउंड-बॉटम, डिस्पोजेबल कल्चर ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें YPD (2 mL अंतिम मात्रा) का एक अतिरिक्त 1 mL होता है। 5 ज के लिए 250 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें।
24. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4,000 × जी पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें; निकालें और supernatant को छोड़ दें।
25. 200 μg / mL nourseothricin (NAT200) के साथ पूरक YPD पर बाँझ पानी और प्लेट के 100 μL में सेल गोली resuspend। 2-3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
26. एलीकोट 20 mM NaOH के 100 μL को 96-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के कुओं में, प्रत्येक अच्छी तरह से एक व्यक्तिगत कॉलोनी के अनुरूप है जो NAT200 प्लेटों पर विकसित हुआ था। एक बाँझ टूथपिक या पिपेट टिप का उपयोग करके, व्यक्तिगत रूपांतरित कॉलोनियों को चुनें, उन्हें एक नई NAT200 प्लेट पर पैच करें, और शेष कोशिकाओं को 20 mM NaOH के साथ एक कुएं में घुमाएं। cPCR प्रतिक्रिया के लिए डीएनए टेम्पलेट के रूप में उपयोग किए जाने वाले सेल लिसेट को बनाने के लिए शेष कॉलोनियों के लिए दोहराएं।
27. पीसीआर प्लेट को सील करें और गर्म ढक्कन के साथ थर्मोसाइकलर में 99 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
28. चरण 1.3-1.3.5 में डिज़ाइन किए गए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ दो सीपीसीआर प्रतिक्रियाएं सेट करें। आवश्यकतानुसार प्रतिक्रियाओं की संख्या बढ़ाएं। चरण 1.26 में तैयार सेल लिसेट के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया करें, जो तालिका 6 से साइकिल चालन की स्थिति और पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण के बाद है। एक 1% agarose जेल पर प्रत्येक अच्छी तरह से से 10-20 μL चलाएँ। दो cPCR प्राइमर सेट के प्रवर्धन के साथ उपनिवेशों की तलाश करें जो ठीक से शामिल GFP dDNA को इंगित करते हैं।
29. Restreak कॉलोनियों है कि सिंथेटिक पूर्ण (एससी) मीडिया पर GFP शामिल leucine की कमी. 2-3 दिनों के लिए एक 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें। अलग-अलग कालोनियों को चुनें और YPD और YPD पर पैच 400 μg / mL nourseothricin (NAT400) प्लेटों के साथ पूरक। उन उपनिवेशों की पहचान करें जो 24 घंटे के बाद NAT400 प्लेटों पर बढ़ने में विफल रहते हैं, जो सफलतापूर्वक CRISPR घटकों को खो चुके हैं।
30. पुष्टि करें कि GFP टैग YPD पैच प्लेट से कक्षों का उपयोग कर चरण 1.25-1.28 दोहराकर बनाए रखा गया है। यदि सही बैंड मौजूद हैं, तो YPD के 4 mL में टीका लगाएं और रात भर (12-16 h) बढ़ते हैं, जैसा कि चरण 1.7 में वर्णित है।
31. एक बाँझ क्रायोट्यूब में 1: 1 अनुपात में फ़िल्टर-निष्फल 50% ग्लिसरॉल के साथ नए जीएफपी-टैग किए गए तनाव की रातोंरात संस्कृति को मिलाएं। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और आवश्यकतानुसार वाईपीडी प्लेटों पर restreak करें।
    नोट: फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से टैग किए गए टीएफ के परमाणु स्थानीयकरण की पुष्टि करके और एक उपयुक्त फेनोटाइपिक परख में एक जंगली प्रकार के फेनोटाइप की पुष्टि करके जीएफपी-टैग किए गए उपभेदों को मान्य करने की सिफारिश की जाती है।

2. बायोफिल्म संस्कृतियों के नमूने की तैयारी

1. लकीर सी albicans जीएफपी-टैग की गईं तनाव (ओं) YPD आगर प्लेटों पर और 2-3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। आगर प्लेट से एक एकल पृथक कॉलोनी का उपयोग करते हुए, वाईपीडी तरल माध्यम के 4 एमएल में टीका लगाएं। रात भर हिलाते हुए (12-16 ज) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। रातोंरात संस्कृति (ओं) के_{OD 600} का निर्धारण करें।
   नोट: CUT&RUN प्रयोगों के लिए प्रति नमूना तीन जैविक प्रतिकृतियों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
2. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) में 0.5 के अंतिम ओडी₆₀₀ (2 × 10⁷ कोशिकाओं / एमएल के बराबर) के लिए रातोंरात संस्कृति के साथ एक बाँझ 12-अच्छी तरह से अनुपचारित सेल संस्कृति प्लेट को टीका लगाएं - 1640 माध्यम 2 एमएल की अंतिम मात्रा में। 250 आरपीएम पर मिलाते हुए एक माइक्रोप्लेट इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
   नोट: यह एक मध्यम अकेले संदूषण नियंत्रण के रूप में एक अच्छी तरह से uninoculated के साथ एक 12-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट प्रति तनाव का उपयोग करने की सिफारिश की है। इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक एक 12-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के 1/10^{वें हिस्से} (या 5 मिलियन कोशिकाओं के रूप में कुछ) का उपयोग करके लागू किया गया है। कोशिकाओं की एक उच्च संख्या का उपयोग करने से कुल डीएनए पैदावार बढ़ जाती है, जिसके परिणामस्वरूप आमतौर पर उच्च गुणवत्ता वाले अनुक्रमण पुस्तकालय होते हैं।
3. एक वैक्यूम जाल उपकरण के लिए लचीला प्लास्टिक टयूबिंग के माध्यम से संलग्न बाँझ पिपेट युक्तियों का उपयोग करके आकांक्षा द्वारा unadhered कोशिकाओं को निकालें। बाँझ 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (PBS) के 2 मिलीलीटर के साथ चिपके हुए कोशिकाओं को एक बार धोलें। कुओं के लिए ताजा RPMI-1640 माध्यम के 2 mL जोड़ें और 250 rpm पर मिलाते हुए 37 °C पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
   नोट: विभिन्न उपभेदों और / या स्थितियों के कुओं के बीच पिपेट युक्तियाँ बदलें। एस्पिरेट करते समय टिप के साथ कुएं के निचले हिस्से को खरोंच न करें।
4. 24 घंटे इनक्यूबेशन के अंत में, 11 संक्रमित कुओं में से प्रत्येक से तरल और बायोफिल्म सामग्री को एक एकल, बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा और पूल करें। स्वतंत्र पूल के साथ आवश्यक के रूप में दोहराएं यदि एक से अधिक तनाव या विकास की स्थिति को समवर्ती रूप से संसाधित किया जाता है।
   नोट: सतह का पालन किए गए कक्षों को हटाने के लिए एक पिपेट फ़िल्टर टिप के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे और किनारों को स्क्रैप करें। बायोफिल्म्स को homogenize करने के लिए पिपेट का उपयोग करें।
5. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा गोली के नमूने। जितना संभव हो उतना supernatant के रूप में Decant, गोली के व्यवधान को कम करने के लिए देखभाल ले रही है। तरल नाइट्रोजन में गोली को स्नैप-फ्रीज करें और संग्रह के तुरंत बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या सीधे चरण 4 (नाभिक का अलगाव) पर जारी रखें।

3. प्लवक संस्कृतियों के नमूने की तैयारी

1. लकीर सी albicans जीएफपी-टैग की गईं तनाव (ओं) YPD आगर प्लेटों पर और 2-3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। आगर प्लेट से एक एकल पृथक कॉलोनी का उपयोग करते हुए, वाईपीडी तरल माध्यम के 4 एमएल में टीका लगाएं। रात भर हिलाते हुए (12-16 ज) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। रातोंरात संस्कृति (ओं) के_{OD 600} का निर्धारण करें।
2. RPMI-1640 तरल माध्यम के₅₀ mL में 0.1 के OD 600 के लिए रातोंरात संस्कृतियों को वापस पतला करें और 2-5 घंटे के लिए 225 rpm पर हिलाने के साथ 30 °C पर इनक्यूबेट करें जब तक कि OD₆₀₀ 0.5 और 0.8 के बीच न हो।
   नोट: कोशिकाओं को काटा जाने से पहले कम से कम दो दोहरीकरण के माध्यम से जाना चाहिए। प्लवक संस्कृतियों के लिए उपयोग की जाने वाली शर्तों को आवश्यकतानुसार समायोजित किया जा सकता है।
3. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4,000 × जी पर centrifuging द्वारा नमूनों गोली. जितना संभव हो उतना supernatant के रूप में Decant, गोली के व्यवधान को कम करने के लिए देखभाल ले रही है। तरल नाइट्रोजन में गोली को स्नैप-फ्रीज करें और संग्रह के तुरंत बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या सीधे चरण 4 (नाभिक का अलगाव) पर जारी रखें।

4. नाभिक का अलगाव

नोट: प्रयोग के दिन, ताजा Ficoll बफर तैयार करें, Resuspension बफर के एलीकोट (ओं) के लिए 2-mercaptoethanol और प्रोटीज अवरोधक जोड़ें, और SPC बफर के एलीकोट (ओं) के लिए प्रोटीज अवरोधक जोड़ें (अनुपूरक फ़ाइल 1 देखें)। छर्रों को फिर से निलंबित करने के लिए, कोशिकाओं या नाभिक को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए या तो 200 μL या 1 mL पिपेट युक्तियों का उपयोग करके धीरे-धीरे पिपेट। नाभिक अलगाव शुरू करने से पहले, इसे 30 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करने के लिए हीट ब्लॉक को चालू करें। इस प्रोटोकॉल के शेष के लिए सभी पिपेट युक्तियों और ट्यूबों को प्रमाणित डीएनए / आरएनए और डीएनएस / आरनेस - मुक्त होना चाहिए, और बाद के सभी पिपेटिंग चरणों के लिए फ़िल्टर युक्तियों के उपयोग की सिफारिश की जाती है।

1. कमरे के तापमान Resuspension बफर के 1 mL में गोली (एस) resuspend और एक बाँझ 1.5 mL microfuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण. एक टेबल-टॉप सेंट्रीफ्यूज में 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2,000 × जी पर गोली और supernatant को हटाने के लिए।
   नोट: या तो 200 μL या 1 mL पिपेट टिप का उपयोग करके supernatant निकालें, छर्रों के व्यवधान को कम करने के लिए देखभाल कर रही है।
2. कमरे के तापमान Resuspension बफर के 200 μL में गोली (ओं) resuspend. पुन: निलंबित गोली से, एक 5 μL ऐलीकोट को एक नई पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें और बाद में उपयोग के लिए इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
   नोट: इस ऐलीकोट का उपयोग पृथक नाभिक की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए बाद के गुणवत्ता नियंत्रण चरण के दौरान नियंत्रण के रूप में किया जाएगा।
3. 2 मिनट के लिए 2,000 × जी पर गोली और एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को हटाने और त्याग दें। Resuspension बफ़र के 200 μL का उपयोग कर दो बार धोने के चरण को दोहराएँ।
4. 2,000 पर सेंट्रीफ्यूज 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर × जी और supernatant को हटाने के लिए। Resuspension बफर के 300 μL और लिटिकेस समाधान के 10 μL जोड़ें (50 मिलीग्राम / एमएल, सामग्री की तालिका देखें)। एक गर्मी ब्लॉक में 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
   नोट: वैकल्पिक रूप से, 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी के स्नान का उपयोग गर्मी ब्लॉक के बजाय भी किया जा सकता है। यहां उपयोग की जाने वाली स्फेरोप्लास्टिंग स्थितियों को सी अल्बिकन्स के खमीर और हाइफल कोशिकाओं दोनों के लिए प्रभावी होने के लिए अनुकूलित किया गया है। इस प्रोटोकॉल को सी एल्बिकन्स कोशिकाओं पर लागू करते समय स्फेरोप्लास्टिंग स्थितियों को अनुकूलित करने की सिफारिश की जाती है, जिसमें उत्परिवर्तन होते हैं जो सेल की दीवार अखंडता या अन्य सेलुलर आकारिकी को प्रभावित करते हैं। इस 30 मिनट इनक्यूबेशन चरण के दौरान, उपयोगकर्ता के पास समय बचाने के लिए समय से पहले चरण 5 (Concanavalin A मनका सक्रियण) को पूरा करने का विकल्प है।
   1. महत्वपूर्ण कदम: 30 मिनट इनक्यूबेशन चरण के बाद, एक नई पीसीआर ट्यूब में एक 5 μL ऐलीकोट स्थानांतरित करें। अलग नाभिक के 5 μL और चरण 4.2 से 4 °C पर संग्रहीत अक्षुण्ण कोशिकाओं के 5 μL एलीकोट के लिए, 1 μL calcofluor सफेद (एक फ्लोरोसेंट सेल दीवार डाई) और SYTO 13 (एक न्यूक्लिक एसिड दाग) के 1 μL जोड़ें। 30 मिनट के लिए अंधेरे में 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
   2. नेत्रहीन एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके पृथक नाभिक की अखंडता और शुद्धता का निरीक्षण करें। अलग-अलग नाभिक की तलाश करें जो प्रमुखता से सना हुआ बरकरार नाभिक (488-509 एनएम उत्तेजना फिल्टर का उपयोग करके) दिखाते हैं और यह सुनिश्चित करते हैं कि कैलकोफ्लोर सफेद डाई (390-420 एनएम उत्तेजना फिल्टर का उपयोग करके) द्वारा कोई सेल दीवार धुंधला नहीं है। बरकरार नियंत्रण कोशिकाओं में, calcofluor सफेद डाई (एक 390-420 एनएम उत्तेजना फिल्टर का उपयोग करके) और सना हुआ बरकरार नाभिक (488-509 एनएम उत्तेजना फिल्टर का उपयोग करके) द्वारा प्रमुख सेल दीवार धुंधला के लिए देखो।
5. 2,000 पर सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जी × और supernatant को हटाने के लिए। बर्फ के 500 μL में गोली resuspend Resuspension बफर धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 1 mL फ़िल्टर युक्तियों का उपयोग कर 5 बार. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 × जी पर सेंट्रीफ्यूज, और 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके supernatant को हटा दें। ताजा बर्फ-ठंडा फिकोल बफर के 1 मिलीलीटर के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।
   नोट: इस बिंदु से आगे बर्फ पर नमूने और बफ़र्स रखें।
6. 5,000 पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें × 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जी और supernatant को हटा दें। बर्फ ठंडा एसपीसी बफर के 500 μL में गोली resuspend.
   नोट: इस बिंदु से आगे, नाभिक को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए उन्हें बहुत धीरे से संभालें।
7. 5,000 × जी पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें और गोली को बाधित किए बिना जितना संभव हो उतना supernatant को हटा दें। बर्फ पर छर्रेदार नाभिक युक्त ट्यूबों को रखें और चरण 5 पर आगे बढ़ें। यदि चरण 5 पहले से ही चरण 4.4 में समय से पहले पूरा हो गया था, तो चरण 6 पर आगे बढ़ें या तरल नाइट्रोजन में छर्रों को स्नैप-फ्रीज करें और संग्रह के तुरंत बाद उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें।

5. Concanavalin एक मनका सक्रियण

नोट:: यह एक महत्वपूर्ण कदम है। इस बिंदु से आगे, उपयोगकर्ताओं के पास व्यावसायिक रूप से उपलब्ध CUT &RUN किट या स्रोत कुंजी घटकों का व्यक्तिगत रूप से उपयोग करके प्रोटोकॉल के साथ जारी रखने और घर में बफ़र्स तैयार करने का विकल्प है। यदि वाणिज्यिक किट का उपयोग कर रहे हैं, तो नीचे उपयोग किए गए सभी बफर और अभिकर्मकों को किट में शामिल किया जाता है जब तक कि अन्यथा नोट न किया गया हो। स्वतंत्र रूप से सोर्सिंग अभिकर्मकों के लिए व्यक्तिगत कैटलॉग संख्याएं भी सामग्री की तालिका में प्रदान की गई हैं। उपयोग करने से पहले बर्फ पर सभी बफ़र्स ठंडा करें। एक बार चरण 5 पूरा हो जाने के बाद, तुरंत चरण 6 पर आगे बढ़ने की सिफारिश की जाती है। अलग-थलग नाभिक के कई फ्रीज-पिघलने से बचें क्योंकि यह डीएनए क्षति को बढ़ाने के लिए जाना जाता है और खराब गुणवत्ता वाले परिणामों का कारण बन सकता है।

1. धीरे से एक पिपेट का उपयोग करके concanavalin ए (कोना) मोतियों resuspend. एक एकल 1.5 mL microfuge ट्यूब में संसाधित किया जा करने के लिए प्रति नमूना कोना मनका निलंबन के 22 μL स्थानांतरण. एक चुंबकीय रैक पर ट्यूब रखें जब तक कि मनका घोल स्पष्ट न हो; निकालें और एक पिपेट का उपयोग कर supernatant को छोड़ दें।
   नोट: जब 10 नमूनों की कुल के लिए CUT&RUN प्रदर्शन, उदाहरण के लिए, एक 1.5 mL microfuge ट्यूब के लिए ConA मनका निलंबन के 220 μL स्थानांतरण।
2. चुंबकीय रैक से कोना मोतियों युक्त ट्यूब को निकालें और तुरंत बर्फ-ठंडे मनका सक्रियण बफर के 200 μL जोड़ें और धीरे से एक पिपेट का उपयोग करके मिश्रण करें। चुंबकीय रैक पर ट्यूब रखें जब तक कि मनका घोल स्पष्ट न हो; निकालें और एक पिपेट का उपयोग कर supernatant को छोड़ दें। कुल दो धोने के लिए इस चरण को दोहराएं।
3. बर्फ के 22 μL में मोतियों को फिर से निलंबित कर दिया-ठंडा मनका सक्रियण बफर नाभिक के प्रति नमूना संसाधित किया जा करने के लिए. मोतियों को जरूरत पड़ने तक बर्फ पर रखें।
   नोट: बाद के चरणों का थ्रूपुट उपलब्ध चुंबकीय ट्यूब रैक की संख्या और क्षमता पर निर्भर करता है। दो 16-वेल ट्यूब रैक में 32 नमूनों को संसाधित करना इस प्रोटोकॉल के अधिकांश उपयोगकर्ताओं के लिए एक प्रबंधनीय संख्या है। हालांकि, अधिक अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए उच्च थ्रूपुट संभव है, या यदि रोबोट तरल हैंडलिंग सिस्टम उपलब्ध हैं।

6. सक्रिय मोतियों के लिए बाध्यकारी नाभिक

नोट: उपयोग करने से पहले बर्फ पर सभी बफ़र्स ठंडा करें। प्रोटीज इनहिबिटर के साथ पूरक सभी बफ़र्स को प्रयोग के दिन ताजा तैयार किया जाना चाहिए। बाद के चरणों में 0.2 मिलीलीटर स्ट्रिप ट्यूबों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

1. बर्फ-ठंडे एसपीसी बफर के 100 μL में चरण 4 से छर्रेदार नाभिक को फिर से निलंबित करें और एक नई 8-ट्यूब 0.2 एमएल पट्टी में स्थानांतरित करें। प्रत्येक नमूने के लिए सक्रिय मोतियों के 20 μL जोड़ें और धीरे से मिश्रण करने के लिए पिपेट। आंदोलन के बिना 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
2. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों को तब तक रखें जब तक कि घोल स्पष्ट न हो जाए; निकालें और एक पिपेट का उपयोग कर supernatant को छोड़ दें। चुंबकीय रैक से ट्यूबों को निकालें, और प्रत्येक नमूने के लिए बर्फ-ठंडा वॉश बफर के 200 μL जोड़ें। धीरे से ऊपर और नीचे 5 बार pipetting द्वारा मोतियों को फिर से निलंबित. एक नया 8-ट्यूब 0.2 mL पट्टी में प्रत्येक नमूने से 100 μL ऐलीकोट स्थानांतरण।
   1. महत्वपूर्ण कदम: प्रत्येक कट एंड रन नमूने को दो अलग-अलग एलीकोट में विभाजित करें। नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी (जैसे, आईजीजी नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी) के लिए एलीकोट में से एक का उपयोग करें और ब्याज के प्रोटीन (जैसे, एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी) के खिलाफ लक्ष्य एंटीबॉडी के लिए दूसरा।
      नोट: दोनों नमूनों को कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन के लिए ब्याज के TF के लिए विशिष्ट संवर्धन संकेतों की सही पहचान करने के लिए आवश्यक हैं। एक untagged तनाव के साथ विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग कर एक अतिरिक्त नियंत्रण भी प्रदर्शन किया जा सकता है। इस नियंत्रण ने जीएफपी-टैग किए गए तनाव में आईजीजी एंटीबॉडी के उपयोग के तुलनीय परिणाम दिखाए हैं। इसलिए, सादगी के लिए, सभी प्रयोगों के लिए मानक आईजीजी नियंत्रण का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

7. प्राथमिक एंटीबॉडी बाध्यकारी

नोट: पीएजी-MNase संलयन प्रोटीन खरगोश, बकरी, गधा, गिनी पिग, और माउस IgG एंटीबॉडी¹⁷ के लिए अच्छी तरह से बांधता है। आम तौर पर, अधिकांश वाणिज्यिक CHIP-seq-प्रमाणित वाणिज्यिक एंटीबॉडी CUT&RUN प्रक्रियाओं के साथ संगत होते हैं। उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी की मात्रा एंटीबॉडी की दक्षता पर निर्भर करती है, और एंटीबॉडी का अनुमापन (उदाहरण के लिए, 1: 50, 1: 100, 1: 200, और 1: 400 अंतिम कमजोर पड़ने) आवश्यक हो सकता है यदि ब्याज के एंटीबॉडी को पहले CHIP या CUT & RUN प्रयोगों में परीक्षण नहीं किया गया है। उपयोग करने से पहले बर्फ पर सभी बफ़र्स को ठंडा करें। एंटीबॉडी बाध्यकारी चरणों के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी बफर को प्रयोग के दिन ताजा तैयार किया जाना चाहिए।

1. ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें और घोल पूरी तरह से स्पष्ट होने तक प्रतीक्षा करें; निकालें और एक पिपेट का उपयोग कर supernatant को छोड़ दें। एंटीबॉडी बफर के 50 μL जोड़ें और धीरे से pipetting द्वारा मिश्रण.
2. एंटी-जीएफपी पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के 3 μL जोड़ें (या 0.5 μg यदि एक untested एंटीबॉडी का उपयोग कर)। 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक nutating मिक्सर पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
   नोट: कुछ कट एंड रन प्रोटोकॉल रिपोर्ट एक द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ने से पहले एक द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ने से उपज में वृद्धि हुई है पीएजी-MNase इसके अलावा¹⁴; हालांकि, इस जोड़े गए चरण का उपयोग करके कोई महत्वपूर्ण सुधार नहीं देखा गया था, और इस प्रकार, यह इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है।
3. संक्षेप में 5 s के लिए कमरे के तापमान पर 100 × जी पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें, ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें, और एक बार घोल स्पष्ट होने के बाद, एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को हटा दें और छोड़ दें। जबकि मोतियों वाले ट्यूब अभी भी चुंबकीय रैक पर हैं, बर्फ-ठंडे सेल परमेबिलाइजेशन बफर के 200 μL को सीधे मोतियों पर जोड़ें। निकालें और एक पिपेट का उपयोग कर supernatant छोड़ दें। बर्फ-ठंडा सेल Permeabilization बफर के साथ दो washes की कुल के लिए दोहराएँ.
4. प्रत्येक ट्यूब के लिए बर्फ ठंडा सेल Permeabilization बफर के 50 μL जोड़ें और धीरे pipetting द्वारा मिश्रण.
   नोट: मोतियों को अक्सर इस बिंदु पर एकत्रित किया जाता है लेकिन आसानी से 200 μL पिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे मिश्रण करके फैलाया जा सकता है।

8. एंटीबॉडी के लिए पीएजी-MNase का बंधन

1. प्रत्येक नमूने के लिए pAG-Mnase (20x स्टॉक) के 2.5 μL जोड़ें और धीरे से pipetting द्वारा मिश्रण। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक nutator पर नमूनों (थोड़ा ऊंचा ~ 45 ° कोण पर ऊंचा) रखें। Nutator चालू करें और 1 ज के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
2. संक्षेप में 5 s के लिए कमरे के तापमान पर 100 × जी पर पट्टी ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें, ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें और, एक बार घोल स्पष्ट होने के बाद, एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को हटा दें और छोड़ दें।
   नोट:: यह चरण महत्वपूर्ण है। इस चरण के बाद कैप या ट्यूबों के किनारों में शेष कैरीओवर एंटीबॉडी पृष्ठभूमि संकेत की मात्रा में काफी वृद्धि करेगा।
3. जबकि मोतियों वाले ट्यूब अभी भी चुंबकीय रैक पर हैं, बर्फ-ठंडे सेल परमेबिलाइजेशन बफर के 200 μL जोड़ें, घोल को साफ करने की अनुमति दें, और एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को हटाने और त्याग दें। सेल Permeabilization बफ़र के साथ दो washes की कुल के लिए इस चरण को दोहराएँ।
4. नमूने के लिए बर्फ-ठंडा सेल Permeabilization बफर के 100 μL जोड़ें और धीरे से पिपेट ऊपर और नीचे 5 बार.

9. लक्षित क्रोमैटिन पाचन और रिलीज

1. 5 मिनट के लिए एक गीला बर्फ स्नान में नमूना (ओं) युक्त ट्यूबों incubate. एक multichannel पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक नमूने में 100 mM CaCl₂ के 3 μL जोड़ें। धीरे से पिपेट 5 बार ऊपर और नीचे, तुरंत गीले बर्फ स्नान के लिए ट्यूबों को वापस करें, और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
2. प्रत्येक नमूने के लिए बंद करो बफर के 66 μL जोड़ें और धीरे भंवर मिश्रण करने के लिए. एक सूखे स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
   नोट: यह हेटरोलॉगस ई कोलाई स्पाइक-इन डीएनए प्रति नमूना के 1.5 पीजी को जोड़ने के लिए अनुशंसित है प्रति नमूना में रोकें बफर. ई कोलाई स्पाइक-इन डीएनए के 1.5 पीजी के अलावा 1,000-10,000 मैप किए गए स्पाइक-इन में 1-10 मिलियन मैप किए गए प्रयोगात्मक रीड्स¹⁴ के लिए रीड्स में परिणाम होता है। स्पाइक-इन डीएनए का उपयोग अनुक्रमण गहराई को कैलिब्रेट करने के लिए किया जाता है और एक श्रृंखला में नमूनों की तुलना करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। स्पाइक-इन ई कोलाई के अलावा अत्यधिक अनुशंसित है लेकिन आवश्यक नहीं है। वाणिज्यिक कट एंड रन किट में ई कोलाई स्पाइक-इन डीएनए शामिल है, लेकिन इसे अलग से भी खरीदा जा सकता है।
3. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों जगह और एक 1.5 mL microfuge ट्यूब में supernatant के 160 μL हस्तांतरण. एक नए 2 mL microfuge ट्यूब में नमूने के 80 μL स्थानांतरण और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान की घटना है कि एक बैकअप नमूने की आवश्यकता है में. 80 μL नमूने के साथ चरण 10 के लिए आगे बढ़ें।

10. एकत्र डीएनए नमूनों की सफाई

नोट: उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डीएनए शुद्धिकरण मोती इनक्यूबेट करें। Prechill बर्फ पर 100% आइसोप्रोपेनॉल। नमूनों को मिलाते समय, पिपेट ऊपर और नीचे 10 बार।

1. भंवर डीएनए शुद्धिकरण मोती मनका निलंबन homogenize करने के लिए. प्रत्येक नमूने के लिए resuspended मोतियों के 50 μL (~ 0.6x नमूना मात्रा) जोड़ें। पिपेट-मिश्रण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक nutator पर नमूनों को इनक्यूबेट.
   नोट: उपयोग किए गए नमूने के लिए डीएनए शुद्धिकरण मोतियों का अनुपात महत्वपूर्ण है। नमूने के सापेक्ष डीएनए शुद्धिकरण मनका समाधान की 0.6x मात्रा का उपयोग करना चुंबकीय मोतियों को क्षतिग्रस्त नाभिक से जारी बड़े डीएनए टुकड़ों को बांधने की अनुमति देता है। CUT & RUN-समृद्ध डीएनए टुकड़े इन बड़े डीएनए टुकड़ों की तुलना में बहुत छोटे होते हैं और इस प्रकार इस चरण में supernatant में बनाए रखा जाता है।
2. एक चुंबकीय रैक पर ट्यूबों जगह और एक 0.2 mL 8 ट्यूब पट्टी के लिए डीएनए युक्त supernatant के 130 μL हस्तांतरण. नमूना (ओं) के लिए डीएनए शुद्धिकरण मोती का एक अतिरिक्त 30 μL जोड़ें (कुल मात्रा 160 μL है)।
3. बर्फ-ठंडा 100% आइसोप्रोपेनॉल के 170 μL (~ 1x नमूना मात्रा) जोड़ें, 10 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण, और 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
   नोट: यह महत्वपूर्ण है कि 100% बर्फ-ठंडे आइसोप्रोपेनॉल का उपयोग डीएनए शुद्धिकरण मोतियों के लिए इस चरण के लिए किया जाता है ताकि कट एंड रन-समृद्ध छोटे टुकड़ों को कुशलतापूर्वक कैप्चर किया जा सके।
4. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों को रखें, और एक बार घोल साफ हो जाने के बाद, सावधानीपूर्वक निकालें और एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को छोड़ दें।
5. जबकि ट्यूब चुंबकीय रैक पर हैं, ताजा तैयार के 200 μL जोड़ें, ट्यूबों के लिए कमरे का तापमान 80% इथेनॉल और 30 s के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। सावधानी से निकालें और एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को छोड़ दें। 80% इथेनॉल के साथ कुल दो धोने के लिए इस चरण को दोहराएं।
6. जल्दी से 100 × जी पर ट्यूबों स्पिन, चुंबकीय रैक पर वापस ट्यूबों जगह, और घोल साफ हो गया है के बाद एक पिपेट का उपयोग कर किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने. 5 मिनट के लिए मोतियों को एयर-ड्राई करें, जबकि ट्यूब ढक्कन के साथ चुंबकीय रैक पर रहते हैं।
   नोट: सूखने के समय के 5 मिनट से अधिक न करें क्योंकि यह अंतिम डीएनए उपज को काफी कम कर सकता है।
7. चुंबकीय रैक से ट्यूबों को निकालें और पीएच 8 पर 0.1x Tris-EDTA (TE) के 17 μL जोड़कर मोतियों से डीएनए को बाहर निकालें। अच्छी तरह से मिलाएं और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
8. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों को तब तक रखें जब तक कि घोल स्पष्ट न हो जाए। एक बार घोल साफ हो जाने के बाद, सावधानीपूर्वक एक बाँझ 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब के लिए supernatant के 15 μL स्थानांतरित करें।
9. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए फ्लोरोमीटर का उपयोग करके एकत्र किए गए डीएनए की एकाग्रता को मापें।
   नोट: आमतौर पर, एकत्र किए गए डीएनए की एकाग्रता ~ 1 एनजी / μL है। कभी-कभी, एकत्र किए गए डीएनए की एकाग्रता फ्लोरोमीटर का उपयोग करके मापने के लिए बहुत कम होती है। यह एक असफल प्रयोग का संकेतक नहीं है। एकत्रित डीएनए की एकाग्रता की परवाह किए बिना पुस्तकालय की तैयारी के साथ आगे बढ़ें।
10. चरण 11 पर आगे बढ़ें या तैयार होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें।

11. अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय की तैयारी

नोट:: निम्न चरणों का उपयोग किसी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लायब्रेरी prep किट। बंधाव मास्टर मिक्स का उपयोग करके चरणों का प्रदर्शन करते समय, ट्यूबों को छूना कम करें और हमेशा उन्हें बर्फ पर रखें।

1. pH 8 पर 0.1x TE का उपयोग करते हुए, CUT&RUN DNA की कुल मात्रा को 50 μL तक लाएं। प्रति नमूना एंड प्रेप एंजाइम मिक्स के 3 μL और एंड प्रेप रिएक्शन बफर के 7 μL का मास्टर मिश्रण बनाएं। CUT&RUN DNA में मास्टर मिश्रण के 10 μL जोड़ें और 5 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण।
2. ट्यूब के किनारों से सभी तरल एकत्र करने के लिए 100 × जी पर एक त्वरित स्पिन करें। ट्यूबों को एक थर्मोसाइकिलर में गर्म ढक्कन के साथ ≥75 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और तालिका 7 में साइकिल चलाने की स्थिति को चलाएं।
   नोट:: चरण 10 से एकत्रित प्रारंभिक इनपुट डीएनए सांद्रता के आधार पर, तालिका 8 से आवश्यक एडाप्टर कमजोर पड़ने का पालन करें।
3. प्रति नमूना एडाप्टर के 2.5 μL जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण 10 बार.
   नोट:: यह महत्वपूर्ण है कि एडाप्टर नमूना करने के लिए जोड़ा जाता है और लिगेशन मास्टर मिश्रण जोड़ा जाता है से पहले अच्छी तरह से मिश्रित है।
4. बंधाव मास्टर मिक्स के 30 μL और बंधाव बढ़ाने के 1 μL का एक मास्टर मिश्रण बनाओ। नमूना (ओं) के लिए मास्टर मिश्रण के 31 μL जोड़ें। 10 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण.
5. गर्म ढक्कन बंद के साथ एक thermocycler में 15 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर incubate.
   नोट: यह महत्वपूर्ण है कि नमूनों को बर्फ पर रखा जाए और थर्मोसाइकिलर को केवल थर्मोसाइकिलर को स्थानांतरित किया जाए जब थर्मोसाइकलर 20 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया हो।
6. ट्यूब के किनारों से सभी तरल एकत्र करने के लिए 100 × जी पर एक त्वरित स्पिन करें, यूरेसिल उच्छेदन एंजाइम के 3 μL जोड़ें, और थर्मोसाइकलर में ट्यूबों को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, गर्म ढक्कन के साथ ≥47 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
   नोट:: यह एक सुरक्षित रोक बिंदु है; -20 °C पर नमूनों को संग्रहीत करें या सीधे चरण 11.7 पर जारी रखें। यदि सीधे चरण 11.7 पर जारी है, तो उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डीएनए शुद्धिकरण मोतियों को इनक्यूबेट करें।
7. चरण 11.6 से एडाप्टर बंधाव प्रतिक्रिया के लिए डीएनए शुद्धिकरण मोती के 154.4 μL (~ 1.6x नमूना मात्रा) जोड़ें। पिपेट-मिश्रण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
8. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों को रखें और एक बार घोल साफ हो जाने के बाद, सावधानीपूर्वक निकालें और एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को त्याग दें।
9. ताजा तैयार के 200 μL जोड़ें, ट्यूबों के लिए कमरे का तापमान 80% इथेनॉल और 30 s के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। सावधानी से निकालें और एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को छोड़ दें और 80% इथेनॉल के साथ कुल दो धोने के लिए इस चरण को दोहराएं।
10. ट्यूबों को संक्षेप में 100 × जी पर स्पिन करें। चुंबकीय रैक पर ट्यूबों को वापस रखें और एक पिपेट का उपयोग करके किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल को हटा दें। हवा 5 मिनट के लिए मोतियों को सुखाती है जबकि ट्यूब ढक्कन खुले के साथ चुंबकीय रैक पर रहती हैं।
    नोट: सूखने के समय के 5 मिनट से अधिक न करें क्योंकि यह अंतिम डीएनए उपज को काफी कम कर सकता है।
11. चुंबकीय रैक से ट्यूबों को निकालें और पीएच 8 पर 0.1x TE के 17 μL जोड़कर मोतियों से डीएनए को बाहर निकालें। अच्छी तरह से मिलाएं और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
12. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों को तब तक रखें जब तक कि घोल स्पष्ट न हो जाए। एक बार घोल साफ हो जाने के बाद, सावधानीपूर्वक एक बाँझ 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब के लिए supernatant के 15 μL स्थानांतरित करें।
13. डीएनए पोलीमरेज़ मास्टर मिक्स के 25 μL और यूनिवर्सल फॉरवर्ड लाइब्रेरी एम्प्लीफिकेशन प्राइमर (10 μM) प्रति नमूना के 5 μL का मास्टर मिश्रण बनाएं।
    नोट:: मास्टर मिश्रण का एक अतिरिक्त नमूना pipetting नुकसान के लिए खाते के लिए तैयार करें।
14. एडाप्टर-लिगेटेड डीएनए नमूने के 15 μL के लिए मास्टर मिश्रण के 30 μL जोड़ें। अंतिम आयतन को कुल 50 μL तक लाने के लिए प्रत्येक नमूने में रिवर्स यूनिकली अनुक्रमित लाइब्रेरी प्रवर्धन प्राइमर (10 μM) का 5 μL जोड़ें। 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं। तालिका 9 में PCR साइक्लिंग स्थितियों का निष्पादन करें।
    नोट: उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डीएनए शुद्धिकरण मोती इनक्यूबेट करें।
15. भंवर डीएनए शुद्धिकरण मोती resuspend करने के लिए. PCR-प्रवर्धित डीएनए नमूनों के लिए resuspended मोतियों के 35 μL (~ 0.7x नमूना मात्रा) जोड़ें। मिश्रण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक nutator पर नमूनों को इनक्यूबेट.
16. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों को रखें और एक बार घोल स्पष्ट होने के बाद, डीएनए वाले supernatant को एक नए 0.2 mL 8-well PCR स्ट्रिप ट्यूब में स्थानांतरित करें।
17. नमूने के लिए मोतियों के 119 μL (~ 1.4x नमूना मात्रा) जोड़ें, और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण 5 बार. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक nutator पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
18. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों को रखें और एक बार घोल साफ हो जाने के बाद, सावधानीपूर्वक निकालें और एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को त्याग दें।
19. ताजा तैयार के 200 μL जोड़ें, ट्यूबों के लिए कमरे का तापमान 80% इथेनॉल और 30 s के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। सावधानी से निकालें और एक पिपेट का उपयोग कर supernatant त्याग; 80% इथेनॉल के साथ कुल दो धोने के लिए चरण को दोहराएं।
20. ट्यूबों को संक्षेप में 100 × जी पर स्पिन करें। चुंबकीय रैक पर ट्यूबों को वापस रखें और एक पिपेट का उपयोग करके किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल को हटा दें। 5 मिनट के लिए मोतियों को एयर-ड्राई करें, जबकि ट्यूब ढक्कन के साथ चुंबकीय रैक पर रहते हैं।
    नोट: सूखने के समय के 5 मिनट से अधिक न करें क्योंकि यह अंतिम डीएनए उपज को काफी कम कर सकता है।
21. चुंबकीय रैक से ट्यूबों को निकालें और पीएच 8 पर 0.1x TE के 14 μL जोड़कर मोतियों से डीएनए को हटा दें। अच्छी तरह से मिलाएं और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
22. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों को तब तक रखें जब तक कि घोल स्पष्ट न हो जाए। एक बार घोल साफ हो जाने के बाद, सावधानीपूर्वक supernatant के 13 μL को एक बाँझ 0.2 mL PCR ट्यूब में स्थानांतरित करें।
23. ताजा 1x Tris-borate-EDTA (TBE) तैयार करें और 1x TBE से भरे जेल वैद्युतकणसंचलन उपकरण में पूर्वनिर्मित, वाणिज्यिक 10% एक्रिलामाइड TBE जेल डालें।
24. पहले कुएं में, कम दूरी की डीएनए सीढ़ी के 2 μL जोड़ें। पहले चरण 11.22 से एकत्र किए गए नमूने के 13 μL के साथ 6x लोडिंग डाई के 3 μL को मिलाएं। जेल के प्रत्येक कुएं में सावधानीपूर्वक 15 μL जोड़ें। जेल को 70 वोल्ट पर 90 मिनट के लिए चलाएं।
    नोट: प्रत्येक नमूने के बीच जेल में एक अच्छी तरह से खाली छोड़ने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि यह नमूना क्रॉस संदूषण की संभावना को कम करता है। अनुभवी उपयोगकर्ताओं को क्रॉस संदूषण से सावधानीपूर्वक बचने के दौरान सभी कुओं का उपयोग करना उचित हो सकता है, खासकर जब बड़ी संख्या में नमूनों को संसाधित किया जाता है।
25. जेल बॉक्स से डाली जेल निकालें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार जेल कास्ट खोलें, धीरे से जेल कास्ट से जेल को हटा दें, और इसे 1x टीबीई के 100 मिलीलीटर युक्त ट्रे रखने वाले जेल के अंदर रखें।
    नोट: जेल कास्ट से जेल को धीरे से हटाना सुनिश्चित करें ताकि जेल को रिप करने से बचने के लिए क्योंकि यह पतला और नाजुक है। जब भी जेल को संभालते हैं तो 1x टीबीई के साथ दस्ताने और जेल को प्रीवेट करना महत्वपूर्ण है। ट्रे रखने वाले जेल को जेल के आकार से थोड़ा बड़ा होना चाहिए (प्रत्येक पक्ष पर लगभग 0.5 ")। 96-अच्छी तरह से पीसीआर-ट्यूब स्टोरेज बक्से के साथ प्रदान किए गए प्लास्टिक के ढक्कन मानक मिनी जेल आकारों के लिए ट्रे रखने में सुविधाजनक हैं।
26. ट्रे के लिए न्यूक्लिक एसिड जेल दाग के 10 μL जोड़ें और धीरे से घुमाव। प्रकाश से बचाने के लिए पन्नी के साथ कवर करें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्थैतिक रूप से इनक्यूबेट करें।
27. विआयनीकृत नल के पानी के 100 मिलीलीटर के साथ जेल को दो बार कुल्ला करें। एक एम्बर फ़िल्टर कवर (चित्रा 2) का उपयोग करके नीली रोशनी रोशनी के तहत जेल की छवि।
    नोट:: सफल लायब्रेरीज़ 100 और 500 bp के बीच एक स्मीयर दिखाएँ। वहाँ भी एक प्रमुख ~ 125 एडाप्टर डिमर बैंड होगा. एडाप्टर डिमर की उपस्थिति खराब पुस्तकालय गुणवत्ता का संकेतक नहीं है। एडाप्टर डिमर की यह मात्रा कम-बहुतायत वाले टीएफ पर किए गए CUT & RUN प्रयोगों के लिए अपरिहार्य है और इन पुस्तकालयों को तैयार करने के लिए उपयोग की जाने वाली इनपुट सामग्री की कम मात्रा का परिणाम है। पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग न करें, जो डीएनए को नुकसान पहुंचा सकता है।
28. जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, प्रत्येक पुस्तकालय के लिए, जेल को ~ 125 बीपी प्रमुख एडाप्टर डिमर बैंड के ऊपर थोड़ा ऊपर काटें (एडाप्टर डिमर बैंड को छूने से बचने के लिए सुनिश्चित करें) और 400 बीपी सीढ़ी के निशान के नीचे।
    नोट:: यह ~ 125 एडाप्टर डिमर बैंड से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां तक कि एडाप्टर डिमर की छोटी मात्रा भी पुस्तकालय की गुणवत्ता को काफी कम कर देगी।
29. एक 22 जी सुई का उपयोग करके एक 0.65 मिलीलीटर ट्यूब के नीचे पंचर करें और एक बाँझ 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब के अंदर पंचर ट्यूब रखें। जेल स्लाइस को 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब के अंदर पंचर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
30. 2 mL microfuge ट्यूब 0.65 mL पंचर ट्यूब युक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब centrifuge और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 10,000 × g पर नमूना 2 mL microfuge ट्यूब के अंदर जेल घोल इकट्ठा करने के लिए।
    नोट: पंचर ट्यूब अब खाली होना चाहिए और छोड़ दिया जा सकता है। यदि पंचर ट्यूब में अभी भी कोई जेल शेष है, तो पंचर ट्यूब को 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब के अंदर वापस रखें और अतिरिक्त 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 10,000 × ग्राम पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
31. 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब के अंदर जेल घोल के लिए, बर्फ-ठंडे जेल क्षालन बफर के 300 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर कम से कम 3 घंटे या रात भर (12-16 घंटे) के लिए एक nutator पर मिश्रण करें।
32. एक 0.22 μm फिल्टर कॉलम के लिए सभी तरल और जेल घोल स्थानांतरण। 10,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर; एकत्रित मात्रा ~ 300 μL होना चाहिए।
33. डीएनए शुद्धिकरण मोती के 450 μL (~ 1.5x नमूना मात्रा) जोड़ें, एक nutator पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन, और फिर चुंबकीय रैक पर नमूना जगह जब तक घोल स्पष्ट है.
    नोट: उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डीएनए शुद्धिकरण मोती इनक्यूबेट करें।
34. निकालें और supernatant के 500 μL को त्यागें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि मोतियों को बाधित नहीं करना है।
35. चुंबकीय रैक से नमूना निकालें और ऊपर और नीचे 5 बार pipetting द्वारा मोतियों मिश्रण. एक नई पीसीआर पट्टी ट्यूब में नमूने के 200 μL स्थानांतरण.
36. चुंबकीय रैक पर पट्टी ट्यूब रखें, और एक बार घोल साफ हो जाने के बाद, सावधानीपूर्वक निकालें और एक पिपेट का उपयोग करके supernatant को छोड़ दें।
37. ताजा तैयार के 200 μL जोड़ें, ट्यूबों के लिए कमरे का तापमान 80% इथेनॉल और 30 s के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। सावधानी से निकालें और एक पिपेट का उपयोग कर supernatant त्याग; 80% इथेनॉल के साथ कुल दो धोने के लिए इस चरण को दोहराएं।
38. ट्यूबों को संक्षेप में 100 × जी पर स्पिन करें। चुंबकीय रैक पर ट्यूबों को वापस रखें और एक पिपेट का उपयोग करके किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल को हटा दें। 5 मिनट तक मोतियों को हवा से सुखाएं, जबकि ट्यूब ढक्कन खुले के साथ चुंबकीय रैक पर रहते हैं।
    नोट: सूखने के समय के 5 मिनट से अधिक न करें क्योंकि यह अंतिम डीएनए उपज को काफी कम कर सकता है।
39. चुंबकीय रैक से ट्यूबों को निकालें और पीएच 8 पर 0.1x TE के 17 μL जोड़कर मोतियों से डीएनए को बाहर निकालें। अच्छी तरह से मिलाएं और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
40. चुंबकीय रैक पर ट्यूबों को तब तक रखें जब तक कि घोल स्पष्ट न हो जाए। एक बार घोल साफ हो जाने के बाद, सावधानीपूर्वक एक बाँझ 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब के लिए supernatant के 15 μL स्थानांतरित करें।
41. फ्लोरोमीटर का उपयोग करके अंतिम पुस्तकालय मात्रा को मापें; अनुक्रमण के लिए इस अंतिम पुस्तकालय का उपयोग करें।
    नोट: अप करने के लिए 48 पुस्तकालयों पूल किया जा सकता है और एक ही लेन में एक साथ अनुक्रमित एक अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग कर जो कम से कम 300 मिलियन 40 bp या लंबे समय तक युग्मित-अंत पढ़ता है प्रदान करता है।

12. कट एंड रन अनुक्रम विश्लेषण

नोट:: यह अनुभाग CUT&RUN अनुक्रम डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कम्प्यूटेशनल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल कम्प्यूटेशनल आभासी वातावरण की स्थापना के साथ शुरू होता है और उपयोगकर्ताओं को अपनी स्थानीय मशीन पर कमांड निष्पादित करने के माध्यम से चलता है। यह प्रोटोकॉल सभी कम्प्यूटेशनल संसाधनों, जैसे स्थानीय मशीनों, वर्चुअल क्लाउड सर्वर और उच्च-प्रदर्शन कंप्यूटिंग क्लस्टर पर काम करेगा। इस पेपर में प्रस्तुत सभी CUT&RUN डेटा को परिग्रहण संख्या GSE193803 के तहत NCBI GEO पर एक्सेस किया जा सकता है।

1. https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis से CUT&RUN विश्लेषण के लिए स्रोत कोड डाउनलोड करें.
   नोट:: वर्कफ़्लो MacOS या Linux OS सिस्टम पर सबसे अच्छा काम करेगा। Windows उपयोगकर्ता GitBash का उपयोग करके वर्कफ़्लो चला सकते हैं ( सामग्री तालिका देखें).
   1. सीधे हरे रंग के कोड बटन पर क्लिक करके GitHub पृष्ठ से कोड डाउनलोड करें | ज़िप विकल्प डाउनलोड करें. फ़ोल्डर को स्थानीय मशीन पर किसी प्रासंगिक स्थान पर अनज़िप करें.
2. कोंडा वातावरण स्थापित करें ( सामग्री की तालिका देखें) और केवल एक बार चलाएँ।
   नोट:: यह वर्कफ़्लो सभी आवश्यक सॉफ़्टवेयर और उपकरण स्थापित करने के लिए कोंडा आदेश पंक्ति उपकरण वातावरण का उपयोग करता है।
3. एक बार कोंडा स्थापित हो जाता है (केवल एक बार चलाएँ), निम्न आदेश के साथ प्रदान की गई अनुपूरक फ़ाइल 2 का उपयोग करके एक वर्चुअल वातावरण बनाएँ:
   कोंडा बनाएँ --name --file Supplementary_File_2.txt
4. हर बार जब इस वर्कफ़्लो का उपयोग करके निष्पादित किया जाना है तो वर्चुअल वातावरण को सक्रिय करें:
   कोंडा <एनवी को सक्रिय करता है>
5. इनपुट कच्चे FASTQ फ़ाइलों को एक एकल फ़ोल्डर में व्यवस्थित करें, आदर्श रूप से CUT&RUN प्रयोग प्रति एक फ़ोल्डर।

13. संरेखण के लिए जीनोम फ़ाइल की पीढ़ी

1. संरेखण के लिए जीनोम फ़ाइल उत्पन्न करें (प्रत्येक जीनोम फ़ाइल के लिए केवल एक बार चलाएं)। सभी C. albicans जीनोम फ़ाइलों को सहेजने के लिए एक फ़ोल्डर बनाएँ, जैसे:
   mkdir ca_genome_files

14. डाउनलोड सी albicans जीनोम विधानसभा 21

1. डाउनलोड C. albicans जीनोम असेंबली 21 Candida जीनोम डेटाबेस से या तो wget या कर्ल उपकरण का उपयोग कर ( सामग्री की तालिका देखें)¹⁸.
   नोट: C. albicans असेंबली 21 का उपयोग पहले प्रकाशित CHIP-चिप परिणामों के साथ CUT&RUN परिणामों की तुलना करने के लिए किया गया था, जिन्हें असेंबली 21 में संरेखित किया गया था। उपयोगकर्ता अन्य असेंबली संस्करणों को डाउनलोड कर सकते हैं और अपनी संरेखण आवश्यकताओं के लिए प्रासंगिक जीनोम फ़ाइलों को उत्पन्न करने के लिए समान कमांड चला सकते हैं।

15. एक Bowtie 2 अनुक्रमणिका डेटाबेस जनरेट करें (डेटाबेस का नाम: ca21)

1. निम्न का उपयोग करें:
   bowtie2-बिल्ड C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
   bowtie2-निरीक्षण -s ca21

16. CUT&RUN विश्लेषण पाइपलाइन चलाएँ

1. पाइपलाइन के पैरामीटर से परिचित होने के लिए मदद अनुभाग पढ़ें.
   बैश cut_n_run_pipeline.sh -h

17. प्रासंगिक पैरामीटर के साथ cut_n_run_pipeline.sh फ़ाइल निष्पादित करें

1. स्क्रिप्ट निष्पादित करें:
   bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y y y > /path/to/output.log 2>&1
   नोट:: कोड की 19-36 पंक्तियों पर विस्तृत विवरण के साथ प्रासंगिक पैरामीटर GitHub पृष्ठ https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh पर वर्णित हैं।

18. आउटपुट फ़ाइलों को व्यवस्थित करें

1. BedTools मर्ज फ़ंक्शन¹⁹ का उपयोग करके /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 में स्थित MACS2 द्वारा बुलाए गए सभी प्रतिकृतियों से महत्वपूर्ण चोटियों को मर्ज करें।
   cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files sort -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o अंतिम, माध्य, पहला, माध्य, माध्य, माध्य > /path/to/merged_output.bed
   नोट: अतिरिक्त जानकारी और प्रतिकृति नमूनों में अतिव्यापी चोटियों का आकलन करने पर सर्वोत्तम प्रथाओं के लिए, कृपया Landt et ^al.20 और Boyd et ^al.21 को देखें।

19. BedTools घटाना समारोह का उपयोग कर ब्लॉकलिस्टेड जीनोमिक क्षेत्रों के लिए मैच निकालें

1. निम्न का उपयोग करें: subtractBed -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
   नोट:: C. albicans जीनोम में blocklisted क्षेत्रों अनुपूरक फ़ाइल 3 में एक .bed फ़ाइल के रूप में प्रदान किए जाते हैं। सूची में मुख्य रूप से अत्यधिक दोहराए जाने वाले अनुक्रम तत्व और क्षेत्र जैसे टेलोमेरिक दोहराव और सेंट्रोमियर शामिल हैं जो आमतौर पर सी अल्बिकन्स कट एंड रन, सीआईपी-सेक और सीआईपी-चिप डेटासेट में झूठे-सकारात्मक परिणाम देते हैं। इसलिए, ब्लॉकलिस्टेड क्षेत्रों को हटाने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, कुछ प्रोटीन लक्ष्यों के लिए, इन लोकी को बाहर करना अनुचित या अवांछनीय हो सकता है। उपयोगकर्ता इन ब्लॉकलिस्टेड क्षेत्रों के भीतर निहित संकेतों को बनाए रखने के लिए इस चरण को छोड़ सकते हैं या अपने स्वयं के ब्लॉकलिस्टेड क्षेत्र बना सकते हैं।

20. मर्ज BigWig फ़ाइलों से प्रतिकृति से UCSC bigWigMerge समारोह²² का उपयोग कर

1. निम्नलिखित का उपयोग करें: bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_files/path/to/input/folder/bigwig/all_final_bdg_file
2. UCSC bedGraphToBigWig समारोह का उपयोग कर BigWig करने के लिए BigWig से BedGraph आउटपुट कनवर्ट करें।
   bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bdg_file/path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_file

Representative Results

इस मजबूत CUT & RUN प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था और C. albicans biofilms और प्लवक संस्कृतियों में विशिष्ट TFs के जीनोम-वाइड स्थानीयकरण की जांच के लिए अनुकूलित किया गया था (प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के अवलोकन के लिए चित्रा 2 देखें)। परिणामी CUT &RUN अनुक्रमण डेटा के विश्लेषण को सुविधाजनक बनाने के लिए एक संपूर्ण डेटा विश्लेषण पाइपलाइन भी शामिल है और उपयोगकर्ताओं को कोडिंग या जैव सूचना विज्ञान में न्यूनतम विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है (विश्लेषण पाइपलाइन के अवलोकन के लिए चित्रा 3 देखें)। CHIP-चिप और CHIP-seq विधियों के विपरीत, CUT&RUN को फॉर्मेल्डिहाइड क्रॉसलिंकिंग के बिना इनपुट कोशिकाओं की काफी कम संख्या से तैयार अक्षुण्ण, permeabilized नाभिक का उपयोग करके किया जाता है। सी एल्बिकन्स स्फेरोप्लास्ट से बरकरार नाभिक को अलग करना प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। लिटिकेस का उपयोग करके सी अल्बिकन्स सेल की दीवार के पाचन के माध्यम से कुशल स्फेरोप्लास्टिंग चुनौतीपूर्ण हो सकती है क्योंकि एंजाइमेटिक पाचन प्रतिक्रिया की स्थिति को प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस प्रकार, उच्च गुणवत्ता वाले अनुक्रमण परिणामों के साथ एक सफल CUT & RUN प्रयोग सुनिश्चित करने के लिए, एक प्रारंभिक गुणवत्ता नियंत्रण चरण शामिल है, और बरकरार नाभिक की उपस्थिति को एक मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सत्यापित किया जाता है।

सेल दीवार पाचन और परमाणु अखंडता का मूल्यांकन नियमित रूप से दोनों नियंत्रण बरकरार कोशिकाओं और फ्लोरोसेंट सेल की दीवार और न्यूक्लिक एसिड दाग के साथ दाग वाले पृथक नाभिक की कल्पना करके किया जाता है। पृथक अक्षुण्ण नाभिक के विपरीत, जहां सेल की दीवार धुंधला नहीं देखी जाती है, नाभिक और सेल की दीवारों दोनों को बरकरार नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 4 ए) में फ्लोरोसेंटली लेबल किया जाता है। अंत में, अनुक्रमण से पहले, CUT &RUN पुस्तकालयों के टुकड़े के आकार के वितरण का मूल्यांकन केशिका वैद्युतकणसंचलन उपकरण का उपयोग करके किया जाता है। यह गुणवत्ता नियंत्रण चरण CUT&RUN पुस्तकालयों की गुणवत्ता का आकलन करने में एक विश्वसनीय उपाय है। जैसा कि चित्रा 4 बी के शीर्ष पैनल पर वैद्युतकणसंचलन ट्रेस में देखा गया है, टीएफ की जांच करने वाले प्रयोगों के लिए उत्पन्न सफल पुस्तकालय 280 बीपी से छोटे टुकड़ों के लिए उच्च संवर्धन दिखाते हैं। चित्रा 4B के निचले पैनल में वैद्युतकणसंचलन ट्रेस एक असफल CUT&RUN प्रयोग के परिणामों का प्रतिनिधित्व करता है।

यहां, ~ 2,000 बीपी पर चोटी मुख्य रूप से कट एंड रन प्रयोग के दौरान बड़े पैमाने पर क्षतिग्रस्त या टूटे हुए नाभिक से जारी अनपच डीएनए से उत्पन्न हुई। अंतिम पूल किए गए पुस्तकालयों के खंड आकार वितरण का आकलन भी दूषित एडाप्टर डिमर (चित्रा 4 सी) के पूर्ण निष्कासन की पुष्टि करने के लिए अनुशंसित है। आमतौर पर, प्रति पुस्तकालय 5-10 मिलियन युग्मित-अंत पढ़ता है (~ 40 आधार पढ़ने की लंबाई) सी अल्बिकन्स में अधिकांश टीएफ कट एंड रन प्रयोगों के लिए पर्याप्त अनुक्रमण गहराई प्रदान करता है। वैकल्पिक अनुक्रमण पठन लंबाई, या तो युग्मित-अंत या एकल-अंत, का उपयोग CUT&RUN पुस्तकालयों को अनुक्रमित करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 25 और 150 bp के बीच युग्मित-अंत पठन लंबाई परिणामों की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करना चाहिए। सिंगल-एंड 150 बीपी से अधिक या बराबर पढ़ता है, टीएफ कट एंड रन प्रयोगों के लिए भी काम करना चाहिए। हालांकि, साथ में डेटा विश्लेषण पाइपलाइन को एकल-अंत पढ़ने को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए।

इस CUT &RUN प्रोटोकॉल और साथ डेटा विश्लेषण पाइपलाइन को दो TFs, Ndt80 और Efg1 की जांच करके मान्य किया गया था, जो C. albicans biofilm गठन को नियंत्रित करते हैं। जैसा कि चित्रा 4 डी में दिखाया गया है, Ndt80 इंटरजेनिक क्षेत्रों में बाध्य है (काले सलाखों द्वारा हाइलाइट किया गया है जो काफी समृद्ध Ndt80 CHIP-chip loci को दर्शाता है) EFG1 ORF के अपस्ट्रीम में। EFG1 के इस इंटरजेनिक क्षेत्र को पहले CHIP-chip⁴ द्वारा बायोफिल्म गठन के दौरान Ndt80 बाइंडिंग के लिए अत्यधिक समृद्ध दिखाया गया था। हालांकि, CUT & RUN प्रयोगों ने CHIP-चिप प्रयोगों (10 चोटियों बनाम 4 चोटियों) की तुलना में इस क्षेत्र के भीतर काफी अधिक चोटियों की पहचान की। Ndt80 डीएनए बाध्यकारी रूपांकनों को CUT&RUN (पूरक चित्रा 1) द्वारा पहचाने गए सभी Ndt80-बाउंड लोकी में समृद्ध किया जाता है, यह दर्शाता है कि इस पद्धति द्वारा पहचाने गए अतिरिक्त चोटियों की संभावना वास्तविक Ndt80-बाउंड साइटें हैं। एक व्यवस्थित तुलनात्मक विश्लेषण ने संकेत दिया कि इस प्रस्तुत CUT & RUN प्रोटोकॉल ने बायोफिल्म गठन⁴ (चित्रा 5) के दौरान Ndt80 और Efg1 के लिए पहले से ज्ञात बाध्यकारी घटनाओं के बहुमत की सफलतापूर्वक पहचान की।

इसके अलावा, कई नए टीएफ बाइंडिंग ईवेंट जो पहले प्रकाशित CHIP-चिप प्रयोगों में कैप्चर नहीं किए गए थे, उन्हें CUT &RUN (चित्रा 5) का उपयोग करके पहचाना गया था। कुल मिलाकर, Ndt80 और Efg1 दोनों पहले प्रकाशित CHIP-चिप डेटा के साथ लोकी ओवरलैपिंग के लिए बाध्य हैं और लोकी को केवल CUT & RUN विधि का उपयोग करके पहचाना जाता है (इन CUT & RUN डेटा और Ndt80 और Efg1 के लिए पहले प्रकाशित CHIP-चिप डेटा के बीच ओवरलैप को चित्र5 में वेन आरेखों में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है)। इसके अलावा, महत्वपूर्ण रूप से कहा जाता है चोटियों (FRiP स्कोर) के भीतर पढ़ने का अंश लगातार उनके नियंत्रण IgG नमूनों की तुलना में GFP-टैग किए गए नमूनों में अधिक थे ( अनुपूरक चित्रा 2 देखें)। संक्षेप में, इन परिणामों से पता चलता है कि यहां वर्णित CUT & RUN प्रोटोकॉल कम-बहुतायत वाले नमूनों से C. albicans TF-DNA बाइंडिंग इंटरैक्शन की जांच करने के लिए अनुकूलित एक मजबूत विधि है।

चित्रा 1: सी अल्बिकन्स टीएफ की एपिटोप टैगिंग। (ए) ब्याज के एक टीएफ जीन (इस मामले में एनडीटी 80 ) की पहचान करें और ओआरएफ के 3 'अंत में कैस 9 (नारंगी आकार द्वारा दर्शाए गए) के काटने को लक्षित करने के लिए एक जीआरएनए का चयन करें। (बी) कैंडिडा क्लैड-अनुकूलित ईजीएफपी >50 बीपी होमोलॉजी अपस्ट्रीम के साथ और कट साइट से डाउनस्ट्रीम डीएसबी की मरम्मत के लिए डीडीएनए प्रदान करेगा। (सी) इच्छित एकीकरण की पुष्टि करने के लिए अलग-अलग कॉलोनियों की जांच करने के लिए कॉलोनी पीसीआर का उपयोग करें। प्राइमरों को लाल तीर द्वारा इंगित किया जाता है, और एम्प्लिकॉन को डैश किए गए बक्से द्वारा दर्शाया जाता है। यह आंकड़ा BioRender.com का उपयोग करके बनाया गया था। संक्षेप: TF = प्रतिलेखन कारक; gRNA = गाइड आरएनए; ORF = खुला पढ़ने का फ्रेम; eGFP = बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; DSB = डबल-फंसे हुए ब्रेक; अमेरिका = अपस्ट्रीम; DS = downstream. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 2: CUT&RUN प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन। C. biofilm या प्लवक संस्कृति की स्थिति से एकत्र की गई albicans कोशिकाओं को बरकरार नाभिक को अलग करने के लिए permeabilized कर रहे हैं। कोना मोतियों को सक्रिय किया जाता है, और बरकरार नाभिक तब सक्रिय कोना मोतियों से बंधे होते हैं। ब्याज के एंटीबॉडी को मनका-बाउंड नाभिक में जोड़ा जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है। अगला, पीएजी-एमएनेज को जोड़ा जाता है और लक्ष्य एंटीबॉडी को बांधने की अनुमति दी जाती है। CaCl₂ के अतिरिक्त के बाद, pAG-MNase सक्रिय हो जाता है, और लक्षित क्रोमैटिन पाचन तब तक आगे बढ़ता है जब तक कि पीएजी-एमएनेज को निष्क्रिय करने के लिए चेलेटिंग अभिकर्मक के अतिरिक्त न हो। पीएजी-एमएनेज-बाउंड एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स को परमीबिलाइज्ड नाभिक से बाहर निकलने की अनुमति है, और परिणामी डीएनए को निकाला और साफ किया जाता है। अनुक्रमण पुस्तकालयों को CUT &RUN-समृद्ध डीएनए टुकड़ों से तैयार किया जाता है, और परिणामस्वरूप पुस्तकालयों को तब अनुक्रमण से पहले दूषित एडाप्टर डिमर को अलग करने और हटाने के लिए 10% पेज जेल पर चलाया जाता है। यह आंकड़ा BioRender.com का उपयोग करके बनाया गया था। संक्षेप: CUT&RUN = लक्ष्य के तहत दरार और न्यूक्लिएज का उपयोग करके रिलीज; ConA = concanavalin A; पृष्ठ = polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 3: CUT&RUN डेटा विश्लेषण पाइपलाइन का योजनाबद्ध अवलोकन. वर्कफ़्लो FastQC का उपयोग कर कच्चे FASTQ फ़ाइलों पर गुणवत्ता जाँच करके प्रारंभ होता है, जिसके बाद अनुक्रमण एडाप्टर को निकालने के लिए ट्रिमिंग होती है. छंटनी की गई रीड्स को तब संदर्भ जीनोम के लिए संरेखित किया जाता है, और संरेखित रीड्स को टीएफ-आकार के बाध्यकारी संकेतों के लिए समृद्ध करने के लिए उनके आकार के आधार पर फ़िल्टर किया जाता है (20 बीपी ≤ 120 बीपी ≤ संरेखित पठन)। आकार-चयनित रीड्स को तब स्पाइक-इन एस्चेरिचिया कोलाई रीड्स के खिलाफ कैलिब्रेट किया जाता है, और कैलिब्रेटेड रीड्स का उपयोग MACS2 का उपयोग करके चोटियों को कॉल करने के लिए किया जाता है। <> प्रतीक यह इंगित करने के लिए एक दृश्य प्रतिनिधित्व है कि C. albicans पढ़ने की गिनती प्रत्येक नमूने के लिए ई कोलाई पठन गिनती का उपयोग करके कैलिब्रेट की गई थी। संक्षेप: CUT&RUN = लक्ष्य के तहत दरार और न्यूक्लिएज का उपयोग करके रिलीज; TF = प्रतिलेखन कारक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र4: गुणवत्ता नियंत्रण सफल CUT&RUN प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण कदम। (A) कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट सेल दीवार (नीले) और न्यूक्लिक एसिड (हरे) दाग से पहले और बाद में नाभिक अलगाव के साथ दाग दिया जाता है और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना की जाती है। (बी) कट एंड रन टीएफ पुस्तकालयों का विश्लेषण केशिका वैद्युतकणसंचलन उपकरण का उपयोग करके किया जाता है। सफल CUT &RUN TF पुस्तकालयों (हरे चेकमार्क द्वारा इंगित) 200 बीपी से छोटे छोटे टुकड़ों के लिए समृद्ध हैं। सबऑप्टिमल कट एंड रन टीएफ पुस्तकालयों (लाल "एक्स" द्वारा इंगित) बड़े डीएनए टुकड़ों के लिए संवर्धन दिखाते हैं। (सी) 48 कट एंड रन पुस्तकालयों को एक साथ पूल किया जाता है और एक केशिका वैद्युतकणसंचलन उपकरण का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। उच्च गुणवत्ता वाले, पूल किए गए पुस्तकालय (हरे चेकमार्क द्वारा इंगित) एडाप्टर डिमर (लेन 1) से मुक्त हैं, जबकि कम गुणवत्ता वाले पूल किए गए पुस्तकालय (लाल "एक्स" द्वारा इंगित) एडाप्टर डिमर (लेन 2) की छोटी मात्रा को बनाए रखते हैं। (डी) CUT&RUN डेटासेट (Ndt80 IgG नियंत्रण, नीचे ट्रैक सहित) से प्रतिनिधि IGV पटरियों EFG1 ORF (Orf19.610 ) के अपस्ट्रीम इंटरजेनिक क्षेत्र में Ndt80 बाइंडिंग (शीर्ष ट्रैक) के लिए महत्वपूर्ण संवर्धन दिखा रहा है। काले सलाखों काफी समृद्ध Ndt80 बाध्यकारी चोटियों पहले प्रकाशित CHIP-चिप प्रयोगों 4 द्वारा पहचाना का प्रतिनिधित्व करते^हैं. नीली सलाखों काफी समृद्ध Ndt80 बाध्यकारी चोटियों CUT &RUN प्रयोगों में यहाँ प्रस्तुत में पहचान का प्रतिनिधित्व करते हैं. स्केल सलाखों = 50 μm (ए). संक्षेप: CUT&RUN = लक्ष्य के तहत दरार और न्यूक्लिएज का उपयोग करके रिलीज; TF = प्रतिलेखन कारक; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; ORF = खुला पढ़ने का फ्रेम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 5: Ndt80 और Efg1 समृद्ध चोटियों का मूल्यांकन प्रस्तुत CUT & RUN प्रोटोकॉल और Candida albicans biofilms पर डेटा विश्लेषण पाइपलाइन का उपयोग कर पहचाना. शीर्ष पंक्ति में वेन आरेख Ndt80 और Efg1 बाइंडिंग साइटों के बीच ओवरलैप की डिग्री को दर्शाते हैं, जिन्हें पहले प्रकाशित CHIP-चिप डेटा⁴ के साथ CUT&RUN के माध्यम से पहचाना गया था। Ndt80 और Efg1 के लिए सभी बाध्यकारी घटनाओं के लिए CUT&RUN संकेतों को नीचे की पंक्ति में रंगीन हीटमैप के रूप में दिखाया गया है (लाल = उच्च शिखर संकेत; नीला = कम / कोई चोटी संकेत नहीं; रंगीन बार GFP सिग्नल से घटाए गए IgG सिग्नल को इंगित करता है); 1,000 bp क्षेत्रों अपस्ट्रीम (-1.0 kb) और डाउनस्ट्रीम (+1.0 kb) हीटमैप में प्रदर्शित होते हैं। एक प्रोफ़ाइल प्लॉट के रूप में सिग्नल तीव्रता (यानी, संवर्धन) हीटमैप के ऊपर दिखाया गया है। Ndt80 और Efg1 के लिए तीन जैविक प्रतिकृतियों का मूल्यांकन CUT &RUN संवर्धन की कल्पना करने के लिए किया गया था। संक्षेप: CHIP = क्रोमैटिन immunoprecipitation; CUT&RUN = लक्ष्य के तहत दरार और न्यूक्लिएज का उपयोग करके रिलीज; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण और पीसीआर साइकिल चलाने की स्थिति सार्वभौमिक ए और अद्वितीय बी टुकड़ों को बढ़ाने के लिए। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण और पीसीआर साइकिल चलाने की स्थिति पूर्ण लंबाई सी टुकड़ा बनाने के लिए ए और बी टुकड़े सिलाई करने के लिए। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: पीसीआर साइक्लिंग की स्थिति पीसीआर पूर्ण लंबाई सी टुकड़े को बढ़ाने के लिए। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 4: दाता डीएनए जीएफपी टैग को बढ़ाने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण और पीसीआर साइक्लिंग की स्थिति। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 5: प्लास्मिड पाचन प्रतिक्रियाओं के लिए प्लास्मिड पाचन प्रतिक्रिया मिश्रण और प्रतिक्रिया की स्थिति। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 6: कॉलोनी पीसीआर के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण और पीसीआर साइक्लिंग की स्थिति। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 7: अनुक्रमण की तैयारी में पुस्तकालय के अंतिम मरम्मत चरण के लिए पीसीआर साइकिल चलाना स्थितियां। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 8: अनुक्रमण लायब्रेरी तैयार करने के लिए इनपुट डीएनए के लिए एडाप्टर कमजोर पड़ने सिफारिशें। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 9: पीसीआर के लिए पीसीआर साइक्लिंग की स्थिति एडाप्टर-लिगेटेड डीएनए को बढ़ाती है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 1: Ndt80 डीएनए बाध्यकारी अनुक्रम आकृति संवर्धन. यादृच्छिक इंटरजेनिक लोकी (लाल बिंदीदार रेखा) के खिलाफ तुलना में बायोफिल्म CHIP-चिप डेटा (गहरे नीले बिंदीदार रेखा) या CUT&RUN डेटा (हल्के नीले बिंदीदार रेखा) में पहचाने गए Ndt80-बाउंड लोकी के लिए संचयी Ndt80-बाउंड लोकी के लिए संचयी Ndt80-बाउंड लोकी के लिए आकृति संवर्धन स्कोर। बायाँ हाथ Y-अक्ष प्रत्येक डेटासेट के लिए कुल लोकी का प्रतिशत इंगित करता है जिसमें X-अक्ष पर एक संगत संचयी मोटिफ स्कोर होता है. डैश्ड लाइनें एक्स-अक्ष पर प्रत्येक बिंदु पर मोटिफ स्कोर संवर्धन (-log10 P-value, righthand Y-axis) के महत्व को इंगित करती हैं, जो यादृच्छिक इंटरजेनिक नियंत्रण लोकी के सापेक्ष होती हैं। संचयी आकृति स्कोर और पी-मान MochiView²³ का उपयोग करके निर्धारित किए गए थे ( सामग्री की तालिका देखें)। सभी Ndt80-बाउंड लोकी को CHIP-चिप और CUT&RUN डेटासेट के भीतर Ndt80 बाइंडिंग के प्रत्येक शिखर के नीचे केंद्रित 500 बीपी खिड़कियों के रूप में नमूना दिया गया था और लंबाई में अंतर के लिए नियंत्रण करने के लिए यादृच्छिक रूप से चयनित 500 बीपी इंटरजेनिक लोकी के खिलाफ तुलना की गई थी। संक्षेप: CHIP = क्रोमैटिन immunoprecipitation; CHIP-चिप = क्रोमैटिन immunoprecipitation माइक्रोएरे द्वारा पीछा किया; CUT&RUN = लक्ष्य के तहत दरार और न्यूक्लिएज का उपयोग करके रिलीज। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 2: प्रति नमूना एक शिखर स्कोर के भीतर पढ़ने का अंश। प्रत्येक प्रतिकृति के लिए FRiP स्कोर को दर्शाने वाला बार प्लॉट। FRIP स्कोर की गणना एक CUT&RUN नमूने में मैप किए गए पढ़ने की कुल संख्या से विभाजित एक चोटी के भीतर मैप किए गए पढ़ने की संख्या के रूप में की जाती है। विभिन्न बार रंग अलग-अलग जैविक प्रतिकृति नमूनों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जैसा कि एक्स-अक्ष के साथ इंगित किया गया है। जैसा कि अपेक्षित था, सकारात्मक जीएफपी नमूनों के एफआरआईपी स्कोर नकारात्मक आईजीजी नमूनों के लिए उन लोगों की तुलना में लगातार अधिक हैं। Landt et ^al.20 द्वारा निर्धारित सिफारिशों के अनुसार सभी नमूने स्वीकार्य FRiP थ्रेसहोल्ड (>1%) दिखाते हैं। संक्षेप: FRiP = एक चोटी के भीतर पढ़ने का अंश; CUT&RUN = लक्ष्य के तहत दरार और न्यूक्लिएज का उपयोग करके रिलीज। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: उपयोग किए गए सभी बफ़र्स और समाधानों के लिए व्यंजनों। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 2: डेटा विश्लेषण पाइपलाइन के लिए आवश्यक जैव सूचना विज्ञान उपकरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 3: अनुशंसित ब्लॉकलिस्टेड क्षेत्रों में सी एल्बिकन्स जीनोम। ब्लॉकलिस्टेड लोकी की इस सूची में मुख्य रूप से अत्यधिक दोहराए जाने वाले अनुक्रम तत्व और क्षेत्र जैसे टेलोमेरिक दोहराव और सेंट्रोमियर शामिल हैं जिन्होंने ऐतिहासिक रूप से पिछले जीनोम-वाइड बाइंडिंग प्रयोगों में झूठे-सकारात्मक परिणाम दिए हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

यह प्रोटोकॉल सी अल्बिकन्स में नियामक टीएफ के जीनोम-वाइड स्थानीयकरण के लिए एक व्यापक प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन प्रस्तुत करता है। यह मानक माइक्रोबायोलॉजी और आणविक जीव विज्ञान प्रशिक्षण के साथ किसी के लिए भी अत्यधिक सुलभ होने के लिए डिज़ाइन किया गया है। CUT&RUN परख की उच्च गतिशील रेंज और कम नमूना इनपुट आवश्यकताओं का लाभ उठाकर और सी अल्बिकन्स बायोफिल्म और प्लवक संस्कृतियों में टीएफ-डीएनए बाध्यकारी इंटरैक्शन के स्थानीयकरण के लिए अनुकूलन सहित, यह प्रोटोकॉल पारंपरिक CHIP-seq दृष्टिकोण के लिए एक शक्तिशाली और कम लागत वाला विकल्प प्रस्तुत करता है। CHIP-seq की तुलना में, CUT &RUN काफी अधिक संवेदनशीलता पैदा करता है, जिसमें अनुक्रमण का एक उच्च अनुपात बाध्य चोटियों के लिए मैप किया गया है, उच्च-थ्रूपुट के लिए अधिक अनुकूल है, काफी कम इनपुट सेल संख्या की आवश्यकता होती है, विषाक्त क्रॉसलिंकिंग एजेंटों के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है, और उच्च गुणवत्ता वाले परिणामों का उत्पादन करने के लिए प्रति नमूना दस गुना कम अनुक्रमण पढ़ने की आवश्यकता होती है ^{13,14,17, 23,24}. इस प्रोटोकॉल की प्रति-नमूना लागत को और कम करने के लिए, बफर और मीडिया व्यंजनों को सभी आवश्यक बफर और मीडिया की इन-हाउस तैयारी के साथ-साथ आवश्यक अभिकर्मकों की थोक सोर्सिंग की सुविधा के लिए एक विस्तृत अभिकर्मक सूची के साथ शामिल किया गया है। सी अल्बिकन्स बायोफिल्म गठन, फेनोटाइपिक स्विचिंग, और कॉमेन्सलिज्म के रूप में सभी जटिल अंतर्निहित ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क²⁶ द्वारा विनियमित होते हैं, यह मजबूत, सरल, और लागत प्रभावी कट एंड रन प्रोटोकॉल इस महत्वपूर्ण मानव कवक रोगज़नक़ में इन और कई अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक शक्तिशाली नया उपकरण प्रदान करता है।

टीएफ हिस्टोन या अन्य क्रोमैटिन से जुड़े प्रोटीन के रूप में प्रचुर मात्रा में नहीं हैं, जो कट एंड रन के माध्यम से टीएफ-डीएनए बाध्यकारी इंटरैक्शन की जांच के लिए एक अनूठी चुनौती पैदा करते हैं। इस चुनौती को संबोधित करने के लिए, मानक CUT&RUN प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल¹³ के लिए महत्वपूर्ण समायोजन और अनुकूलन किए गए थे। चूंकि टीएफ को लक्षित करने वाले सबसे सफल कट एंड रन प्रयोगों में डीएनए की एक छोटी मात्रा उत्पन्न होती है जो मात्रा निर्धारित करने के लिए बहुत पतला होती है और अक्सर 150 बीपी^13,23 से छोटे टुकड़ों के लिए समृद्ध होती है, पुस्तकालय तैयारी प्रतिक्रिया की स्थिति को भी इन छोटे टुकड़ों^के पक्ष में अनुकूलित किया गया था। यहां तक कि इस अनुकूलन चरण के साथ, परिणामी पीसीआर-प्रवर्धित पुस्तकालयों में एडाप्टर डिमर का एक महत्वपूर्ण अनुपात होता है, जो चुंबकीय मनका-आधारित डीएनए आकार चयन विधियों का उपयोग करके पूरी तरह से हटाया नहीं जाता है। इस समस्या को हल करने के लिए, एक पृष्ठ जेल आकार-चयन चरण को अंतिम अनुक्रमण-तैयार लायब्रेरीज़ जनरेट करने के लिए शामिल किया गया था जो काफी हद तक एडाप्टर डिमर्स से रहित हैं। यह प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि छोटे टीएफ-व्युत्पन्न कट एंड रन टुकड़ों को बनाए रखते हुए एडाप्टर डिमर को हटाना उच्च गुणवत्ता वाले परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।

इसके अलावा, विस्तृत कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन अनुक्रमण डेटा को फ़िल्टर करती है ताकि कट एंड रन परख में टीएफ-डीएनए बाइंडिंग इंटरैक्शन से व्युत्पन्न छोटे रीड्स पर ध्यान केंद्रित किया जा सके। इन टीएफ-विशिष्ट समायोजन के कारण, इस प्रोटोकॉल को न्यूक्लियोसोम जैसे बड़े क्रोमैटिन-संबद्ध परिसरों को प्रोफाइल करने के लिए अनुशंसित नहीं किया जाता है। हालांकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लाइब्रेरी प्रेप किट के साथ शामिल मानक लाइब्रेरी तैयारी प्रोटोकॉल का पालन करके इस उद्देश्य के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करना सैद्धांतिक रूप से संभव है, उपयोगकर्ता को कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन में शामिल पोस्ट अनुक्रमण आकार चयन को समायोजित करने की आवश्यकता होगी। विशेष रूप से, कोड फ़ाइल cut_n_run_pipeline.sh में आकार-फ़िल्टरिंग अनुभाग में, उपयोगकर्ताओं को "14400" (120 bp * 120 bp) के वर्तमान मान को वांछित टुकड़ा लंबाई के वर्ग के साथ प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता होगी ताकि विश्लेषण पाइपलाइन को अन्य प्रकार के क्रोमैटिन-डीएनए बाइंडिंग इंटरैक्शन के लिए उत्पन्न अनुक्रमण परिणामों का विश्लेषण करने में सक्षम बनाया जा सके।

एक सफल CUT &RUN प्रयोग में एक और महत्वपूर्ण कदम इष्टतम पोस्ट अनुक्रमण डेटा विश्लेषण पैरामीटर का चयन शामिल है। जबकि अधिकांश कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन को मानकीकृत करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और सी अल्बिकन्स में ब्याज के किसी भी नियामक टीएफ के अध्ययन के लिए लागू होता है, दो महत्वपूर्ण विचार हैं जो उपयोगकर्ता को पाइपलाइन चलाते समय मूल्यांकन करना चाहिए। पहला विचार यह है कि क्या बाउंड लक्ष्य साइटों की पहचान से पहले अनुक्रमण डेटा से डुप्लिकेट रीड्स को शामिल करना या निकालना है या नहीं। चूंकि कम-बहुतायत वाले टीएफ आमतौर पर अनुक्रमण डेटा प्राप्त करेंगे, जिसमें पुस्तकालय प्रवर्धन चरण के दौरान पीसीआर डुप्लिकेशन से व्युत्पन्न होने वाले रीड्स का एक महत्वपूर्ण प्रतिशत होता है, पीसीआर डुप्लिकेट को हटाने से परिणामों पर काफी नकारात्मक प्रभाव पड़ सकता है। हालांकि, अत्यधिक प्रचुर मात्रा में टीएफ या क्रोमैटिन से जुड़े प्रोटीन के साथ, पीसीआर डुप्लिकेट आमतौर पर पढ़ने की कुल संख्या के एक छोटे से हिस्से का प्रतिनिधित्व करते हैं और अक्सर डेटा में पृष्ठभूमि शोर को दबाने के लिए हटा दिए जाते हैं। आखिरकार, पीसीआर डुप्लिकेट रखने या हटाने का यह निर्णय ब्याज के टीएफ और प्राप्त अनुक्रमण डेटा की गहराई पर निर्भर करता है। इस प्रकार, पाइपलाइन स्वचालित रूप से पीसीआर डुप्लिकेट रीड्स के साथ या बिना व्युत्पन्न डेटा के लिए स्वतंत्र आउटपुट फ़ाइलें उत्पन्न करती है, इसलिए उपयोगकर्ता यह तय कर सकता है कि कौन सी आउटपुट फ़ाइलें प्रत्येक प्रयोग के लिए सर्वोत्तम परिणाम देती हैं।

दूसरा विचार यह है कि क्या समस्याग्रस्त लोकी की पहचान करना और हटाना है जो प्रयोगात्मक (ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी) और नकारात्मक नियंत्रण (आईजीजी) नमूनों दोनों में महत्वपूर्ण, अभी तक अत्यधिक परिवर्तनशील, संवर्धन पैदा करता है। पीक-कॉलिंग एल्गोरिथ्म प्रयोगात्मक और नियंत्रण दोनों नमूनों में काफी समृद्ध लोकी की पहचान करने के लिए MACS2 का उपयोग करता है और उन दोनों में दिखाई देने वाले लोगों को बाहर करता है। हालांकि यह दृष्टिकोण आमतौर पर सबसे अधिक समस्याग्रस्त लोकी को समाप्त करता है, कुछ कभी-कभी कुछ प्रयोगों में महत्वपूर्ण चोटियों के रूप में दिखाई देते हैं, भले ही पूर्व अनुभव इंगित करता है कि वे टीएफ संवर्धन की सच्ची सकारात्मक साइटों होने की संभावना नहीं रखते हैं। इस प्रकार, इन समस्याग्रस्त लोकी को हटाने के लिए एक वैकल्पिक फ़िल्टरिंग चरण प्रदान किया जाता है, जिसे "ब्लॉकलिस्टेड" लोकी के रूप में संदर्भित किया जाता है। ब्लॉकलिस्टेड लोकी की सूची में मुख्य रूप से अत्यधिक दोहराए जाने वाले अनुक्रम तत्व और क्षेत्र जैसे टेलोमेरिक दोहराव और सेंट्रोमियर शामिल हैं जिन्होंने ऐतिहासिक रूप से पिछले जीनोम-वाइड बाइंडिंग एसेस में झूठे-सकारात्मक परिणाम दिए हैं। यह लोकी की एक बहुत ही रूढ़िवादी सूची है जिसे उच्च आत्मविश्वास के साथ समस्याग्रस्त के रूप में सौंपा गया है। हालांकि, प्रत्येक उपयोगकर्ता को मूल्यांकन करना चाहिए कि क्या यह फ़िल्टर केस-दर-केस आधार पर उनके प्रयोग (ओं) के लिए उपयुक्त है। IgG नकारात्मक नियंत्रण के लिए एक संभावित विकल्प एक परमाणु-स्थानीयकृत प्रोटीन के खिलाफ CUT & RUN प्रदर्शन करना होगा जो डीएनए को बांधता नहीं है। इस दृष्टिकोण को CHIP प्रयोगों²⁸ के लिए एक आदर्श नियंत्रण के रूप में दिखाया गया है, और एक समान दृष्टिकोण CUT & RUN के लिए विचार करने योग्य है।

CUT &RUN उच्च यूकेरियोट्स और मॉडल खमीर Saccharomyces cerevisiae में प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की जांच के लिए एक लोकप्रिय विकल्प बन गया है। यहां, इसे नैदानिक रूप से प्रासंगिक कवक रोगज़नक़ सी अल्बिकन्स में जीनोम-वाइड टीएफ-डीएनए बाइंडिंग इंटरैक्शन की जांच करने के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया है। यह प्रोटोकॉल सभी आवश्यक प्रयोगात्मक और कम्प्यूटेशनल प्रक्रियाओं के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करता है, उपभेदों की इंजीनियरिंग से जो एपिटोप-टैग किए गए टीएफ को व्यक्त करते हैं, परिणामी CUT & RUN अनुक्रमण डेटा के कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के माध्यम से। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल और साथ में डेटा विश्लेषण पाइपलाइन मजबूत टीएफ-डीएनए बाइंडिंग प्रोफाइल का उत्पादन करती है, भले ही कम-बहुतायत वाले बायोफिल्म नमूनों से अलग कोशिकाओं की जटिल मल्टीमॉर्फिक आबादी का उपयोग करते समय और CHIP-seq पद्धतियों की तुलना में कम समग्र लागत पर बेहतर डेटा गुणवत्ता प्रदान करता है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore Sigma	SLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubes	VWR	490003-190
1 M CaCl2	Fisher Scientific	50-152-341
1 M PIPES	Fisher Scientific	AAJ61224AK
12-well untreated cell culture plates	Corning	351143
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	60-24-2
2% Digitonin	Fisher Scientific	CHR103MI
50 mL conical tubes	VWR	89039-658
5x phusion HF buffer	Fisher Scientific	F530S	Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
Agar	Criterion	C5001
Agencourt AMPure XP magnetic beads	Beckman Coulter	A63880
Agilent Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific	VWR	89133-910
Bacto peptone	BD Biosciences	211677
Benchling primer design tool	Benchling		https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
Betaine	Fisher Scientific	AAJ77507AB
Calcofluor white stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
Candida Genome Database			http://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads	Polysciences	86057-3
Conda software			https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit	Epicypher	14-1048	Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)	New England Biolabs	N0447S
Dextrose (D-glucose)	Fisher Scientific	D163
Difco D-mannitol	BD Biosciences	217020
Disposable cuvettes	Fisher Scientific	14-955-127
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x)	Fisher Scientific	R0611
DreamTaq green DNA polymerase	Fisher Scientific	EP0713	Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase buffer	Fisher Scientific	EP0713	Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNA	Epicypher	18-1401
ELMI Microplate incubator	ELMI	TRMS-04	Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction Buffer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proof	VWR	89125-170
FastDigest MssI	Fisher Scientific	FD1344	Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI Buffer	Fisher Scientific	FD1344	Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400	Fisher BioReagents	BP525-25
Fluorescence microscope			User-dependent
Gel electrophoresis apparatus			User-dependent
GeneRuler low range DNA ladder	Fisher Scientific	FERSM1192
GitBash workflow			https://gitforwindows.org/
GitHub source code			https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5	Boston BioProducts	BBH-75-K
High-speed centrifuge			User-dependent
Isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1830-4
Lens paper	VWR	52846-001
Ligation Enhancer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrate	MP Biomedicals	215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody	Takara	632592	User-dependent
MACS2			https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes	Epicypher	10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes	Fisher Scientific	MR02
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometer	BioTek	EPOCH2TC	Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiView			http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
NaCl	VWR	470302-522
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
NCBI GEO			https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)	New England Biolabs	E7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit	New England Biolabs	E7645S	Referred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT)	Goldbio	N-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 well	Fisher Scientific	EC62755BOX
Nutating mixer	VWR	82007-202
Nutrient broth	Criterion	C6471
pADH110	Addgene	90982	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119	Addgene	90985	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137	Addgene	90986	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139	Addgene	90987	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140	Addgene	90988	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNase	Epicypher	15-1016 or 15-1116	50 rxn or 250 rxn
pCE1	Addgene	174434	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lid	Fisher Scientific	FB0875712
Phusion high fidelity DNA polymerase	Fisher Scientific	F530S	Referred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350	VWR	10791-816
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q33230
Qubit fluorometer	Life Technologies	Q33216	Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibody	Epicypher	13-0042
RNase A	Sigma-Aldrich	10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets	Sigma-Aldrich	5056489001
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R6504
Shaking incubator	Eppendorf	M12820004	User-dependent
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G
Spin-X centrifuge tube filters	Fisher Scientific	07-200-385
Sterile inoculating loops	VWR	30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Fisher Scientific	S11494
SYTO 13 nucleic acid stain	Fisher Scientific	S7575	Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
Thermocycler			User-dependent
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethane	Sigma-Aldrich	252859-100G
Ultra II Ligation Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solution	Invitrogen	15632011
USER Enzyme			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixer	VWR	10153-834
wget tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
Yeast extract	Criterion	C7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)	Fisher Scientific	NC0439194