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Biology

Genomweite Profilierung von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen in Candida albicans: Eine umfassende CUT&RUN-Methode und Datenanalyse-Workflow

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63655
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2,4, 3, 1,4, 1,4
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Department of Applied Mathematics, University of California, Merced, 4Health Sciences Research Institute, University of California, Merced
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine experimentelle Methode und einen Datenanalyse-Workflow für die Spaltung unter Targets und die Freisetzung mittels Nuklease (CUT&RUN) im humanen Pilzpathogen Candida albicans.

Abstract

Regulatorische Transkriptionsfaktoren steuern viele wichtige biologische Prozesse, einschließlich der zellulären Differenzierung, der Reaktionen auf Umweltstörungen und -belastungen sowie der Wechselwirkungen zwischen Wirt und Krankheitserreger. Die Bestimmung der genomweiten Bindung von regulatorischen Transkriptionsfaktoren an die DNA ist essentiell, um die Funktion von Transkriptionsfaktoren in diesen oft komplexen biologischen Prozessen zu verstehen. Spaltung unter Targets und Freisetzung mittels Nuklease (CUT&RUN) ist eine moderne Methode zur genomweiten Kartierung von In-vivo-Protein-DNA-Bindungsinteraktionen, die eine attraktive Alternative zur traditionellen und weit verbreiteten Chromatin-Immunpräzipitationsmethode mit anschließender Sequenzierung (ChIP-seq) darstellt. CUT&RUN ist für einen experimentellen Aufbau mit höherem Durchsatz geeignet und hat einen wesentlich höheren Dynamikbereich mit niedrigeren Sequenzierungskosten pro Probe als ChIP-seq. Hier werden ein umfassendes CUT&RUN-Protokoll und ein begleitender Datenanalyse-Workflow beschrieben, der auf die genomweite Analyse von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen im menschlichen Pilzpathogen Candida albicans zugeschnitten ist. Dieses detaillierte Protokoll umfasst alle notwendigen experimentellen Verfahren, vom Epitop-Tagging von Transkriptionsfaktor-kodierenden Genen bis zur Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung; Darüber hinaus enthält es einen angepassten Berechnungsworkflow für die CUT&RUN-Datenanalyse.

Introduction

Candida albicans ist ein klinisch relevanter, polymorpher humaner Pilzpathogen, der in einer Vielzahl von verschiedenen Wachstumsmodi vorkommt, wie der planktonischen (frei schwebenden) Wachstumsweise und als Gemeinschaften eng haftender Zellen, die durch eine extrazelluläre Matrix geschützt sind, die als Biofilm-Wachstumsmodus 1,2,3 bekannt ist. Ähnlich wie bei anderen Entwicklungs- und zellulären Prozessen ist die Biofilmentwicklung ein wichtiges Virulenzmerkmal von C. albicans, von dem bekannt ist, dass es auf transkriptioneller Ebene durch regulatorische Transkriptionsfaktoren (TFs) gesteuert wird, die sequenzspezifisch an DNA binden4. In jüngster Zeit haben sich auch Chromatinregulatoren und Histonmodifikatoren als wichtige Regulatoren der Biofilmbildung5 von C. albicans und der Morphogenese6 herausgestellt, indem sie die DNA-Zugänglichkeit vermitteln. Um die komplexe Biologie dieses wichtigen Pilzpathogens zu verstehen, sind effektive Methoden zur Bestimmung der genomweiten Lokalisation spezifischer TFs während verschiedener Entwicklungs- und zellulärer Prozesse wertvoll.

Die Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender Sequenzierung (ChIP-seq) ist eine weit verbreitete Methode zur Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen in C. albicans5,6 und hat die klassischere Chromatin-Immunpräzipitation, gefolgt von der Microarray-Methode (ChIP-Chip)9, weitgehend ersetzt. Sowohl die ChIP-seq- als auch die ChIP-Chip-Methode erfordern jedoch eine große Anzahl von Inputzellen10, was bei der Untersuchung von TFs im Zusammenhang mit bestimmten Proben und Wachstumsweisen, wie Biofilmen von Patienten oder Tiermodellen der Infektion, ein komplizierender Faktor sein kann. Darüber hinaus liefert der Chromatin-Immunpräzipitations-Assay (ChIP) oft eine signifikante Menge an Hintergrundsignal im gesamten Genom, was ein hohes Maß an Anreicherung für das Ziel von Interesse erfordert, um Signal und Rauschen ausreichend zu trennen. Während der ChIP-Chip-Assay heute weitgehend veraltet ist, machen die für ChIP-seq erforderlichen Sequenzierungstiefen diesen Assay für viele Forscher unerschwinglich teuer, insbesondere für diejenigen, die mehrere TFs und / oder Chromatin-assoziierte Proteine untersuchen.

Spaltung unter Targets und Freisetzung mittels Nuklease (CUT&RUN) ist eine attraktive Alternative zu ChIP-seq. Es wurde 2017 vom Henikoff-Labor entwickelt, um die Einschränkungen der endogenen Spaltung von ChIP-seq und Chromatin zu umgehen, gefolgt von der Sequenzierung von ChEC-seq 11,12, einer weiteren Methode zur Identifizierung von Protein-DNA-Interaktionen auf genomweiter Ebene, während gleichzeitig eine hochauflösende, genomweite Kartierung von TFs und Chromatin-assoziierten Proteinen bereitgestelltwird 13 . CUT&RUN beruht auf der gezielten Verdauung von Chromatin in permeabilisierten Kernen unter Verwendung von angebundenen Mikrokokken-Nukleasen, gefolgt von der Sequenzierung der verdauten DNA-Fragmente 9,10. Da DNA-Fragmente spezifisch an den Loci erzeugt werden, die an ein interessantes Protein gebunden sind, anstatt wie bei ChIP-Assays im gesamten Genom durch zufällige Fragmentierung erzeugt zu werden, führt der CUT&RUN-Ansatz zu stark reduzierten Hintergrundsignalen und erfordert daher 1/10der Sequenzierungstiefe im Vergleich zu ChIP-seq11,13. 14. Diese Verbesserungen führen letztendlich zu einer deutlichen Reduzierung der Sequenzierungskosten und zu einer Verringerung der Gesamtzahl der Eingangszellen, die als Ausgangsmaterial für jede Probe benötigt werden.

Hier wird ein robustes CUT&RUN-Protokoll beschrieben, das für die Bestimmung der genomweiten Lokalisation von TFs in C. albicans-Zellen , die aus Biofilmen und planktonischen Kulturen isoliert wurden, angepasst und optimiert wurde. Darüber hinaus wird eine gründliche Datenanalyse-Pipeline vorgestellt, die die Verarbeitung und Analyse der resultierenden Sequenzdaten ermöglicht und den Benutzern nur minimale Kenntnisse in der Kodierung oder Bioinformatik erfordert. Kurz gesagt, beschreibt dieses Protokoll die Epitopmarkierung von TF-kodierenden Genen, die Ernte von Biofilm- und Planktonzellen, die Isolierung intakter permeabilisierter Kerne, die Inkubation mit primären Antikörpern gegen das spezifische Protein oder epitopmarkierte Protein von Interesse, die Anbindeglied der chimären A/G-Mikrokokken-Nuklease (pAG-MNase) Fusionsproteine an die primären Antikörper, die genomische DNA-Erholung nach der Chromatinverdauung und die Vorbereitung genomischer DNA-Bibliotheken für die Sequenzierung.

Auf das experimentelle CUT&RUN-Protokoll folgt eine speziell entwickelte Datenanalyse-Pipeline, die Roh-DNA-Sequenzierungslesevorgänge im FASTQ-Format durchführt und alle erforderlichen Verarbeitungsschritte implementiert, um eine vollständige Liste der signifikant angereicherten Loci zu erhalten, die durch die TF von Interesse gebunden sind (gezielt durch den primären Antikörper). Beachten Sie, dass mehrere Schritte des beschriebenen Bibliotheksvorbereitungsprotokolls speziell für die CUT&RUN-Analyse von TFs (im Gegensatz zu Nukleosomen) angepasst und optimiert wurden. Während die in diesem Manuskript präsentierten Daten mit TF-spezifischen Anpassungen eines kommerziellen CUT&RUN-Kits generiert wurden, wurden diese Protokolle auch mit einzeln beschafften Komponenten (d. H. pAG-MNase-Enzym und magnetischen DNA-Aufreinigungsperlen) und intern hergestellten Puffern validiert, was die experimentellen Kosten erheblich senken kann. Die umfassenden Experimental- und Datenanalyseprotokolle werden im Folgenden in einem Schritt-für-Schritt-Format detailliert beschrieben. Alle Reagenzien und kritischen Geräte sowie Puffer- und Medienrezepte sind in der Materialtabelle bzw. in der Ergänzungsdatei 1 aufgeführt.

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Protocol

1. Epitop-Markierung von C. albicans-Stämmen

  1. Laden Sie das interessierende Gen zusammen mit seinen 1 kb vor- und nachgeschalteten flankierenden Sequenzen aus der Candida-Genomdatenbank in das Primer-Design-Tool hoch (siehe Materialtabelle). Entwerfen Sie eine Leit-RNA (gRNA), indem Sie 50 bp vor und nach dem Stopp-Codon markieren und rechts auf das gRNA-Auswahlwerkzeug klicken. Wählen Sie Hilfslinien entwerfen und analysieren aus. Verwenden Sie das Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploid)) Genom und ein NGG (SpCas9, 3' side) Protospacer Adjacent Motif (PAM) für die Führungsparameter und klicken Sie auf Fertig stellen. Abbildung 1 beschreibt den Workflow für die Epitopmarkierung eines C. albicans-Gens von Interesse mit Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP).
    1. Bestätigen Sie auf der folgenden Seite die Zielregion für das gRNA-Design und drücken Sie die grüne Taste. Sortieren Sie gRNAs nach dem On-Target-Score.
      HINWEIS: Das Primer-Design-Tool berechnet On-Target- und Off-Target-Scores, um die Spezifität der gRNAs zu quantifizieren. Ein idealer Guide hat einen On-Target-Score von >60, einen Off-Target-Score von ~33 und überschneidet sich mit dem Stop-Codon. Dies ermöglicht eine hohe gRNA-Spezifität bei gleichzeitiger Ablation des gRNA-Targetings nach der GFP-Integration. Eine gRNA mit einem Off-Target-Score von ~50 zeigt eine allelische Variation an; Somit wird nur ein Allel von der gRNA erkannt.
    2. Addieren Sie die Sequenzen (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') und (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') zu den 5'- bzw. 3'-Enden der 20 bp gRNA-Zielsequenz, wodurch ein 60 bp Primer/Oligonukleotid entsteht. Alternativ können Sie die 20-bp-Sequenz in den von Nguyen et al.15 bereitgestellten gRNA-Rechner kopieren. Bestellen Sie das 60 bp custom gRNA Oligonukleotid.
    3. Amplifizieren Sie das "universelle A-Fragment" mit 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCGGCCCCTTTTAAACCGCC-3') und 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') und das "einzigartige B-Fragment" mit dem benutzerdefinierten 60 bp gRNA-Oligonukleotid (100 mM) aus Schritt 1.1.2. und 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGTTTAAACACCG-3') unter Verwendung von pADH110 (Plasmid-Repository-ID# 90982) bzw. pADH139 (Plasmid-Repository-ID# 90987) als Template-DNA. Verwenden Sie die in Tabelle 1 angegebenen PCR-Reaktions- und Zyklusbedingungen.
      HINWEIS: pADH139 ist spezifisch für Sorten, die den heterologen Candida maltosa LEU2-Marker tragen. Wenn Sie einen Stamm mit einer einzigen Kopie des C. albicans LEU2-Gens verwenden, ersetzen Sie pADH119 (Plasmid-Repository-ID # 90985) anstelle von pADH139.
    4. Bestätigen Sie die erfolgreiche Amplifikation, indem Sie 5 μL der PCR auf einem 1% igen Agarosegel überprüfen. Suchen Sie nach ~1 kb A- und B-Fragment-Amplicons.
    5. Mischen Sie jeweils 1 μL der A- und B-Fragmente und fügen Sie sie unter Verwendung der in Tabelle 2 angegebenen PCR-Reaktions- und Zyklusbedingungen zusammen, um ein C-Fragment in voller Länge zu erhalten.
    6. Zu jeder PCR-Reaktion werden 0,5 μL 100 mM AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') und 0,5 μL 100 mM AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACCTTCGACAATCG-3') zugegeben, durch Pipettieren gut vermischt und die in Tabelle 3 aufgeführten Zyklusbedingungen erfüllt.
      HINWEIS: Wenn Sie pADH119 anstelle von pADH139 verwenden, ersetzen Sie AHO1238 (5'-TGTATTTTGTTTTAAAATTTTAGTGACTGTTTC-3') anstelle von AHO1453.
    7. Bestätigen Sie das richtige Nähen und Amplifizieren des C-Fragments, indem Sie 5 μL der PCR auf einem 1% igen Agarosegel überprüfen. Suchen Sie nach einem ~ 2 kb Amplicon. Lagern Sie das C-Fragment bei -20 °C, bis es einsatzbereit ist.
      HINWEIS: Wenn das Nähen und Verstärken zu mehreren, unspezifischen Bändern oder Verschmieren führt, führen Sie eine PCR-Bereinigung der A- und B-Fragmente durch und wiederholen Sie Schritt 1.1.5.
  2. Fügen Sie das gesamte CTG-optimierte monomere eGFP mit Linkersequenz (RIPLING)16 (pCE1, Plasmid-Repository-ID# 174434) unmittelbar vor dem Stop-Codon des interessierenden Gens mit dem Primer-Design-Tool hinzu, wodurch eine C-terminale translationale Fusion entsteht. Verwenden Sie dieses Konstrukt, um Oligonukleotide zur Amplifikation der Spender-DNA (dDNA) aus pCE1 zu entwerfen.
    1. Entwerfen Sie ein vorderes Oligonukleotid mit 18-22 bp Homologie zur Linkerfolge und >50 bp Homologie zum 3' Ende des offenen Leserahmens (ORF).
      HINWEIS: Die Homologie von 18-22 bp erzeugt eine Glühtemperatur für die Verstärkung zwischen 55 °C und 58 °C. Wenn das Oligonukleotid in voller Länge Primer-Dimere bildet, passen Sie die Homologie entsprechend an die Linkersequenz/GFP oder das Genom an.
    2. Erstellen Sie ein umgekehrtes Oligonukleotid mit 18-22 bp Homologie zum 3'-Ende von GFP und >50 bp Homologie zur nachgeschalteten nichtkodierenden Folge des zu markierenden ORF.
    3. Bestellen Sie diese Oligonukleotide und amplifizieren Sie die dDNA unter Verwendung der bereitgestellten Touchdown-PCR-Zyklusbedingungen in Tabelle 4.
  3. Entwerfen Sie zwei Sätze von Kolonie-PCR (cPCR) -Oligonukleotiden zur Bestätigung der Integration von GFP durch Verstärkung über die flankierenden Integrationsstandorte. Wählen Sie zunächst das vorwärts gerichtete dDNA-Oligonukleotid mit dem Primer-Design-Tool aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Primer auf der rechten Seite.
    1. Klicken Sie | auf Primer erstellen | des Assistenten Tm Param und bestätigen, dass der Algorithmus auf SantaLucia 1998 eingestellt ist. Klicken Sie auf Auswahl verwenden , um die Koordinaten des in 1.2.1 entworfenen Vorwärtsoligonukleotids als Zielsequenz einzugeben.
    2. Stellen Sie die optimale Primertemperatur auf 55 °C und die maximale Amplikongröße auf 900 bp ein und klicken Sie oben rechts auf die Schaltfläche Primer generieren .
    3. Wählen Sie das Oligonukleotid-Paar mit dem niedrigsten Strafwert aus und bestätigen Sie, dass die Primer über die 5'-Integrationsstelle verstärkt werden. Stellen Sie sicher, dass der Forward-cPCR-Primer vor der Forward-dDNA-Primer-Sequenz und der Reverse-cPCR-Primer vollständig innerhalb des eGFP-Tags oder der Linker-Sequenz liegt.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1.3-1.3.3. mit dem reversen dDNA-Oligonukleotid, um den zweiten Satz von cPCR-Oligonukleotiden zu erzeugen, die über die 3'-Integrationsstelle amplifizieren. Stellen Sie sicher, dass der Forward-cPCR-Primer vollständig innerhalb des eGFP-Tags oder der Linker-Sequenz und des Reverse-cPCR-Primers nach der reversen dDNA-Primer-Sequenz liegt.
    5. Bestellen Sie diese Oligonukleotide.
  4. Verdauen Sie 2.500 ng pADH140, das Cas9 (Plasmid-Repository-ID # 90988) enthält, mit Restriktionsenzym für jedes Gen, das GFP-markiert werden soll. Stellen Sie das Gesamtvolumen jeder Verdauung auf 15 μL ein; Passen Sie das Wasservolumen entsprechend der pADH140-Plasmidkonzentration an. Verwenden Sie die in Tabelle 5 angegebenen Aufschlussbedingungen. Lagern Sie das verdaute Plasmid bei -20 °C, bis es gebrauchsfertig ist.
    HINWEIS: Wenn Sie einen Stamm mit einer einzigen Kopie des C. albicans LEU2-Gens transformieren, ersetzen Sie anstelle des heterologen C. maltosa LEU2-Markers pADH137 (Plasmid-Repository-ID # 90986) anstelle von pADH140.
  5. Denaturieren Sie 12 μL 10 mg/ml Lachssperm-DNA für jedes Gen, das 10 Minuten lang bei 99 °C GFP-markiert wird und schnell auf ≤4 °C abkühlt. Bis zur Gebrauchsfertigkeit bei -20 °C lagern.
  6. Streichen Sie einen C. albicans LEU2 hemizygoten nourseothricin-empfindlichen Stamm auf Hefe-Pepton-Dextroseplatten (YPD) und inkubieren Sie zwei Tage lang bei 30 ° C.
  7. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und übertragen Sie sie auf 4 ml flüssiges YPD. 12-16 h bei 30 °C mit Schütteln bei 250 U/min inkubieren.
  8. Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) der Übernachtkultur (12-16 h) in einem Spektralphotometer mit einer Einwegküvette (1 ml, 1 cm Weglänge).
  9. Verdünnen Sie die Übernachtkultur in einen Erlenmeyerkolben auf eine OD600 von 0,1 in YPD. Berücksichtigen Sie 5 ml pro Reaktion und fügen Sie zusätzliche 5 ml hinzu, um den OD600 später zu überprüfen.
    HINWEIS: Das Volumen der Kultur hängt von der Anzahl der Transformationsreaktionen ab.
  10. Die verdünnte Übernachtkultur wird in einem Schüttelinkubator bei 30 °C mit Schütteln bei 250 U/min inkubiert, bis sie einen OD600 von 0,5-0,8 erreicht.
  11. Zentrifuge bei 4.000 × g bei Raumtemperatur für 5 min; Entfernen und verwerfen Sie den Überstand.
  12. Resuspendiert das Zellpellet in 1 ml sterilem Wasser durch schonendes Pipettenmischen mit Filterspitzen und in ein steriles 1,5 ml Mikrofugenröhrchen überführen.
  13. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 4.000 × g bei Raumtemperatur für 1 min; Entfernen und verwerfen Sie den Überstand. In 1 ml sterilem Wasser resuspendieren und für insgesamt zwei Wäschen wiederholen.
  14. Resuspendiert das Pellet in 1/100des in Schritt 1.10 verwendeten Volumens. Wenn beispielsweise 15 ml verwendet wurden, suspendieren Sie das Pellet in 150 μL sterilem Wasser.
  15. Mischen Sie in einem separaten Röhrchen für jede Transformationsreaktion 50 μL C-Fragment, 50 μL dDNA, 2.500 ng Restriktionsenzym-verdautes pADH140 und 10 μL denaturierte Lachssperma-DNA.
  16. 50 μL der Zellaufschlämmung aus Schritt 1.14 zugeben und durch Pipettieren mischen.
  17. Machen Sie einen Vorrat der Plattenmischung (Ergänzungsdatei 1) für n + 1-Umwandlungen.
  18. Fügen Sie 1 ml der Plattenmischung zu der Zelle / DNA-Mischung hinzu und mischen Sie durch 5-maliges Umkehren.
    HINWEIS: Klopfen Sie beim Umdrehen auf die Unterseite der Rohre, um die verbleibende Flüssigkeit zu entfernen.
  19. Die Mischung über Nacht (12-16 h) ohne Schütteln in einen Inkubator bei 30 °C geben.
  20. Hitzeschock der Zellen für 15 min bei 44 °C in einem Wasserbad.
  21. Die 1,5 ml Mikrofugenröhrchen bei 5.000 × g bei Raumtemperatur 2 min zentrifugieren.
  22. Entfernen Sie die PLATE-Mischung durch Vakuumaspiration mit sterilen Pipettenspitzen und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören.
  23. Resuspendiert das Zellpellet in 1 ml YPD, Pellet durch Zentrifugation bei 4.000 × g bei Raumtemperatur für 1 min und entfernt und verwirft den Überstand. Wiederholen Sie dies für eine zweite Wäsche, suspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml YPD und übertragen Sie die Suspension auf ein 10 ml Rundboden-Einwegkulturröhrchen, das zusätzliche 1 ml YPD (2 ml Endvolumen) enthält. Stellen Sie die Zellen bei 30 °C mit Schütteln bei 250 U/min für 5 h wieder her.
  24. Zentrifen Sie die Röhrchen bei 4.000 × g bei Raumtemperatur für 5 min; Entfernen und verwerfen Sie den Überstand.
  25. Resuspendiert das Zellpellet in 100 μL sterilem Wasser und Platte auf YPD, ergänzt mit 200 μg/ml Nourseothricin (NAT200). 2-3 Tage bei 30 °C inkubieren.
  26. Aliquot 100 μL von 20 mM NaOH in die Vertiefungen einer 96-Well-PCR-Platte, wobei jede Vertiefung einer einzelnen Kolonie entspricht, die auf den NAT200-Platten wuchs. Mit einem sterilen Zahnstocher oder einer Pipettenspitze pflücken Sie einzelne transformierte Kolonien, flicken sie auf eine neue NAT200-Platte und wirbeln die verbleibenden Zellen zu einem Brunnen mit 20 mM NaOH. Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Kolonien, um das Zelllysat zu erzeugen, das als DNA-Vorlage für die cPCR-Reaktion verwendet wird.
  27. Die PCR-Platte versiegeln und 10 min bei 99 °C in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel inkubieren.
  28. Richten Sie zwei cPCR-Reaktionen mit den in den Schritten 1.3-1.3.5 entworfenen Oligonukleotiden ein. Erhöhen Sie die Anzahl der Reaktionen nach Bedarf. Die PCR-Reaktion wird mit dem in Schritt 1.26 hergestellten Zelllysat nach zyklischen Bedingungen und PCR-Reaktionsgemischen aus Tabelle 6 durchgeführt. Lassen Sie 10-20 μL aus jeder Vertiefung auf einem 1% igen Agarosegel laufen. Suchen Sie nach Kolonien mit Amplifikation der beiden cPCR-Primer-Sets, die eine ordnungsgemäß integrierte GFP-dDNA anzeigen.
  29. Restreak-Kolonien, die GFP auf synthetischen vollständigen (SC) Medien ohne Leucin enthielten. Inkubieren Sie 2-3 Tage in einem 30 °C Inkubator. Wählen Sie einzelne Kolonien und patchen Sie sie auf YPD und YPD, ergänzt durch 400 μg / ml Nourseothricin (NAT400) -Platten. Identifizieren Sie Kolonien, die nach 24 h nicht auf NAT400-Platten wachsen, als solche, die die CRISPR-Komponenten erfolgreich verloren haben.
  30. Vergewissern Sie sich, dass das GFP-Tag beibehalten wird, indem Sie die Schritte 1.25-1.28 mit Zellen aus der YPD-Patchplatte wiederholen. Wenn die richtigen Banden vorhanden sind, impfen Sie in 4 ml YPD und wachsen Sie über Nacht (12-16 h), wie in Schritt 1.7 beschrieben.
  31. Mischen Sie die Übernachtkultur des neuen GFP-markierten Stammes mit filtersterilisiertem 50% Glycerin im Verhältnis 1:1 in einer sterilen Kryotube. Bei -80 °C lagern und bei Bedarf auf YPD-Platten neu streichen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die GFP-markierten Stämme zu validieren, indem die nukleare Lokalisierung der markierten TF mittels Fluoreszenzmikroskopie bestätigt und ein Wildtyp-Phänotyp in einem geeigneten phänotypischen Assay bestätigt wird.

2. Probenvorbereitung von Biofilmkulturen

  1. Streifen Sie C. albicans GFP-markierte Stämme auf YPD-Agarplatten und inkubieren Sie bei 30 °C für 2-3 Tage. Mit einer einzigen isolierten Kolonie aus der Agarplatte in 4 ml YPD-Flüssigmedium impfen. Bei 30 °C mit Schütteln über Nacht (12-16 h) inkubieren. Bestimmen Sie die OD600 der Übernachtungskultur(en).
    HINWEIS: Es wird empfohlen, drei biologische Replikate pro Probe für die CUT&RUN-Experimente zu verwenden.
  2. Beimpfen Sie eine sterile unbehandelte Zellkulturplatte mit 12 Well mit der Nachtkultur auf ein endgültiges OD600 von 0,5 (entspricht 2 × 107 Zellen/ml) im Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium bis zu einem Endvolumen von 2 ml. Inkubieren Sie 90 min bei 37 °C in einem Mikroplatten-Inkubator mit Schütteln bei 250 U/min.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, eine 12-Well-Zellkulturplatte pro Stamm mit einer nicht geimpften Well-Zellkulturplatte als mittlere Kontaminationskontrolle zu verwenden. Dieses Protokoll wurde erfolgreich mit nur 1/10eines 12-Well-Zellkulturplatten-Wells (oder nur 5 Millionen Zellen) angewendet. Die Verwendung einer höheren Anzahl von Zellen erhöht die Gesamt-DNA-Ausbeute, was typischerweise zu qualitativ hochwertigen Sequenzierungsbibliotheken führt.
  3. Entfernen Sie nicht anhaftende Zellen durch Absaugen mit sterilen Pipettenspitzen, die über flexible Kunststoffschläuche an einer Vakuumfallenvorrichtung befestigt sind. Waschen Sie die anhaftenden Zellen einmal mit 2 ml steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Geben Sie 2 ml frisches RPMI-1640 Medium zu den Bohrlöchern und inkubieren Sie für 24 h bei 37 °C mit Schütteln bei 250 U / min.
    HINWEIS: Wechseln Sie die Pipettenspitzen zwischen Vertiefungen verschiedener Dehnungen und/oder Bedingungen. Kratzen Sie den Boden des Brunnens nicht mit der Spitze ab, während Sie absaugen.
  4. Am Ende der 24-stündigen Inkubation sammeln und sammeln und sammeln Sie das flüssige und Biofilmmaterial aus jeder der 11 geimpften Vertiefungen in einem einzigen, sterilen 50 ml konischen Röhrchen. Wiederholen Sie dies bei Bedarf mit unabhängigen Pools, wenn Sie mehr als einen Stamm oder eine Wachstumsbedingung gleichzeitig verarbeiten.
    HINWEIS: Kratzen Sie die Unterseiten und Kanten jedes Bohrlochs mit einer Pipettenfilterspitze, um Zellen zu entfernen, die an der Oberfläche haften bleiben. Verwenden Sie die Pipette, um die Biofilme zu homogenisieren.
  5. Pelletproben durch Zentrifugieren bei 4.000 × g bei Raumtemperatur für 5 min. Dekantieren Sie so viel wie möglich vom Überstand und achten Sie darauf, die Unterbrechung des Pellets zu minimieren. Das Pellet in flüssigem Stickstoff einfrieren und sofort nach der Sammlung bei -80 °C lagern oder direkt mit Schritt 4 (Isolierung der Kerne) fortfahren.

3. Probenvorbereitung von Planktonkulturen

  1. Streifen Sie C. albicans GFP-markierte Stämme auf YPD-Agarplatten und inkubieren Sie bei 30 °C für 2-3 Tage. Mit einer einzigen isolierten Kolonie aus der Agarplatte in 4 ml YPD-Flüssigmedium impfen. Bei 30 °C mit Schütteln über Nacht (12-16 h) inkubieren. Bestimmen Sie die OD600 der Übernachtungskultur(en).
  2. Übernachtkulturen auf OD 600 von 0,1 in 50 ml flüssigem Medium RPMI-1640 zurückverdünnen und bei 30 °C mit Schütteln bei 225 U/min für 2-5 h inkubieren, bis OD600 zwischen 0,5 und0,8 liegt.
    HINWEIS: Zellen sollten mindestens zwei Verdopplungen durchlaufen, bevor sie geerntet werden. Die Bedingungen für planktonische Kulturen können bei Bedarf angepasst werden.
  3. Pelletieren Sie die Proben durch Zentrifugieren bei 4.000 × g bei Raumtemperatur für 5 min. Dekantieren Sie so viel wie möglich vom Überstand und achten Sie darauf, die Unterbrechung des Pellets zu minimieren. Das Pellet in flüssigem Stickstoff einfrieren und sofort nach der Sammlung bei -80 °C lagern oder direkt mit Schritt 4 (Isolierung der Kerne) fortfahren.

4. Isolierung von Kernen

HINWEIS: Bereiten Sie am Tag des Experiments frischen Ficoll-Puffer vor, fügen Sie 2-Mercaptoethanol und Protease-Inhibitor zu Aliquot(s) des Resuspension Buffers hinzu und fügen Sie Proteaseinhibitor zu Aliquot(s) des SPC-Puffers hinzu (siehe Zusatzdatei 1). Um die Pellets zu resuspendieren, pipettieren Sie vorsichtig entweder 200 μL oder 1 ml Pipettenspitzen, um eine Beschädigung der Zellen oder Kerne zu vermeiden. Bevor Sie mit der Zellisolierung beginnen, schalten Sie den Wärmeblock ein, um ihn auf 30 ° C vorzuwärmen. Alle Pipettenspitzen und -röhrchen für den Rest dieses Protokolls sollten DNA/RNA- und DNase/RNase-frei zertifiziert sein, und die Verwendung von Filterspitzen wird für alle nachfolgenden Pipettierschritte empfohlen.

  1. Resuspendierte Pellets in 1 ml Resuspension Buffer bei Raumtemperatur und Transfer in ein steriles 1,5 ml-Mikrofugenröhrchen. Pellet bei 2.000 × g bei Raumtemperatur für 2 min in einer Tischzentrifuge und entfernen Sie den Überstand.
    HINWEIS: Entfernen Sie den Überstand entweder mit einer Pipettenspitze von 200 μL oder 1 ml und achten Sie darauf, die Unterbrechung der Pellets zu minimieren.
  2. Resuspendieren Sie das/die Pellet(s) in 200 μL Resuspension Buffer bei Raumtemperatur. Aus dem resuspendierten Pellet ein 5 μL Aliquot in ein neues PCR-Röhrchen geben und bei 4 °C lagern, um es später zu verwenden.
    HINWEIS: Dieses Aliquot wird als Kontrolle während eines nachfolgenden Qualitätskontrollschritts verwendet, um die Qualität der isolierten Kerne zu bewerten.
  3. Pellet bei 2.000 × g für 2 min und entfernen und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal mit 200 μL Resuspension Buffer.
  4. Bei 2.000 × g bei Raumtemperatur 2 min zentrifugieren und den Überstand entfernen. Zugabe von 300 μL Respensionspuffer und 10 μL Lyticaselösung (50 mg/ml, siehe Materialtabelle). 30 min bei 30 °C in einem Heizblock inkubieren.
    HINWEIS: Alternativ kann anstelle eines Wärmeblocks auch ein auf 30 °C beheiztes Wasserbad verwendet werden. Die hier verwendeten Sphäroplastikbedingungen wurden optimiert, um sowohl für Hefe- als auch für Hyphenzellen von C. albicans wirksam zu sein. Es wird empfohlen, die Sphäroplastikbedingungen zu optimieren, wenn dieses Protokoll auf C. albicans-Zellen mit Mutationen angewendet wird, die die Integrität der Zellwand oder andere zelluläre Morphologien beeinflussen. Während dieses 30-minütigen Inkubationsschritts hat der Benutzer die Möglichkeit, Schritt 5 (Concanavalin A Bead Activation) im Voraus abzuschließen, um Zeit zu sparen.
    1. KRITISCHER SCHRITT: Nach dem 30-minütigen Inkubationsschritt wird ein 5-μL-Aliquot in eine neue PCR-Röhre übertragen. Zu den 5 μL isolierten Kernen und dem 5 μL Aliquot intakter Zellen, die bei 4 °C aus Schritt 4.2 gelagert werden, werden 1 μL Calcofluorweiß (ein fluoreszierender Zellwandfarbstoff) und 1 μL SYTO 13 (eine Nukleinsäurefärbung) zugegeben. 30 min bei 30 °C im Dunkeln inkubieren.
    2. Untersuchen Sie die Integrität und Reinheit der isolierten Kerne visuell mit einem Fluoreszenzmikroskop. Suchen Sie nach isolierten Kernen, die deutlich gefärbte intakte Kerne zeigen (mit einem 488-509 nm Anregungsfilter) und stellen Sie sicher, dass es keine Zellwandfärbung durch den kalcofluorweißen Farbstoff gibt (mit einem 390-420 nm Anregungsfilter). Suchen Sie in den intakten Kontrollzellen nach prominenter Zellwandfärbung durch den kalcofluorweißen Farbstoff (mit einem 390-420 nm Anregungsfilter) und nach intakten Kernen (mit einem 488-509 nm Anregungsfilter).
  5. Bei 2.000 × g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendiert das Pellet in 500 μL eiskaltem Resuspension Buffer mit 1 ml Filterspitzen, indem man 5 Mal vorsichtig auf und ab pipettiert. Bei 2.000 × g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren und den Überstand mit einer 1 ml Pipette entfernen. Resuspendiert das Pellet mit 1 ml frisch hergestelltem eiskaltem Ficoll Buffer.
    HINWEIS: Bewahren Sie die Proben und Puffer ab diesem Zeitpunkt auf Eis auf.
  6. Die Proben zentrifugieren Sie bei 5.000 × g bei 4 °C für 10 min und entfernen Sie den Überstand. Resuspendiert das Pellet in 500 μL eiskaltem SPC-Puffer.
    HINWEIS: Behandeln Sie die Kerne ab diesem Zeitpunkt äußerst vorsichtig, um sie nicht zu beschädigen.
  7. Zentrifugieren Sie die Proben bei 5.000 × g bei 4 °C für 10 min und entfernen Sie so viel wie möglich vom Überstand, ohne das Pellet zu stören. Legen Sie die Röhrchen mit den pelletierten Kernen auf Eis und fahren Sie mit Schritt 5 fort. Wenn Schritt 5 in Schritt 4.4 bereits vorzeitig abgeschlossen wurde, fahren Sie mit Schritt 6 fort oder frieren Sie die Pellets in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie unmittelbar nach der Sammlung bei -80 °C.

5. Aktivierung der Concanavalin A-Perle

HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt. Ab diesem Zeitpunkt haben Anwender die Möglichkeit, mit einem handelsüblichen CUT&RUN-Kit oder einzelnen Source-Key-Komponenten mit dem Protokoll fortzufahren und Puffer im eigenen Haus vorzubereiten. Wenn Sie das kommerzielle Kit verwenden, sind alle unten verwendeten Puffer und Reagenzien im Kit enthalten, sofern nicht anders angegeben. Individuelle Katalognummern für die eigenständige Beschaffung von Reagenzien finden Sie auch in der Materialtabelle. Kühlen Sie alle Puffer vor Gebrauch auf Eis. Sobald Schritt 5 abgeschlossen ist, wird empfohlen, sofort mit Schritt 6 fortzufahren. Vermeiden Sie das mehrfache Auftauen isolierter Kerne, da bekannt ist, dass es die DNA-Schäden erhöht und zu Ergebnissen von schlechter Qualität führen kann.

  1. Suspendieren Sie die Concanavalin A (ConA) -Perlen vorsichtig mit einer Pipette. Übertragen Sie 22 μL ConA-Perlensuspension pro Probe, die in einem einzigen 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen verarbeitet werden soll. Legen Sie das Rohr auf ein Magnetgestell, bis die Perlenaufschlämmung klar ist. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette.
    HINWEIS: Wenn Sie beispielsweise CUT&RUN für insgesamt 10 Proben durchführen, übertragen Sie 220 μL der ConA-Perlensuspension auf ein 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen.
  2. Entfernen Sie das Röhrchen mit den ConA-Perlen aus dem Magnetgestell und fügen Sie sofort 200 μL eiskalten Perlenaktivierungspuffer hinzu und mischen Sie vorsichtig mit einer Pipette. Legen Sie das Rohr auf das Magnetgestell, bis die Perlenaufschlämmung klar ist. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Wäschen.
  3. Resuspendieren Sie die Perlen in 22 μL eiskaltem Perlenaktivierungspuffer pro zu verarbeitender Kernprobe. Bewahren Sie die Perlen auf Eis auf, bis sie benötigt werden.
    HINWEIS: Der Durchsatz der nachfolgenden Schritte ist abhängig von der Anzahl und Kapazität der verfügbaren Magnetröhrenracks. Die Verarbeitung von 32 Proben in zwei 16-Well-Röhrenracks ist für die meisten Benutzer dieses Protokolls eine überschaubare Zahl. Ein höherer Durchsatz ist jedoch für erfahrenere Benutzer möglich oder wenn Roboter-Liquid-Handling-Systeme verfügbar sind.

6. Bindung von Kernen an aktivierte Perlen

HINWEIS: Kühlen Sie alle Puffer vor Gebrauch auf Eis. Alle Puffer, die mit Proteasehemmern ergänzt werden, sollten am Tag des Experiments frisch zubereitet werden. Es wird empfohlen, in den folgenden Schritten 0,2 ml Streifenrohre zu verwenden.

  1. Resuspendieren Sie die pelletierten Kerne aus Schritt 4 in 100 μL eiskaltem SPC-Puffer und übertragen Sie ihn auf einen neuen 8-röhrchenförmigen 0,2-ml-Streifen. 20 μL der aktivierten Perlen zu jeder Probe geben und vorsichtig pipettieren, um zu mischen. 10 min bei Raumtemperatur ohne Rühren inkubieren.
  2. Legen Sie die Rohre auf das Magnetgestell, bis die Aufschlämmung klar ist; Entfernen und verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. Entfernen Sie die Röhrchen aus dem Magnetgestell und fügen Sie jeder Probe 200 μL eiskalten Waschpuffer hinzu. Setzen Sie die Perlen wieder auf, indem Sie 5 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren. Übertragen Sie 100 μL Aliquots aus jeder Probe in einen neuen 8-röhrchenförmigen 0,2-ml-Streifen.
    1. KRITISCHER SCHRITT: Teilen Sie jede CUT&RUN-Stichprobe in zwei separate Aliquots auf. Verwenden Sie eines der Aliquots für den Negativkontrollantikörper (z. B. IgG-Negativkontrollantikörper) und das andere für den Zielantikörper gegen das interessierende Protein (z. B. Anti-GFP-Antikörper).
      HINWEIS: Beide Proben sind für die Rechenpipeline erforderlich, um Anreicherungssignale genau zu identifizieren, die für die TF von Interesse spezifisch sind. Eine zusätzliche Kontrolle mit Anti-GFP-Antikörpern mit einer nicht markierten Dehnung kann ebenfalls durchgeführt werden. Diese Kontrolle hat Ergebnisse gezeigt, die mit der Verwendung von IgG-Antikörpern in einem GFP-markierten Stamm vergleichbar sind. Daher wird der Einfachheit halber empfohlen, die Standard-IgG-Steuerung für alle Experimente zu verwenden.

7. Primäre Antikörperbindung

HINWEIS: Das pAG-MNase-Fusionsprotein bindet gut an Kaninchen-, Ziegen-, Esel-, Meerschweinchen- und Maus-IgG-Antikörper17. Im Allgemeinen sind die meisten kommerziellen ChIP-seq-zertifizierten kommerziellen Antikörper mit CUT&RUN-Verfahren kompatibel. Die Menge des verwendeten primären Antikörpers hängt von der Effizienz des Antikörpers ab, und eine Titration des Antikörpers (z. B. 1:50, 1:100, 1:200 und 1:400 endgültige Verdünnung) kann erforderlich sein, wenn der interessierende Antikörper zuvor nicht in ChIP- oder CUT&RUN-Experimenten getestet wurde. Kühlen Sie alle Puffer vor dem Gebrauch auf Eis. Alle Puffer, die für Antikörperbindungsschritte verwendet werden, sollten am Tag des Experiments frisch zubereitet werden.

  1. Legen Sie die Rohre auf ein Magnetgestell und warten Sie, bis die Aufschlämmung vollständig klar ist. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. 50 μL des Antikörperpuffers hinzufügen und vorsichtig durch Pipettieren mischen.
  2. 3 μL des polyklonalen Anti-GFP-Antikörpers zugeben (oder 0,5 μg, wenn ein ungetesteter Antikörper verwendet wird). Die Röhrchen auf einem Nutmischer bei 4 °C für 2 h inkubieren.
    HINWEIS: Einige CUT&RUN-Protokolle berichten von einer erhöhten Ausbeute durch Zugabe eines sekundären Antikörpers vor der pAG-MNase-Addition14; Mit diesem zusätzlichen Schritt wurde jedoch keine signifikante Verbesserung beobachtet, und daher ist er nicht in diesem Protokoll enthalten.
  3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz bei 100 × g bei Raumtemperatur für 5 s, legen Sie die Röhrchen auf ein Magnetgestell, und sobald die Aufschlämmung klar ist, entfernen Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn mit einer Pipette. Während sich die Röhrchen mit den Perlen noch auf dem Magnetgestell befinden, fügen Sie 200 μL eiskalten Zellpermeabilisierungspuffer direkt auf die Perlen hinzu. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie dies für insgesamt zwei Wäschen mit dem eiskalten Cell Permeabilization Buffer.
  4. Geben Sie 50 μL eiskalten Zellpermeabilisierungspuffer in jedes Röhrchen und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren.
    HINWEIS: Perlen werden an dieser Stelle oft aggregiert, können aber leicht durch sanftes Mischen mit einer 200-μL-Pipette dispergiert werden.

8. Bindung der pAG-MNase an Antikörper

  1. 2,5 μL der pAG-Mnase (20x Brühe) zu jeder Probe geben und vorsichtig durch Pipettieren mischen. Legen Sie die Proben (leicht erhöht bei ~ 45° Winkel) auf einen Nutator bei 4 °C. Schalten Sie den Nutator ein und inkubieren Sie die Proben für 1 h.
  2. Die Bandröhrchen bei 100 × g bei Raumtemperatur für 5 s kurz zentrifugieren, die Röhrchen auf ein Magnetgestell legen und, sobald die Aufschlämmung klar ist, den Überstand mit einer Pipette entfernen und entsorgen.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend. Der Übertragsantikörper, der nach diesem Schritt in der Kappe oder an den Seiten der Röhren verbleibt, erhöht die Menge des Hintergrundsignals erheblich.
  3. Während sich die Röhrchen mit den Perlen noch auf dem Magnetgestell befinden, fügen Sie 200 μL eiskalten Zellpermeabilisierungspuffer hinzu, lassen Sie die Aufschlämmung ableiten und entfernen und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Wäschen mit dem Zellpermeabilisierungspuffer.
  4. 100 μL des eiskalten Zellpermeabilisierungspuffers in die Proben geben und 5 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren.

9. Gezielte Chromatinverdauung und -freisetzung

  1. Brüten Sie die Röhrchen mit der Probe(n) in einem nassen Eisbad für 5 min. Mit einer Mehrkanalpipette werden 3 μL 100 mMCaCl2 in jede Probe gegeben. 5 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren, die Schläuche sofort in das nasse Eisbad zurückbringen und 30 min inkubieren.
  2. 66 μL des Stop-Puffers zu jeder Probe geben und vorsichtig zum Mischen vortexen. Proben für 10 min bei 37 °C in einem trockenen Bad inkubieren.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, 1,5 pg heterologe E. coli-Spike-in-DNA pro Probe in den Stop-Puffer zu geben. Die Zugabe von 1,5 pg E. coli-Spike-in-DNA führt zu 1.000-10.000 kartierten Spike-in-Lesevorgängen für 1-10 Millionen kartierte experimentelle Lesevorgänge14. Die Spike-in-DNA wird verwendet, um die Sequenzierungstiefe zu kalibrieren und ist besonders wichtig für den Vergleich von Proben in einer Serie. Die Zugabe von Spike-in E. coli wird dringend empfohlen, ist aber nicht unbedingt erforderlich. Das kommerzielle CUT&RUN-Kit enthält E. coli-Spike-in-DNA, kann aber auch separat erworben werden.
  3. Legen Sie die Röhrchen auf das magnetische Rack und übertragen Sie 160 μL des Überstands in eine 1,5 ml Mikrofugenröhre. Übertragen Sie 80 μL der Probe in ein neues 2-ml-Mikrofugenröhrchen und lagern Sie es bei -20 ° C, falls eine Backup-Probe benötigt wird. Fahren Sie mit Schritt 10 mit der 80-μL-Probe fort.

10. Aufreinigung der gesammelten DNA-Proben

HINWEIS: Inkubieren Sie DNA-Reinigungskügelchen bei Raumtemperatur für 30 Minuten vor dem Gebrauch. Prechill 100% Isopropanol auf Eis. Beim Mischen der Proben 10 Mal auf und ab pipettieren.

  1. Vortex-DNA-Reinigungsperlen zur Homogenisierung der Perlensuspension. 50 μL (~0,6x Probenvolumen) der resuspendierten Perlen zu jeder Probe geben. Pipette-Mischen und inkubieren Sie die Proben auf einem Nutator für 5 min bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Das Verhältnis von DNA-Aufreinigungsperlen zu verwendeter Probe ist kritisch. Durch die Verwendung eines 0,6-fachen Volumens der DNA-Reinigungsperlenlösung relativ zur Probe können sich die magnetischen Perlen an große DNA-Fragmente binden, die aus beschädigten Kernen freigesetzt werden. CUT&RUN-angereicherte DNA-Fragmente sind viel kleiner als diese großen DNA-Fragmente und bleiben somit bei diesem Schritt im Überstand erhalten.
  2. Legen Sie die Röhrchen auf ein magnetisches Rack und übertragen Sie 130 μL des Überstandes, der die DNA enthält, auf einen 0,2 mL 8-Röhrchenstreifen. Zugabe von zusätzlichen 30 μL DNA-Reinigungskügelchen zu der/den Probe(n) (das Gesamtvolumen beträgt 160 μL).
  3. Fügen Sie 170 μL (~ 1x Probenvolumen) eiskaltes 100% Isopropanol hinzu, mischen Sie gut, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren, und inkubieren Sie es 10 min lang auf Eis.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass für diesen Schritt 100% eiskaltes Isopropanol für die DNA-Reinigungskügelchen verwendet wird, um die mit CUT & RUN angereicherten kleinen Fragmente effizient einzufangen.
  4. Legen Sie die Röhrchen auf das Magnetgestell, und sobald die Gülle verschwunden ist, entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn mit einer Pipette.
  5. Während sich die Röhrchen auf dem Magnetgestell befinden, fügen Sie 200 μL frisch zubereitetes 80% Ethanol bei Raumtemperatur zu den Röhrchen hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 s. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Waschungen mit 80% Ethanol.
  6. Drehen Sie die Röhrchen schnell mit 100 × g, legen Sie die Röhrchen wieder auf das Magnetgestell und entfernen Sie das restliche Ethanol mit einer Pipette, nachdem sich die Gülle entfernt hat. Trocknen Sie die Perlen 5 Minuten lang an der Luft, während die Schläuche bei geöffnetem Deckel auf dem Magnetgestell verbleiben.
    HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 5 Minuten Trocknungszeit, da dies die endgültige DNA-Ausbeute erheblich reduzieren kann.
  7. Entfernen Sie die Röhrchen aus dem magnetischen Rack und eluieren Sie die DNA aus den Perlen, indem Sie 17 μL 0,1x Tris-EDTA (TE) bei pH 8 hinzufügen. Gut mischen und die Röhrchen 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  8. Legen Sie die Röhrchen auf das Magnetgestell, bis die Aufschlämmung klar wird. Sobald die Gülle verschwunden ist, übertragen Sie vorsichtig 15 μL des Überstands in ein steriles 0,2 mL PCR-Röhrchen.
  9. Messen Sie die Konzentration der gesammelten DNA mit einem Fluorometer gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    HINWEIS: Typischerweise beträgt die Konzentration der gesammelten DNA ~ 1 ng / μL. Manchmal ist die Konzentration der gesammelten DNA zu niedrig, um sie mit einem Fluorometer zu quantifizieren. Dies ist kein Indikator für ein fehlgeschlagenes Experiment. Fahren Sie mit der Bibliotheksvorbereitung fort, unabhängig von der Konzentration der gesammelten DNA.
  10. Fahren Sie mit Schritt 11 fort oder lagern Sie die Proben bei -20 °C, bis sie fertig sind.

11. Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung

HINWEIS: Für die folgenden Schritte wird ein handelsübliches Bibliotheksvorbereitungskit verwendet. Wenn Sie Schritte mit dem Ligation Master Mix ausführen, minimieren Sie das Berühren der Röhren und halten Sie sie immer auf Eis.

  1. Erhöhen Sie mit 0,1x TE bei pH 8 das Gesamtvolumen der CUT&RUN DNA auf 50 μL. Machen Sie eine Mastermischung aus 3 μL End Prep Enzyme Mix und 7 μL End Prep Reaction Buffer pro Probe. Fügen Sie 10 μL Master-Mix zur CUT&RUN DNA hinzu und mischen Sie gründlich, indem Sie 5 Mal nach oben und unten pipettieren.
  2. Führen Sie eine schnelle Drehung bei 100 × g durch, um die gesamte Flüssigkeit von den Seiten der Tube zu sammeln. Legen Sie die Schläuche in einen Thermocycler, wobei der beheizte Deckel auf ≥75 °C eingestellt ist, und lassen Sie die Zyklusbedingungen gemäß Tabelle 7 laufen.
    HINWEIS: Abhängig von den aus Schritt 10 gesammelten DNA-Anfangskonzentrationen folgen Sie der erforderlichen Adapterverdünnung aus Tabelle 8.
  3. Fügen Sie 2,5 μL Adapter pro Probe hinzu und mischen Sie gründlich, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass der Adapter der Probe hinzugefügt und gründlich gemischt wird, bevor die Ligationsmastermischung hinzugefügt wird.
  4. Machen Sie einen Master-Mix aus 30 μL Ligation Master Mix und 1 μL Ligation Enhancer. 31 μL der Mastermischung in die Probe(n) geben. Mischen Sie gründlich, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren.
  5. Bei 20 °C für 15 min in einem Thermocycler bei abgenommenem beheiztem Deckel inkubieren.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Proben erst dann auf Eis aufbewahrt und in den Thermocycler überführt werden, wenn der Thermocycler 20 °C erreicht hat.
  6. Führen Sie einen schnellen Spin bei 100 × g durch, um die gesamte Flüssigkeit von den Seiten des Röhrchens zu sammeln, fügen Sie 3 μL Uracil Excision Enzym hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen im Thermocycler bei 37 ° C für 15 Minuten mit dem beheizten Deckel auf ≥ 47 ° C.
    HINWEIS: Dies ist ein sicherer Haltepunkt. Lagern Sie die Proben bei -20 °C oder fahren Sie direkt mit Schritt 11.7 fort. Wenn Sie direkt mit Schritt 11.7 fortfahren, inkubieren Sie die DNA-Reinigungskügelchen vor der Anwendung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  7. 154,4 μL (~1,6x Probenvolumen) der DNA-Reinigungskügelchen in die Adapterligationsreaktion aus Schritt 11.6 geben. Pipette-Mischen und Inkubieren der Proben für 5 min bei Raumtemperatur.
  8. Legen Sie die Röhrchen auf das Magnetgestell und entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn mit einer Pipette, sobald sich die Gülle entfernt hat.
  9. Geben Sie 200 μL frisch zubereitetes 80% Ethanol bei Raumtemperatur in die Röhrchen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 s. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Wäschen mit 80% Ethanol.
  10. Drehen Sie die Röhrchen kurz bei 100 × g. Legen Sie die Röhrchen wieder auf das Magnetgestell und entfernen Sie das verbleibende Ethanol mit einer Pipette. Trocknen Sie die Perlen 5 Minuten lang an der Luft, während die Rohre bei geöffnetem Deckel auf dem Magnetgestell verbleiben.
    HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 5 Minuten Trocknungszeit, da dies die endgültige DNA-Ausbeute erheblich reduzieren kann.
  11. Entfernen Sie die Röhrchen aus dem magnetischen Rack und eluieren Sie die DNA aus den Perlen, indem Sie 17 μL 0,1x TE bei pH 8 hinzufügen. Gut mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  12. Legen Sie die Röhrchen auf das Magnetgestell, bis die Aufschlämmung klar wird. Sobald die Gülle verschwunden ist, übertragen Sie vorsichtig 15 μL des Überstands in ein steriles 0,2 mL PCR-Röhrchen.
  13. Machen Sie eine Mastermischung aus 25 μL DNA-Polymerase-Master-Mix und 5 μL Universal Forward Library Amplification Primer (10 μM) pro Probe.
    HINWEIS: Bereiten Sie eine zusätzliche Probe der Mastermischung vor, um Pipettierverluste zu berücksichtigen.
  14. Fügen Sie 30 μL des Master-Mixes zu der 15 μL Adapter-ligierten DNA-Probe hinzu. Fügen Sie 5 μL Reverse Unique Indexed Library Amplification Primer (10 μM) zu jeder Probe hinzu, um das endgültige Volumen auf insgesamt 50 μL zu bringen. Mischen Sie gründlich, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Führen Sie die PCR-Zyklusbedingungen in Tabelle 9 durch.
    HINWEIS: Inkubieren Sie die DNA-Reinigungskügelchen bei Raumtemperatur für 30 Minuten vor dem Gebrauch.
  15. Wirbeln Sie die DNA-Reinigungskügelchen auf, um sie zu resuspendieren. 35 μL (~0,7x Probenvolumen) der resuspendierten Kügelchen zu den PCR-amplifizierten DNA-Proben geben. Mischen und inkubieren Sie die Proben auf einem Nutator für 5 min bei Raumtemperatur.
  16. Legen Sie die Röhrchen auf das magnetische Rack und sobald die Aufschlämmung klar ist, übertragen Sie den Überstand, der die DNA enthält, auf eine neue 0,2 ml 8-Well-PCR-Streifenröhre.
  17. Fügen Sie der Probe 119 μL (~ 1,4x Probenvolumen) Perlen hinzu und mischen Sie, indem Sie 5 Mal nach oben und unten pipettieren. Inkubieren Sie die Proben auf einem Nutator für 5 min bei Raumtemperatur.
  18. Legen Sie die Röhrchen auf das Magnetgestell und entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn mit einer Pipette, sobald sich die Gülle entfernt hat.
  19. Geben Sie 200 μL frisch zubereitetes 80% Ethanol bei Raumtemperatur in die Röhrchen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 s. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Wiederholen Sie den Schritt für insgesamt zwei Waschungen mit 80% Ethanol.
  20. Drehen Sie die Röhrchen kurz bei 100 × g. Legen Sie die Röhrchen wieder auf das Magnetgestell und entfernen Sie das verbleibende Ethanol mit einer Pipette. Trocknen Sie die Perlen 5 Minuten lang an der Luft, während die Schläuche bei geöffnetem Deckel auf dem Magnetgestell verbleiben.
    HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 5 Minuten Trocknungszeit, da dies die endgültige DNA-Ausbeute erheblich reduzieren kann.
  21. Entfernen Sie die Röhrchen aus dem magnetischen Rack und eluieren Sie die DNA aus den Perlen, indem Sie 14 μL 0,1x TE bei pH 8 hinzufügen. Gut mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  22. Legen Sie die Röhrchen auf das Magnetgestell, bis die Aufschlämmung klar wird. Sobald sich die Gülle entfernt hat, übertragen Sie vorsichtig 13 μL des Überstands in ein steriles 0,2 ml PCR-Röhrchen.
  23. Bereiten Sie frisches 1x Tris-Borat-EDTA (TBE) vor und legen Sie vorgefertigtes, handelsübliches 10% Acrylamid TBE-Gel in die mit 1x TBE gefüllte Gelelektrophorese-Vorrichtung.
  24. In der ersten Vertiefung fügen Sie 2 μL Low-Range-DNA-Leiter hinzu. Mischen Sie 3 μL 6x Belastungsfarbstoff mit 13 μL der zuvor aus Schritt 11.22 entnommenen Probe. Geben Sie vorsichtig 15 μL in jede Vertiefung des Gels. Lassen Sie das Gel 90 Minuten lang bei 70 V laufen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Vertiefung im Gel zwischen jeder Probe leer zu lassen, da dies die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination der Probe verringert. Erfahrene Anwender können es für angebracht halten, alle Vertiefungen zu verwenden und gleichzeitig Kreuzkontaminationen sorgfältig zu vermeiden, insbesondere bei der Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben.
  25. Entfernen Sie den Gelguss aus der Gelbox. Öffnen Sie den Gelguss gemäß den Anweisungen des Herstellers, entfernen Sie das Gel vorsichtig vom Gelguss und legen Sie es in eine Gel-Halteschale mit 100 ml 1x FSME.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie das Gel vorsichtig aus dem Gelguss entfernen, um zu vermeiden, dass das Gel zerreißt, da es dünn und zerbrechlich ist. Es ist wichtig, Handschuhe und das Gel mit 1x TBE bei der Handhabung des Gels vorzunässen. Die Gelhalteschale sollte etwas größer als die Größe des Gels sein (ca. 0,5 "auf jeder Seite). Die Kunststoffdeckel, die mit 96-Well-PCR-Tube-Aufbewahrungsboxen geliefert werden, sind praktische Aufbewahrungsschalen für Standard-Mini-Gel-Größen.
  26. 10 μL des Nukleinsäuregel-Flecks in die Schale geben und vorsichtig schwenken. Zum Schutz vor Licht mit Folie abdecken und bei Raumtemperatur 10 min statisch inkubieren.
  27. Spülen Sie das Gel zweimal mit 100 ml entionisiertem Leitungswasser ab. Stellen Sie das Gel unter blauer Lichtbeleuchtung mit einer gelben Filterabdeckung dar (Abbildung 2).
    HINWEIS: Erfolgreiche Bibliotheken zeigen einen Abstrich zwischen 100 und 500 bp. Es wird auch ein prominentes ~125 Adapterdimerband geben. Das Vorhandensein von Adapterdimeren ist kein Indikator für eine schlechte Bibliotheksqualität. Diese Menge an Adapterdimeren ist für CUT&RUN-Experimente, die an TFs mit geringer Häufigkeit durchgeführt werden, unvermeidlich und ist eine Folge der geringen Menge an Eingabematerial, die zur Vorbereitung dieser Bibliotheken verwendet wird. Verwenden Sie kein ultraviolettes Licht, das die DNA schädigen kann.
  28. Wie in Abbildung 2 gezeigt, schneiden Sie für jede Bibliothek das Gel leicht über das prominente Adapterdimerband ~ 125 bp (achten Sie darauf, das Adapterdimerband nicht zu berühren) und unter die 400 bp Leitermarke.
    HINWEIS: Es ist wichtig, das ~ 125-Adapter-Dimerband zu vermeiden. Selbst winzige Mengen an Adapterdimeren reduzieren die Bibliotheksqualität erheblich.
  29. Durchstechen Sie den Boden eines 0,65-ml-Röhrchens mit einer 22-G-Nadel und legen Sie das punktierte Röhrchen in ein steriles 2-ml-Mikrofugenröhrchen. Übertragen Sie die Gelscheibe auf das durchstochene Röhrchen im 2 ml Mikrofugenröhrchen.
  30. Zentrifugieren Sie das 2-ml-Mikrofugenröhrchen mit dem 0,65 ml punktierten Röhrchen und nehmen Sie eine Probe bei 10.000 × g bei Raumtemperatur für 2 Minuten auf, um die Gelaufschlämmung im 2-ml-Mikrofugenröhrchen zu sammeln.
    HINWEIS: Das durchstochene Rohr sollte jetzt leer sein und kann entsorgt werden. Wenn sich im durchstochenen Röhrchen noch Gel befindet, legen Sie das punktierte Röhrchen wieder in das 2-ml-Mikrofugenröhrchen und zentrifugieren Sie erneut bei 10.000 × g bei Raumtemperatur für weitere 2 Minuten.
  31. Auf die Gelaufschlämmung im 2 ml Mikrofugenröhrchen 300 μL eiskalten Gelelutionspuffer geben und auf einem Nutator bei Raumtemperatur für mindestens 3 h oder über Nacht (12-16 h) mischen.
  32. Gesamte Flüssigkeits- und Gelaufschlämmung in eine 0,22 μm Filtersäule überführen. Zentrifuge bei 10.000 × g bei Raumtemperatur für 1 min; Das gesammelte Volumen sollte ~ 300 μL betragen.
  33. Fügen Sie 450 μL (~ 1,5x Probenvolumen) DNA-Reinigungskügelchen hinzu, inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten auf einem Nutator und legen Sie die Probe dann auf das Magnetgestell, bis die Aufschlämmung klar ist.
    HINWEIS: Inkubieren Sie die DNA-Reinigungskügelchen bei Raumtemperatur für 30 Minuten vor dem Gebrauch.
  34. Entfernen und verwerfen Sie 500 μL des Überstandes und achten Sie darauf, die Perlen nicht zu stören.
  35. Entfernen Sie die Probe aus dem Magnetgestell und mischen Sie die Perlen, indem Sie 5 Mal nach oben und unten pipettieren. Übertragen Sie 200 μL der Probe in ein neues PCR-Streifenröhrchen.
  36. Legen Sie das Streifenrohr auf das Magnetgestell, und sobald sich die Aufschlämmung entfernt hat, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn mit einer Pipette.
  37. Geben Sie 200 μL frisch zubereitetes 80% Ethanol bei Raumtemperatur in die Röhrchen und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 s. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Waschungen mit 80% Ethanol.
  38. Drehen Sie die Röhrchen kurz bei 100 × g. Legen Sie die Röhrchen wieder auf das Magnetgestell und entfernen Sie das verbleibende Ethanol mit einer Pipette. Trocknen Sie die Perlen bis zu 5 Minuten an der Luft, während die Röhrchen bei geöffnetem Deckel auf dem Magnetgestell verbleiben.
    HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 5 Minuten Trocknungszeit, da dies die endgültige DNA-Ausbeute erheblich reduzieren kann.
  39. Entfernen Sie die Röhrchen aus dem magnetischen Rack und eluieren Sie die DNA aus den Perlen, indem Sie 17 μL 0,1x TE bei pH 8 hinzufügen. Gut mischen und die Röhrchen 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  40. Legen Sie die Röhrchen auf das Magnetgestell, bis die Aufschlämmung klar wird. Sobald die Gülle verschwunden ist, übertragen Sie vorsichtig 15 μL des Überstands in ein steriles 0,2 mL PCR-Röhrchen.
  41. Messen Sie die endgültige Bibliotheksmenge mit dem Fluorometer. Verwenden Sie diese letzte Bibliothek für die Sequenzierung.
    HINWEIS: Bis zu 48 Bibliotheken können in einer einzigen Lane zusammengefasst und sequenziert werden, indem eine Sequenzierungsplattform verwendet wird, die mindestens 300 Millionen Lesevorgänge am 40. Bp oder länger bereitstellt.

12. CUT&RUN Sequenzanalyse

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird das Berechnungsprotokoll vorgestellt, das zur Analyse der CUT&RUN-Sequenzdaten verwendet wird. Das Protokoll beginnt mit dem Einrichten der virtuellen Computerumgebung und führt die Benutzer durch die Ausführung der Befehle auf ihrem lokalen Computer. Dieses Protokoll funktioniert auf allen Rechenressourcen, z. B. lokalen Computern, virtuellen Cloudservern und Hochleistungscomputerclustern. Alle CUT&RUN-Daten, die in diesem Papier vorgestellt werden, können unter NCBI GEO unter der Beitrittsnummer GSE193803 abgerufen werden.

  1. Laden Sie den Quellcode für die CUT&RUN-Analyse von https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis herunter.
    HINWEIS: Der Workflow funktioniert am besten auf einem MacOS- oder Linux-Betriebssystem. Windows-Benutzer können den Workflow mit GitBash ausführen (siehe Materialtabelle).
    1. Laden Sie den Code direkt von der GitHub-Seite herunter, indem Sie auf die grüne Code-Schaltfläche | klicken ZIP-Option herunterladen . Entpacken Sie den Ordner an einen relevanten Speicherort auf dem lokalen Computer.
  2. Installieren Sie die Conda-Umgebung (siehe Materialtabelle) und führen Sie sie nur einmal aus.
    HINWEIS: Dieser Workflow verwendet die Conda-Befehlszeilen-Toolumgebung, um alle erforderlichen Software und Tools zu installieren.
  3. Sobald Conda installiert ist (nur einmal ausführen), erstellen Sie eine virtuelle Umgebung mit der Zusatzdatei 2, die mit dem folgenden Befehl bereitgestellt wird:
    conda create --name --file Supplementary_File_2.txt
  4. Aktivieren Sie die virtuelle Umgebung jedes Mal, wenn dieser Workflow ausgeführt werden soll, mit:
    conda activate
  5. Organisieren Sie die FASTQ-Eingabedateien in einem einzigen Ordner, idealerweise in einem Ordner pro CUT&RUN-Experiment.

13. Generierung der Genomdatei für die Ausrichtung

  1. Generieren Sie die Genomdatei für die Ausrichtung (führen Sie sie nur einmal für jede Genomdatei aus). Erstellen Sie einen Ordner, um alle Genomdateien von C. albicans zu speichern, z. B.:
    ca_genome_files mkdir

14. Herunterladen der Genomassemblierung von C. albicans 21

  1. Laden Sie C. albicans genome assembly 21 aus der Candida Genome Database herunter, indem Sie entweder wget- oder curl-Tools verwenden (siehe Materialtabelle)18.
    HINWEIS: C. albicans Assembly 21 wurde hier verwendet, um CUT&RUN-Ergebnisse mit zuvor veröffentlichten ChIP-Chip-Ergebnissen zu vergleichen, die auf Assembly 21 abgestimmt waren. Benutzer können andere Assemblyversionen herunterladen und ähnliche Befehle ausführen, um relevante Genomdateien für ihre Ausrichtungsanforderungen zu generieren.

15. Generieren Sie eine Bowtie 2 Indexdatenbank (Datenbankname: ca21)

  1. Verwenden Sie Folgendes:
    Fliege2-Build C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
    Bowtie2-inspect -s ca21

16. Führen Sie die CUT&RUN-Analysepipeline aus

  1. Lesen Sie den Hilfebereich, um sich mit den Parametern der Pipeline vertraut zu machen.
    bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. Führen Sie die cut_n_run_pipeline.sh Datei mit relevanten Parametern aus

  1. Führen Sie das Skript aus:
    bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y > /path/to/output.log 2>&1
    HINWEIS: Die relevanten Parameter mit detaillierten Beschreibungen in den Zeilen 19-36 des Codes sind auf der GitHub-Seite https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh beschrieben.

18. Ausgabedateien organisieren

  1. Führen Sie signifikante Spitzen aus allen von MACS2 aufgerufenen Replikaten zusammen, die sich in /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 befinden, indem Sie die BedTools Merge-Funktion19 verwenden.
    cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files sort -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o last,mean,first,mean,mean,mean > /path/to/merged_output.bed
    HINWEIS: Weitere Informationen und Best Practices zur Bewertung überlappender Spitzen in Replikatproben finden Sie in Landt et al.20 und Boyd et al.21.

19. Entfernen Sie Übereinstimmungen zu blockierten genomischen Regionen mit der BedTools-Subtrahierfunktion

  1. Verwenden Sie Folgendes: subtrahieren Sie Bed -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/ Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
    HINWEIS: Die blockaufgelisteten Regionen im Genom von C. albicans werden als .bed-Datei in der Zusatzdatei 3 bereitgestellt. Die Liste besteht hauptsächlich aus sich stark wiederholenden Sequenzelementen und Regionen wie Telomerwiederholungen und Zentromeren, die häufig falsch-positive Ergebnisse in C. albicans CUT&RUN-, ChIP-seq- und ChIP-chip-Datensätzen liefern. Daher wird empfohlen, die blockierten Regionen zu entfernen. Für bestimmte Proteinziele kann es jedoch unangemessen oder unerwünscht sein, diese Loci auszuschließen. Benutzer können diesen Schritt überspringen, um Signale beizubehalten, die in diesen blockierten Regionen enthalten sind, oder ihre eigenen blockierten Regionen zu erstellen.

20. Zusammenführen von BigWig-Dateien aus Replikaten mit der UCSC bigWigMerge-Funktion22

  1. Verwenden Sie Folgendes: bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
  2. Konvertieren Sie die BedGraph-Ausgabe von bigWigMerge in BigWig mithilfe der UCSC-Funktion bedGraphToBigWig.
    bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

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Representative Results

Dieses robuste CUT&RUN-Protokoll wurde angepasst und optimiert, um die genomweite Lokalisierung spezifischer TFs in C. albicans-Biofilmen und planktonischen Kulturen zu untersuchen (siehe Abbildung 2 für einen Überblick über den experimentellen Ansatz). Eine gründliche Datenanalyse-Pipeline ist ebenfalls enthalten, um die Analyse der resultierenden CUT&RUN-Sequenzierungsdaten zu erleichtern, und erfordert von den Benutzern minimale Kenntnisse in der Kodierung oder Bioinformatik (siehe Abbildung 3 für einen Überblick über die Analyse-Pipeline). Im Gegensatz zu den ChIP-Chip- und ChIP-seq-Methoden wird CUT&RUN unter Verwendung intakter, permeabilisierter Kerne durchgeführt, die aus einer signifikant reduzierten Anzahl von Eingangszellen ohne Formaldehydvernetzung hergestellt werden. Die Isolierung intakter Kerne von C. albicans spheroplasts ist ein kritischer Schritt im Protokoll. Eine effiziente Sphäroplastisierung über den Aufschluss der C. albicans-Zellwand mit Lytikase kann eine Herausforderung darstellen, da die enzymatischen Verdauungsreaktionsbedingungen für jeden Zelltyp optimiert werden müssen. Um ein erfolgreiches CUT&RUN-Experiment mit qualitativ hochwertigen Sequenzierungsergebnissen zu gewährleisten, ist daher ein früher Qualitätskontrollschritt enthalten und das Vorhandensein intakter Kerne wird mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop überprüft.

Der Zellwandaufschluss und die nukleare Integrität werden regelmäßig beurteilt, indem sowohl intakte Zellen als auch isolierte Kerne sichtbar gemacht werden, die mit fluoreszierenden Zellwand- und Nukleinsäurefärbungen angefärbt sind. Im Gegensatz zu den isolierten intakten Kernen, bei denen keine Zellwandfärbung beobachtet wird, sind sowohl Kerne als auch die Zellwände in den intakten Kontrollzellen fluoreszierend markiert (Abbildung 4A). Schließlich wird vor der Sequenzierung die Fragmentgrößenverteilung von CUT&RUN-Bibliotheken mit einem Kapillarelektrophorese-Instrument ausgewertet. Dieser Qualitätskontrollschritt ist ein zuverlässiges Maß für die Beurteilung der Qualität von CUT&RUN-Bibliotheken. Wie in der Elektrophorese-Spur auf der Oberseite von Abbildung 4B zu sehen ist, zeigen erfolgreiche Bibliotheken, die für Experimente zur Untersuchung von TFs generiert wurden, eine hohe Anreicherung für Fragmente kleiner als 280 bp. Die Elektrophorese-Spur im unteren Bereich von Abbildung 4B stellt die Ergebnisse eines erfolglosen CUT&RUN-Experiments dar.

Hier entstand der Spitzenwert bei ~ 2.000 bp hauptsächlich aus unverdauter DNA, die aus Kernen freigesetzt wurde, die während des CUT&RUN-Experiments stark beschädigt oder gebrochen wurden. Es wird auch empfohlen, die Fragmentgrößenverteilung der endgültigen gepoolten Bibliotheken zu bewerten, um die vollständige Entfernung kontaminierender Adapterdimere zu bestätigen (Abbildung 4C). Typischerweise bieten 5-10 Millionen gepaarte Lesevorgänge (~ 40 Basisleselängen) pro Bibliothek eine ausreichende Sequenzierungstiefe für die meisten TF CUT&RUN-Experimente in C. albicans. Alternative Sequenzierungsleselängen, entweder gepaart oder Single-End, können verwendet werden, um CUT&RUN-Bibliotheken zu sequenzieren. Beispielsweise sollten gepaarte Leselängen zwischen 25 und 150 bp die Qualität der Ergebnisse nicht beeinträchtigen. Single-End-Messwerte größer oder gleich 150 bp sollten auch für TF CUT&RUN-Experimente funktionieren. Die zugehörige Datenanalyse-Pipeline muss jedoch geändert werden, um Single-End-Lesevorgänge zu ermöglichen.

Dieses CUT&RUN-Protokoll und die dazugehörige Datenanalyse-Pipeline wurden durch die Untersuchung von zwei TFs, Ndt80 und Efg1, validiert, die die Biofilmbildung von C. albicans kontrollieren. Wie in Abbildung 4D gezeigt, ist Ndt80 an intergenen Regionen gebunden (hervorgehoben durch die schwarzen Balken, die deutlich angereicherte Ndt80 ChIP-Chip-Loci anzeigen) vor dem EFG1 ORF. Es wurde zuvor gezeigt, dass diese intergene Region vor EFG1 durch ChIP-Chip4 für die Ndt80-Bindung während der Biofilmbildung hoch angereichert ist. CUT&RUN-Experimente identifizierten jedoch signifikant mehr Peaks in dieser Region als ChIP-Chip-Experimente (10 Peaks vs. 4 Peaks). Ndt80-DNA-Bindungsmotive sind über alle von CUT&RUN identifizierten Ndt80-gebundenen Loci angereichert (ergänzende Abbildung 1), was darauf hindeutet, dass die zusätzlichen Peaks, die mit dieser Methodik identifiziert wurden, wahrscheinlich bona fide Ndt80-gebundene Sites sind. Eine systematische vergleichende Analyse zeigte, dass dieses vorgestellte CUT&RUN-Protokoll die Mehrheit der bisher bekannten Bindungsereignisse für Ndt80 und Efg1 während der Biofilmbildungerfolgreich identifizierte 4 (Abbildung 5).

Darüber hinaus wurden viele neue TF-Bindungsereignisse, die in den zuvor veröffentlichten ChIP-Chip-Experimenten nicht erfasst wurden, mit CUT&RUN identifiziert (Abbildung 5). Insgesamt sind sowohl Ndt80 als auch Efg1 an Loci gebunden, die sich mit zuvor veröffentlichten ChIP-Chip-Daten überlappen, und an Loci, die nur mit der CUT&RUN-Methode identifiziert wurden (Überschneidungen zwischen diesen CUT&RUN-Daten und zuvor veröffentlichten ChIP-Chip-Daten für Ndt80 und Efg1 sind in den Venn-Diagrammen in Abbildung 5 zusammengefasst). Darüber hinaus war der Anteil der Lesevorgänge innerhalb signifikant genannter Peaks (FRiP-Scores) in GFP-markierten Stichproben durchweg höher als in ihren Kontroll-IgG-Stichproben (siehe Ergänzende Abbildung 2). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass das hier beschriebene CUT&RUN-Protokoll eine robuste Methode ist, die optimiert ist, um C. albicans TF-DNA-Bindungsinteraktionen aus Proben mit geringer Häufigkeit zu untersuchen.

Figure 1
Abbildung 1: Epitop-Markierung von C. albicans TFs. (A) Identifizieren Sie ein TF-Gen von Interesse (in diesem Fall NDT80) und wählen Sie eine gRNA aus, um das Schneiden von Cas9 (dargestellt durch die orange Form) am 3'-Ende des ORF anzuvisieren. (B) Candida-clade-optimiertes eGFP mit >50 bp Homologie vor und nach der Schnittstelle wird die dDNA zur Reparatur des DSB liefern. (C) Verwenden Sie die Kolonie-PCR, um einzelne Kolonien zu screenen, um die beabsichtigte Integration zu bestätigen. Primer sind durch rote Pfeile gekennzeichnet, und Amplicons werden durch gestrichelte Kästchen gekennzeichnet. Diese Figur wurde mit BioRender.com erstellt. Abkürzungen: TF = Transkriptionsfaktor; gRNA = Leit-RNA; ORF = offener Leserahmen; eGFP = Enhanced Green Fluorescent Protein; DSB = doppelsträngiger Bruch; US = Upstream; DS = nachgelagert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische Übersicht über das experimentelle CUT&RUN-Protokoll. C. albicans-Zellen, die aus Biofilm- oder Planktonkulturbedingungen gewonnen werden, werden permeabilisiert, um intakte Kerne zu isolieren. ConA-Perlen werden aktiviert und die intakten Kerne werden dann an die aktivierten ConA-Perlen gebunden. Der Antikörper von Interesse wird zu den perlengebundenen Kernen gegeben und bei 4 °C inkubiert. Als nächstes wird die pAG-MNase hinzugefügt und darf an den Zielantikörper binden. Nach der Zugabe von CaCl2 wird die pAG-MNase aktiviert, und der gezielte Chromatinaufschluss erfolgt bis zurZugabe des Chelatreagenzes zur Inaktivierung der pAG-MNase. Der pAG-MNase-gebundene Antikörperkomplex darf aus den permeabilisierten Kernen diffundieren, und die resultierende DNA wird extrahiert und gereinigt. Sequenzierungsbibliotheken werden aus den CUT&RUN-angereicherten DNA-Fragmenten hergestellt, und die resultierenden Bibliotheken werden dann auf einem 10% PAGE-Gel ausgeführt, um kontaminierende Adapterdimere vor der Sequenzierung zu trennen und zu entfernen. Diese Figur wurde mit BioRender.com erstellt. Abkürzungen: CUT&RUN = Spaltung unter Targets und Freisetzung mittels Nuklease; ConA = concanavalin A; PAGE = Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Übersicht über die CUT&RUN-Datenanalyse-Pipeline. Der Workflow beginnt mit der Durchführung von Qualitätsprüfungen der FASTQ-Rohdateien mithilfe von FastQC, gefolgt von einem Trimmen, um Sequenzierungsadapter zu entfernen. Die getrimmten Lesevorgänge werden dann auf das Referenzgenom ausgerichtet, und die ausgerichteten Lesevorgänge werden basierend auf ihrer Größe gefiltert, um Bindungssignale in TF-Größe (20 bp ≤ ausgerichteter Lesewert ≤ 120 bp) anzureichern. Größenausgewählte Lesevorgänge werden dann gegen Escherichia coli-Lesevorgänge kalibriert, und kalibrierte Lesevorgänge werden verwendet, um Spitzen mit MACS2 aufzurufen. Das <>-Symbol ist eine visuelle Darstellung, die anzeigt, dass die Lesezahlen von C. albicans mit E. coli-Lesezahlen für jede Probe kalibriert wurden. Abkürzungen: CUT&RUN = Spaltung unter Targets und Freisetzung mittels Nuklease; TF = Transkriptionsfaktor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Qualitätskontrollschritte, die für erfolgreiche CUT&RUN-Experimente entscheidend sind. (A) Die Zellen werden vor und nach der Zellisolierung mit fluoreszierenden Zellwänden (blau) und Nukleinsäureflecken (grün) angefärbt und mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert. (B) CUT&RUN TF-Bibliotheken werden mit einem Kapillarelektrophorese-Instrument analysiert. Erfolgreiche CUT&RUN TF-Bibliotheken (gekennzeichnet durch das grüne Häkchen) werden für kurze Fragmente kleiner als 200 bp angereichert. Suboptimale CUT&RUN TF-Bibliotheken (gekennzeichnet durch das rote "X") zeigen eine Anreicherung für große DNA-Fragmente. (C) 48 CUT&RUN-Bibliotheken werden gepoolt und mit einem Kapillarelektrophorese-Instrument analysiert. Hochwertige, gepoolte Bibliotheken (gekennzeichnet durch das grüne Häkchen) sind frei von Adapterdimeren (Bahn 1), während gepoolte Bibliotheken von geringer Qualität (gekennzeichnet durch das rote "X") kleine Mengen an Adapterdimeren (Bahn 2) enthalten. (D) Repräsentative IGV-Spuren aus CUT&RUN-Datensätzen (einschließlich der Ndt80-IgG-Steuerung, untere Spur), die eine signifikante Anreicherung für die Ndt80-Bindung (obere Spur) in der intergenen Region vor dem EFG1 ORF (Orf19.610) zeigen. Die schwarzen Balken repräsentieren signifikant angereicherte Ndt80-Bindungspeaks, die durch zuvor veröffentlichte ChIP-Chip-Experimenteidentifiziert wurden 4. Die blauen Balken repräsentieren signifikant angereicherte Ndt80-Bindungspeaks, die in den hier vorgestellten CUT&RUN-Experimenten identifiziert wurden. Maßstabsstäbe = 50 μm (A). Abkürzungen: CUT&RUN = Spaltung unter Targets und Freisetzung mittels Nuklease; TF = Transkriptionsfaktor; GFP = grün fluoreszierendes Protein; ORF = offener Leserahmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Bewertung von Ndt80- und Efg1-angereicherten Peaks, die unter Verwendung des vorgestellten CUT&RUN-Protokolls und der Datenanalysepipeline für Candida albicans-Biofilme identifiziert wurden. Die Venn-Diagramme in der obersten Reihe veranschaulichen den Grad der Überlappung zwischen Ndt80- und Efg1-Bindungsstellen, die über CUT&RUN mit zuvor veröffentlichten ChIP-Chip-Datenidentifiziert wurden 4. Die CUT&RUN-Signale für alle Bindungsereignisse für Ndt80 und Efg1 werden in der unteren Reihe als farbige Heatmaps angezeigt (rot = hohes Peaksignal; blau = niedriges/kein Peaksignal; farbiger Balken zeigt IgG-Signal an, das vom GFP-Signal subtrahiert wird); 1.000 bp Regionen Upstream (-1,0 KB) und Downstream (+1,0 kB) werden in den Heatmaps angezeigt. Die Signalintensität (d.h. Anreicherung) als Profilplot wird über den Heatmaps dargestellt. Drei biologische Replikate für Ndt80 und Efg1 wurden für die Visualisierung der CUT&RUN-Anreicherung evaluiert. Abkürzungen: ChIP = Chromatin-Immunpräzipitation; CUT&RUN = Spaltung unter Targets und Freisetzung mittels Nuklease; GFP = grün fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: PCR-Reaktionsmischung und PCR-Zyklusbedingungen zur Verstärkung universeller A- und einzigartiger B-Fragmente. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: PCR-Reaktionsmischung und PCR-Zyklusbedingungen zum Zusammenfügen von A- und B-Fragmenten, um das C-Fragment in voller Länge zu erzeugen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: PCR-Zyklusbedingungen zur PCR verstärken das C-Fragment in voller Länge. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: PCR-Reaktionsmischung und PCR-Zyklusbedingungen zur Amplifikation des Spender-DNA-GFP-Tags. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: Plasmidaufschlussreaktionsmischung und Reaktionsbedingungen für die Plasmidaufschlussreaktionen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 6: PCR-Reaktionsmischung und PCR-Zyklusbedingungen für Kolonie-PCR. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 7: PCR-Zyklusbedingungen für den Endreparaturschritt der Bibliothek in Vorbereitung auf die Sequenzierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 8: Empfehlungen zur Adapterverdünnung für die Eingangs-DNA zur Vorbereitung von Sequenzierungsbibliotheken. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 9: PCR-Zyklusbedingungen zur PCR amplifizieren die adapterligierte DNA. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Ndt80 DNA-Bindungssequenz-Motivanreicherung. Kumulative Ndt80-Motivanreicherungswerte für Ndt80-gebundene Loci, die in Biofilm-ChIP-Chip-Daten (dunkelblau gepunktete Linie) oder CUT&RUN-Daten (hellblaue gepunktete Linie) identifiziert wurden, verglichen mit zufälligen intergenen Loci (rote gepunktete Linie). Die linke Y-Achse gibt den Prozentsatz der Gesamtloci für jedes Dataset an, das einen entsprechenden kumulativen Motivwert auf der X-Achse enthält. Gestrichelte Linien geben die Bedeutung der Motiv-Score-Anreicherung (-log10 P-Wert, rechte Y-Achse) an jedem Punkt auf der X-Achse relativ zu den zufälligen intergenen Kontrollloci an. Kumulierte Motivwerte und P-Werte wurden mit MochiView23 ermittelt (siehe Materialverzeichnis). Alle Ndt80-gebundenen Loci wurden als 500-bp-Fenster abgetastet, die unter jedem Peak der Ndt80-Bindung innerhalb der ChIP-Chip- und CUT&RUN-Datensätze zentriert waren, und mit zufällig ausgewählten intergenen 500-bp-Loci verglichen, um Längenunterschiede zu kontrollieren. Abkürzungen: ChIP = Chromatin-Immunpräzipitation; ChIP-Chip = Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Microarray; CUT&RUN = Spaltung unter Zielen und Freisetzung mittels Nuklease. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Anteil der Lesevorgänge innerhalb einer Spitzenpunktzahl pro Stichprobe. Balkendiagramm, das den FRiP-Score für jedes Replikat darstellt. FRiP-Scores werden berechnet als die Anzahl der zugeordneten Lesevorgänge innerhalb eines Peaks geteilt durch die Gesamtzahl der zugeordneten Lesevorgänge in einer CUT&RUN-Stichprobe. Die verschiedenen Balkenfarben stellen einzelne biologische Replikatproben dar, wie entlang der X-Achse angegeben. Wie erwartet, sind die FRiP-Werte positiver GFP-Proben durchweg höher als die für negative IgG-Proben. Alle Stichproben zeigen akzeptable FRiP-Schwellenwerte (>1%) gemäß den Empfehlungen von Landt et al.20. Abkürzungen: FRiP = Anteil der Lesevorgänge innerhalb eines Peaks; CUT&RUN = Spaltung unter Zielen und Freisetzung mittels Nuklease. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 1: Rezepte für alle verwendeten Puffer und Lösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Bioinformatische Werkzeuge, die für die Datenanalyse-Pipeline benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: Empfohlene blockgelistete Regionen im Genom von C. albicans. Diese Liste von blockgelisteten Loci enthält in erster Linie stark repetitive Sequenzelemente und Regionen wie Telomerwiederholungen und Zentromere, die in der Vergangenheit in früheren genomweiten Bindungsexperimenten zu falsch-positiven Ergebnissen geführt haben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Dieses Protokoll stellt eine umfassende experimentelle und rechnerische Pipeline für die genomweite Lokalisierung regulatorischer TFs in C. albicans dar. Es wurde entwickelt, um für jeden mit Standard-Mikrobiologie- und Molekularbiologie-Ausbildung sehr zugänglich zu sein. Durch die Nutzung des hohen Dynamikbereichs und der geringen Anforderungen an den Probeneingang des CUT&RUN-Assays und die Einbeziehung von Optimierungen für die Lokalisierung von TF-DNA-Bindungsinteraktionen in C. albicans-Biofilm- und Planktonkulturen stellt dieses Protokoll eine leistungsstarke und kostengünstige Alternative zu herkömmlichen ChIP-seq-Ansätzen dar. Im Vergleich zu ChIP-seq ergibt CUT&RUN eine deutlich höhere Empfindlichkeit, mit einem höheren Anteil an Sequenzierungslesevorgängen, die auf gebundene Spitzen abgebildet sind, ist für hohen Durchsatz zugänglicher, erfordert wesentlich niedrigere Eingangszellenzahlen, erfordert nicht die Verwendung toxischer Vernetzungsmittel und erfordert zehnmal weniger Sequenzierungslesevorgänge pro Probe, um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erzielen13,14,17, 23,24 Um die Kosten pro Probe dieses Protokolls weiter zu senken, sind Puffer- und Medienrezepte sowie eine detaillierte Reagenzienliste enthalten, um die interne Zubereitung aller erforderlichen Puffer und Medien sowie die Massenbeschaffung wesentlicher Reagenzien zu erleichtern. Da die Biofilmbildung von C. albicans, das phänotypische Switching und der Kommensalismus alle durch komplexe, miteinander verwobene Transkriptionsnetzwerkereguliert werden 26, bietet dieses robuste, einfache und kostengünstige CUT&RUN-Protokoll ein leistungsfähiges neues Werkzeug zum Verständnis dieser und vieler anderer zellulärer Prozesse in diesem wichtigen menschlichen Pilzpathogen.

TFs sind nicht so häufig wie Histone oder andere Chromatin-assoziierte Proteine, was eine einzigartige Herausforderung für die Untersuchung von TF-DNA-Bindungsinteraktionen über CUT & RUN darstellt. Um dieser Herausforderung zu begegnen, wurden kritische Anpassungen und Optimierungen am experimentellen Standardprotokoll CUT&RUN13 vorgenommen. Da die meisten erfolgreichen CUT&RUN-Experimente, die auf TFs abzielen, eine kleine Menge DNA ergeben, die zu verdünnt ist, um sie zu quantifizieren, und oft für Fragmente kleiner als 150 bp13,23 angereichert ist, wurden die Reaktionsbedingungen für die Bibliotheksvorbereitung ebenfalls optimiert, um diese kleineren Fragmente zu begünstigen 27. Selbst mit diesem Optimierungsschritt enthalten die resultierenden PCR-amplifizierten Bibliotheken einen signifikanten Anteil an Adapterdimeren, die mit magnetischen Perlen-basierten DNA-Größenselektionsmethoden nicht vollständig entfernt werden. Um dieses Problem zu beheben, wurde ein PAGE-Gelgrößenauswahlschritt aufgenommen, um endgültige sequenzierungsbereite Bibliotheken zu generieren, die weitgehend frei von Adapterdimeren sind. Dies ist ein kritischer Schritt des Protokolls, da das Entfernen von Adapterdimeren unter Beibehaltung der kleineren TF-abgeleiteten CUT&RUN-Fragmente für qualitativ hochwertige Ergebnisse unerlässlich ist.

Darüber hinaus filtert die detaillierte Rechenpipeline die Sequenzierungsdaten, um sich auf die kleineren Lesevorgänge zu konzentrieren, die aus TF-DNA-Bindungsinteraktionen im CUT&RUN-Assay abgeleitet wurden. Aufgrund dieser TF-spezifischen Anpassungen wird dieses Protokoll nicht für die Profilierung großer Chromatin-assoziierter Komplexe wie Nukleosomen empfohlen. Während es theoretisch möglich ist, das Protokoll für diesen Zweck anzupassen, indem das Standardprotokoll zur Bibliotheksvorbereitung befolgt wird, das im kommerziell erhältlichen Bibliotheksvorbereitungskit enthalten ist, müsste der Benutzer die in der Rechenpipeline enthaltene Größenauswahl nach der Sequenzierung anpassen. Insbesondere müssten Benutzer im Abschnitt zur Größenfilterung in der Codedatei cut_n_run_pipeline.sh den aktuellen Wert "14400" (120 bp * 120 bp) durch das Quadrat der gewünschten Fragmentlänge ersetzen, damit die Analysepipeline die Sequenzierungsergebnisse analysieren kann, die für andere Arten von Chromatin-DNA-Bindungsinteraktionen generiert wurden.

Ein weiterer wichtiger Schritt in einem erfolgreichen CUT&RUN-Experiment ist die Auswahl optimaler Post-Sequencing-Datenanalyseparameter. Während der größte Teil der Rechenpipeline so konzipiert ist, dass sie standardisiert und für die Untersuchung einer regulatorischen TF von Interesse an C. albicans geeignet ist, gibt es zwei wichtige Überlegungen, die der Benutzer beim Ausführen der Pipeline bewerten sollte. Die erste Überlegung ist, ob doppelte Lesevorgänge aus den Sequenzierungsdaten vor der Identifizierung gebundener Zielsites einbezogen oder entfernt werden sollen. Da TFs mit geringer Häufigkeit in der Regel Sequenzierungsdaten liefern, die einen signifikanten Prozentsatz an Lesevorgängen enthalten, die während des Bibliotheksverstärkungsschritts aus der PCR-Duplizierung abgeleitet werden, kann das Entfernen von PCR-Duplikaten einen signifikanten negativen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Bei stark frequentierten TFs oder Chromatin-assoziierten Proteinen stellen PCR-Duplikate jedoch typischerweise einen kleineren Teil der Gesamtzahl der Lesevorgänge dar und werden häufig entfernt, um Hintergrundrauschen in den Daten zu unterdrücken. Letztendlich hängt diese Entscheidung, PCR-Duplikate beizubehalten oder zu entfernen, von der TF des Interesses und der Tiefe der erhaltenen Sequenzierungsdaten ab. So generiert die Pipeline automatisch unabhängige Ausgabedateien für Daten, die mit oder ohne PCR-Duplikatlesevorgänge abgeleitet wurden, so dass der Benutzer entscheiden kann, welche Ausgabedateien für jedes Experiment die besten Ergebnisse liefern.

Die zweite Überlegung ist, ob problematische Loci identifiziert und entfernt werden sollen, die sowohl in experimentellen (Antikörper gegen das interessierende Protein) als auch in Negativkontrollproben (IgG) eine signifikante, aber sehr variable Anreicherung ergeben. Der Peak-Calling-Algorithmus verwendet MACS2, um signifikant angereicherte Loci sowohl in der experimentellen als auch in der Kontrollstichprobe zu identifizieren, und schließt diejenigen aus, die in beiden vorkommen. Während dieser Ansatz in der Regel die meisten problematischen Loci eliminiert, erscheinen einige gelegentlich als signifikante Spitzen in bestimmten Experimenten, obwohl frühere Erfahrungen darauf hindeuten, dass es unwahrscheinlich ist, dass es sich um echte positive Orte der TF-Anreicherung handelt. Daher wird ein optionaler Filterschritt bereitgestellt, um diese problematischen Loci, die als "blocklisted" Loci bezeichnet werden, zu entfernen. Die Liste der blockgelisteten Loci enthält in erster Linie stark repetitive Sequenzelemente und -regionen wie Telomerwiederholungen und Zentromere, die in der Vergangenheit in früheren genomweiten Bindungsassays zu falsch-positiven Ergebnissen geführt haben. Dies ist eine sehr konservative Liste von Loci, die mit hoher Sicherheit als problematisch eingestuft werden. Jeder Benutzer sollte jedoch von Fall zu Fall bewerten, ob dieser Filter für seine Experimente geeignet ist. Eine mögliche Alternative zur IgG-Negativkontrolle wäre die Durchführung von CUT&RUN gegen ein nuklear lokalisiertes Protein, das keine DNA bindet. Dieser Ansatz hat sich als ideale Kontrolle für ChIP-Experimente28 erwiesen, und ein ähnlicher Ansatz ist für CUT&RUN eine Überlegung wert.

CUT&RUN ist zu einer beliebten Wahl für die Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen in höheren Eukaryoten und der Modellhefe Saccharomyces cerevisiae geworden. Hier wurde es erfolgreich angepasst, genomweite TF-DNA-Bindungsinteraktionen im klinisch relevanten Pilzpathogen C. albicans zu untersuchen. Dieses Protokoll bietet detaillierte Methoden für alle notwendigen experimentellen und rechnerischen Verfahren, vom Engineering von Dehnungen, die epitopmarkierte TFs ausdrücken, bis hin zur computergestützten Analyse der resultierenden CUT&RUN-Sequenzierungsdaten. Insgesamt erzeugen dieses Protokoll und die begleitende Datenanalyse-Pipeline robuste TF-DNA-Bindungsprofile, selbst wenn komplexe multimorphe Populationen von Zellen verwendet werden, die aus Biofilmproben mit geringer Häufigkeit isoliert wurden, und bieten eine überlegene Datenqualität zu niedrigeren Gesamtkosten als ChIP-seq-Methoden.

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Disclosures

Clarissa J. Nobile ist Mitbegründerin von BioSynesis, Inc., einem Unternehmen, das Diagnostika und Therapeutika für Biofilminfektionen entwickelt.

Acknowledgments

Wir danken allen ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern der Laboratorien Nobile und Hernday für ihr Feedback zum Manuskript. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Award Nummer R35GM124594 und von der Familie Kamangar in Form eines Stiftungslehrstuhls für C.J.N. Diese Arbeit wurde auch durch den NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Award Nummer R15AI137975 an A.D.H unterstützt.C.L.E. wurde vom NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) Fellowship Nummer F31DE028488 unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht die Ansichten der Geldgeber dar. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie; bei der Erhebung, Analyse oder Interpretation von Daten; beim Schreiben des Manuskripts; oder bei der Entscheidung, die Ergebnisse zu veröffentlichen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filter Millipore Sigma SLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubes VWR 490003-190
1 M CaCl2 Fisher Scientific 50-152-341
1 M PIPES Fisher Scientific AAJ61224AK
12-well untreated cell culture plates Corning 351143
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich 60-24-2
2% Digitonin Fisher Scientific CHR103MI
50 mL conical tubes VWR 89039-658
5x phusion HF buffer Fisher Scientific F530S Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
Agar Criterion C5001
Agencourt AMPure XP magnetic beads Beckman Coulter A63880
Agilent Bioanalyzer Agilent G2939BA Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific VWR 89133-910
Bacto peptone BD Biosciences 211677
Benchling primer design tool Benchling https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
Betaine Fisher Scientific AAJ77507AB
Calcofluor white stain Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
Candida Genome Database http://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads Polysciences  86057-3
Conda software https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl tool http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit Epicypher 14-1048 Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) New England Biolabs N0447S
Dextrose (D-glucose) Fisher Scientific D163
Difco D-mannitol  BD Biosciences 217020
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14-955-127
Disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x) Fisher Scientific R0611
DreamTaq green DNA polymerase Fisher Scientific EP0713 Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase buffer Fisher Scientific EP0713 Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNA Epicypher 18-1401
ELMI Microplate incubator ELMI TRMS-04 Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction Buffer Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proof VWR 89125-170
FastDigest MssI Fisher Scientific FD1344 Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI Buffer Fisher Scientific FD1344 Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400 Fisher BioReagents BP525-25
Fluorescence microscope User-dependent
Gel electrophoresis apparatus User-dependent
GeneRuler low range DNA ladder Fisher Scientific FERSM1192
GitBash workflow https://gitforwindows.org/
GitHub source code https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5 Boston BioProducts BBH-75-K
High-speed centrifuge User-dependent
Isopropanol Sigma-Aldrich PX1830-4
Lens paper VWR 52846-001
Ligation Enhancer Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrate MP Biomedicals 215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody Takara 632592 User-dependent
MACS2 https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes Epicypher 10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes Fisher Scientific MR02
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometer BioTek EPOCH2TC Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiView http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPS Sigma-Aldrich M3183
NaCl VWR 470302-522
NaOH Fisher Scientific S318-500
NCBI GEO https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) New England Biolabs E7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit New England Biolabs E7645S Referred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT) Goldbio N-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 well Fisher Scientific EC62755BOX
Nutating mixer VWR 82007-202
Nutrient broth Criterion C6471
pADH110 Addgene 90982 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119 Addgene 90985 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137 Addgene 90986 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139 Addgene 90987 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140 Addgene 90988 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNase Epicypher 15-1016 or 15-1116 50 rxn or 250 rxn
pCE1 Addgene 174434 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lid Fisher Scientific FB0875712
Phusion high fidelity DNA polymerase Fisher Scientific F530S Referred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350 VWR 10791-816
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kit Invitrogen Q33230
Qubit fluorometer Life Technologies Q33216 Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibody Epicypher 13-0042
RNase A Sigma-Aldrich 10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets Sigma-Aldrich 5056489001
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
Shaking incubator Eppendorf M12820004 User-dependent
Sorbitol Sigma-Aldrich S1876-500G
Spin-X centrifuge tube filters Fisher Scientific 07-200-385
Sterile inoculating loops VWR 30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stain Fisher Scientific S11494
SYTO 13 nucleic acid stain Fisher Scientific S7575 Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
Thermocycler User-dependent
ThermoMixer C Eppendorf 5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethane Sigma-Aldrich 252859-100G
Ultra II Ligation Master Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solution Invitrogen 15632011
USER Enzyme Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixer VWR 10153-834
wget tool http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
Yeast extract Criterion C7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) Fisher Scientific NC0439194

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References

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).
  3. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).
  4. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
  5. Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches. Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).
  6. Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch. Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).
  7. Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species. eLife. 10, 64682 (2021).
  8. Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).
  9. Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. Genetics and molecular biology in Candida albicans. Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).
  10. Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
  11. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
  12. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  13. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
  14. Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).
  15. Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans. American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).
  16. Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response. Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).
  17. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
  18. Skrzypek, M. S., et al. The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).
  19. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  20. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  21. Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors. BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).
  22. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  23. Homann, O. R., Johnson, A. D. MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis. BMC Biology. 8, 49 (2010).
  24. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  25. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
  26. Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).
  27. Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -C. CUT&RUNTools: a flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis. Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).
  28. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).

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Biologie Heft 182 Candida albicans CUT&RUN Transkriptionsfaktoren genomweite Bindungsmethoden transkriptionelle Regulation
Genomweite Profilierung von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen in <em>Candida albicans</em>: Eine umfassende CUT&amp;RUN-Methode und Datenanalyse-Workflow
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Qasim, M. N., Valle Arevalo, A.,… More

Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Paropkari, A. D., Ennis, C. L., Sindi, S. S., Nobile, C. J., Hernday, A. D. Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow. J. Vis. Exp. (182), e63655, doi:10.3791/63655 (2022).

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