Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Endotelcelletranscytoseanalyse som en in vitro-modell for å evaluere indre blod-retinal barrierepermeabilitet

Published: June 7, 2022 doi: 10.3791/64076
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen illustrerer en in vitro endotelcelletranscytoseanalyse som en modell for å evaluere indre blod-retinal barrierepermeabilitet ved å måle evnen til humane retinale mikrovaskulære endotelceller til å transportere pepperrotperoksidase over celler i caveolae-medierte transcellulære transportprosesser.

Abstract

Dysfunksjon av blod-retinal barrieren (BRB) bidrar til patofysiologien til flere vaskulære øyesykdommer, noe som ofte resulterer i retinal ødem og påfølgende synstap. Den indre blod-retinale barrieren (iBRB) består hovedsakelig av retinal vaskulært endotel med lav permeabilitet under fysiologiske forhold. Denne egenskapen med lav permeabilitet er tett regulert og opprettholdt av lave paracellulære transporthastigheter mellom tilstøtende retinale mikrovaskulære endotelceller, samt transcellulær transport (transcytose) gjennom dem. Vurderingen av retinal transcellulær barrierepermeabilitet kan gi grunnleggende innsikt i iBRB-integritet i helse og sykdom. I denne studien beskriver vi en endotelcelle (EC) transcytoseanalyse, som en in vitro-modell for evaluering av iBRB-permeabilitet, ved bruk av humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECs). Denne analysen vurderer HRMECs evne til å transportere transferrin og pepperrotperoksidase (HRP) i henholdsvis reseptor- og caveolaemedierte transcellulære transportprosesser. Fullt konfluerte HRMEC dyrket på porøs membran ble inkubert med fluorescerende merket transferrin (clathrin-avhengig transcytose) eller HRP (caveolae-mediert transcytose) for å måle nivåene av transferrin eller HRP overført til bunnkammeret, noe som indikerer transcytosenivåer over EC-monolaget. Wnt-signalering, en kjent vei som regulerer iBRB, ble modulert for å demonstrere caveolae-mediert HRP-basert transcytoseanalysemetode. EC-transcytoseanalysen beskrevet her kan gi et nyttig verktøy for å undersøke molekylære regulatorer av EC-permeabilitet og iBRB-integritet i vaskulære patologier og for screening av legemiddelleveringssystemer.

Introduction

Den menneskelige netthinnen er et av de høyeste energikrevende vevene i kroppen. Riktig funksjon av nevrale retina krever en effektiv tilførsel av oksygen og næringsstoffer sammen med en begrenset fluks av andre potensielt skadelige molekyler for å beskytte retinalmiljøet, som er formidlet via blod-retinal barrieren (BRB)1. I likhet med blod-hjernebarrieren (BBB) i sentralnervesystemet, virker BRB som en selektiv barriere i øyet, som regulerer bevegelsen av ioner, vann, aminosyrer og sukker inn og ut av netthinnen. BRB opprettholder også retinal homeostase og dets immunprivilegier ved å forhindre eksponering for sirkulasjonsfaktorer som immunceller, antistoffer og skadelige patogener2. BRB-dysfunksjon bidrar til patofysiologien til flere vaskulære øyesykdommer, som diabetisk retinopati, aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), retinopati av prematuritet (ROP), retinal veneokklusjon og uveitt, noe som resulterer i vasogent ødem og påfølgende synstap 3,4,5.

BRB består av to separate barrierer for henholdsvis to forskjellige okulære vaskulære nettverk: retinal vaskulatur og fenestrert choriocapillaris under netthinnen. Den indre BRB (iBRB) består hovedsakelig av retinale mikrovaskulære endotelceller (RMECs) som fôrer retinal mikrovaskulaturen, som nærer de indre retinale nevronlagene. På den annen side danner retinalpigmentepitelet hovedkomponenten i den ytre BRB, som ligger mellom neurosensorisk retina og choriocapillaris2. For iBRB foregår molekylær transport over RMEC gjennom både paracellulære og transcellulære ruter (figur 1). Den høye graden av substansselektivitet over iBRB er avhengig av (i) tilstedeværelsen av junctional proteinkomplekser som begrenser paracellulær transport mellom tilstøtende endotelceller (ECs), og (ii) lave ekspresjonsnivåer av caveolae mediatorer, transportører og reseptorer i endotelceller som opprettholder lave transcellulære transporthastigheter 1,6,7,8 . Krysskomplekser som regulerer paracellulær fluks består av tette kryss (claudiner, okkludiner), adherenskryss (VE-kadheriner) og gapkryss (connexins), noe som tillater passasje av vann og små vannløselige forbindelser. Mens små lipofile molekyler passivt diffunderer over det indre av RMEC, reguleres bevegelsen av større lipofile og hydrofile molekyler av ATP-drevne transendotelveier, inkludert vesikulær transport og membrantransportører 5,9.

Vesikulær transcytose kan kategoriseres som caveolinmediert caveolar transcytose, clathrin-avhengig (og reseptormediert) transcytose og clathrin-uavhengig makropinocytose (figur 2). Disse vesikulære transportprosessene involverer vesikler i forskjellige størrelser, med makropinosomer som de største (fra 200-500 nm) og caveolae som de minste (i gjennomsnitt 50-100 nm), mens clathrin-belagte vesikler varierer fra 70-150 nm10. Caveolae er kolbeformede lipidrike plasmamembraninvaginasjoner med et proteinbelegg, hovedsakelig sammensatt av caveolin-1 som binder lipidmembrankolesterol og andre strukturelle og signalproteiner via deres caveolin-stillasdomene11. Caveloliner arbeider sammen med perifert festet cavin for å fremme caveolae stabilisering ved plasmamembranen12. Caveolære membraner kan også bære reseptorer for andre molekyler som insulin, albumin og sirkulerende lipoproteiner, inkludert HDL (high density lipoprotein) og low-density lipoprotein (LDL) for å hjelpe bevegelsen over endotelceller13. Under utviklingen avhenger dannelsen av funksjonell BRB av undertrykkelsen av EC-transcytose8. Eldre retinal endotel har derfor relativt lave nivåer av caveolae-, caveolin-1- og albuminreseptorer med hensyn til andre endotelceller under fysiologiske forhold, noe som bidrar til barriereegenskapene 4,9.

Fordi iBRB-nedbrytning er et viktig kjennetegn ved mange patologiske øyeforhold, er det viktig å utvikle metoder for å vurdere retinal vaskulær permeabilitet in vivo og in vitro. Disse metodene bidrar til å gi sannsynlig innsikt i mekanismene for kompromittert BRB-integritet og vurdere effekten av potensielle terapeutiske mål. Nåværende in vivo-avbildning eller kvantitative vaskulære lekkasjeanalyser bruker vanligvis fluorescerende (natriumfluorescein og dextran), kolorimetrisk (Evans Blue dye og pepperrotperoksidase [HRP] substrat) eller radioaktive sporstoffer14 for å oppdage ekstravasering fra vaskulaturen til omkringliggende retinale vev med mikroskopavbildning eller i isolert vevslysat. En ideell tracer for kvantifisering av vaskulær integritet bør være inert og stor nok til fritt å gjennomsyre kompromitterte kar mens den er begrenset i sunne og intakte kapillærer. Metoder som benytter natriumfluorescein eller fluoresceinisotiocyanat-konjugert dekstran (FITC-dextran) i levende fundus fluorescein angiografi (FFA) eller isolerte retinal flate fester er mye brukt for kvantifisering av retinal ekstravasasjon in vivo eller ex vivo. FITC-dextran har fordelen av å være tilgjengelig i forskjellige molekylvekter fra 4-70 kDa for størrelsesselektive studier15,16,17. FITC-albumin (~68 kDa) er et alternativt stort proteinsporstoff av biologisk relevans for vaskulære lekkasjestudier18. Evans Blue dye, injisert intrakardialt19, retro-orbitalt, eller gjennom halevenen 20, er også avhengig av bindingen med endogent albumin for å danne et stort molekyl som kan kvantifiseres ved for det meste spektrofotometrisk deteksjon eller, mindre vanlig, fluorescensmikroskopi i flate monteringer20,21. Disse kvantitative eller lette avbildningsmetodene skiller imidlertid ofte ikke paracellulær transport fra transendoteltransport. For den spesifikke analysen av transcytose med ultrastrukturell visualisering av transcytoserte vesikler, brukes spormolekyler som HRP vanligvis til å lokalisere transcytoserte vesikler i endotelceller som kan observeres under et elektronmikroskop22,23,24 (figur 3A-C).

Utviklingen og bruken av in vitro iBRB-modeller for å evaluere endotelcellepermeabiliteten kan gi robust og høy gjennomstrømningsvurdering for å utfylle in vivo-eksperimenter og hjelpe undersøkelsen av molekylære regulatorer av vaskulær lekkasje. Vanlige analyser for å vurdere paracellulær transport og integritet av tette kryss inkluderer trans-endotelial elektrisk motstand (TEER), et mål på ionisk konduktans (figur 4) 2,25, og in vitro vaskulær lekkasjeanalyse ved bruk av fluorescerende sporstoffer med liten molekylvekt26. I tillegg har transferrinbasert transcytoseanalyse modellering BBB blitt brukt til å utforske clathrin-avhengig transcytose27. Til tross for dette er analyser for å evaluere BRB og mer spesifikt retinal EC caveolar transcytose in vitro begrenset.

I denne studien beskriver vi en EC-transcytoseanalyse ved bruk av humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECs) som en in vitro-modell for å bestemme iBRB-permeabilitet og EC-transcytose. Denne analysen er avhengig av HRMECs evne til å transportere transferrin eller HRP via henholdsvis reseptormedierte eller caveolae-avhengige transcytoseveier (figur 2). HRMEC dyrket til full konfluens i apikalkammeret (dvs. filterinnsats) ble inkubert med fluorescerende konjugert transferrin (Cy3-Tf) eller HRP for å måle fluorescensintensiteten tilsvarende nivåene av transferrin eller HRP overført til bunnkammeret gjennom EC-transcytose alene. Sammenløp av cellemonolaget kan bekreftes ved å måle TEER, noe som indikerer den tette kryssintegriteten25. For å demonstrere TEER- og transcytoseanalyseteknikken ble kjente molekylære modulatorer av vaskulær permeabilitet og EC-transcytose brukt, inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF)28 og de i Wnt-signalering (Wnt-ligander: Wnt3a og Norrin)29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Boston Children's Hospital for generering av lysmikroskopi og EM-bilder (figur 3). Protokoller for in vivo-studiene kan fås fra Wang et al.24. Alle eksperimenter som involverer humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECs) ble godkjent av Institutional Biosafety Committee (IBC) ved Boston Children's Hospital.

1. Tilberedning av reagenser

  1. Løsning for belegg av vevskulturskål: Klargjør 0,1% gelatinoppløsning ved å oppløse 1 ml gelatinpulveroppløsning (40% -50%) i 500 ml steril vevskultur klasse 1x PBS (pH = 7,4). Filtrer løsningen gjennom et 0,22 μm filter. Oppbevar 0,1% gelatinoppløsning ved 2-8 °C. Den kan lagres ved nevnte temperatur på ubestemt tid i steril tilstand.
  2. Vekstmedium: Forbered 500 ml endotelcellevekst komplett medium (EGM) ved å oppløse EGM-tilskudd i endotelcellevekstbasalmediet (EBM) i henhold til produsentens instruksjoner (materialtabell). Aliquot vekstmedium i 50 ml rør og oppbevar rørene ved 4 °C. Holdbarheten til vekstmediet er 12 måneder ved 4 °C.
  3. Trypsinoppløsning: For 0,25 % trypsin-EDTA-oppløsning, aliquot fra hetteglasset i 50 ml rør og oppbevares ved 4 °C (opptil 2 uker) eller -20 °C (opptil 24 måneder).

2. Dyrking av HRMECs

  1. Innledende cellekultur
    1. Frakkcellekultur Petriskåler (100 mm diameter x 20 mm høyde) med 5 ml 0,1% gelatinoppløsning under en laminær strømningshette og hold dem uforstyrret i hetten i 30 minutter ved romtemperatur (RT) for jevn belegg.
      MERK: Gelatinbelegg av retter forbedrer cellefesting. Alternativt kan gelatinbelagte T75 kulturflasker også brukes.
    2. Før du sådde cellene, må du aspirere gelatinoppløsningen ved hjelp av en vakuumpumpe. Vakuumtrykket til aspiratoren som ble brukt var opptil 724 mmHg.
      MERK: Aspirasjon må gjøres umiddelbart før såing av celler for å forhindre uttørking av beleggløsningen.
    3. Tine et frosset hetteglass med HRMEC (fra oppbevaring i flytende nitrogen) enten ved å bruke et vannbad ved 37 °C eller ved å tilsette et varmt vekstmedium i hetteglasset. Når den er tint, overfør cellesuspensjonen til 9 ml vekstmedium (forutsatt at tint hetteglass med HRMEC er 1 ml).
      MERK: HRMEC-ene ble kommersielt oppnådd (materialtabell). Vekstmediet som tilsettes cellene skal alltid forvarmes til 37 °C før bruk.
    4. Spinn cellene ved 200 x g i 5 minutter ved RT og aspirer supernatanten forsiktig for å unngå å fjerne cellepelleten.
    5. Resuspender cellepelleten i 10 ml vekstmedium og overfør den resulterende suspensjonen til en gelatinbelagt petriskål. Hold cellene i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2. Vanligvis er HRMECs 70% -80% sammenflytende etter 72 timer.
      MERK: Vekstmediet endres annenhver dag.
  2. Subkultur av HRMECs på permeable membraninnlegg
    1. Forbered cellekulturfilterinnsatser (6,5 mm innsatser med 0,4 μm porestørrelse polykarbonatmembran, plassert i en 24-brønnsplate) for såing av HRMEC ved å belegge hver innsats (apikalt kammer) med 200 μL 0,1% gelatinløsning i 30 minutter under en laminær strømningshette. Forsikre deg om at løsningen dekker hele bunnflaten på filterinnsatsen.
      MERK: Hver brønn har et apikalt og basolateralt kammer adskilt av en porøs membran.
    2. Ta ut petriskålen med kultiverte HRMECs (trinn 2.1.5.) fra inkubatoren og aspirer vekstmediet. Skyll forsiktig cellene 2x med 10 ml 1x PBS under en laminær strømningshette for å kvitte seg med potensielle flytende / døde celler.
    3. Dissocier cellene med 0,5-1 ml 0,25% trypsin-EDTA-løsning og plasser petriskålen i inkubatoren (37 ° C og 5% CO2) i 5 minutter.
    4. Slukk trypsinaktiviteten ved å tilsette 4,5-9 ml vekstmedier og overfør cellesuspensjonen til et 15 ml rør ved hjelp av en 10 ml pipette.
    5. Spinn cellene ved 200 x g i 5 minutter ved RT, fjern supernatanten forsiktig og resuspender pelleten i 3 ml vekstmedier.
    6. Tell antall celler ved hjelp av et manuelt hemocytometer eller en automatisert celleteller og frø med en tetthet på 4 x 104 celler per filterinnsats (dvs. 1,25 x 105 celler / cm2). Volumet av cellesuspensjon for hver innsats er 250 μL.
    7. Aspirer beleggløsningen fra brønnene som inneholder permeable innsatser og overfør 250 μL av cellesuspensjonen per innsats (apikalt kammer). Legg bare til medium (dvs. uten celler) til en av innsatsene, som vil bli brukt som en "tom kontroll" for TEER-måling. Samtidig tilsettes også 750 μL medium per brønn, i de basolaterale kamrene.
    8. Hold 24-brønnsplaten med permeable innsatser i inkubatoren (37 ° C og 5% CO 2) i 7-12 dager til de dyrkede cellene blir helt sammenflytende og ønsket TEER-verdi på ~ 20 Ω · cm2 er oppnådd.
    9. Bytt vekstmedium annenhver dag. Under medieendring, aspirer mediene nøye for å minimere forstyrrelsen av cellemonolaget og tilsett 250 μL og 750 μL ferske medier per brønn til henholdsvis apikale og basolaterale kamre.
      MERK: Vekstmedium endres for både apikale og basolaterale kamre i brønnene.

3. TEER-målinger (figur 4)

  1. På dag 14 postcellesåing (trinn 2.2.9.) måler du TEER for HRMECs ved hjelp av et epitelial volt-ohm meter (EVOM) elektrisk motstand (ER) system (Table of Materials) som følger.
  2. Forhåndslad ER-systemet og kontroller målerfunksjonaliteten ved hjelp av testelektroden STX04. Kalibrer, om nødvendig.
  3. Koble elektroden til måleren og balansere elektroden ved først å suge den i 70% etanol i 15-20 minutter og deretter nedsenke den kort i cellekulturen EGM vekstmedium.
  4. I mellomtiden holder du den celleholdige 24-brønnsplaten i den laminære strømningshetten ved RT i 15-20 minutter for temperaturbalansering.
    MERK: TEER-målinger påvirkes av temperatur, så likevektstrinnet er viktig.
  5. For TEER-måling, tilsett ferskt vekstmedium til både de apikale (250 μL) og basolaterale (750 μL) kamrene i brønnene.
  6. Utfør TEER-måling ved å senke elektroden forsiktig slik at den kortere spissen er i innsatsen og den lengre spissen berører bunnen av brønnen. Mål motstanden over den tomme kontrollen først. For hvert innlegg måler du TEER i tre eksemplarer.
    MERK: For skylling av elektroden mellom målingene brukes kulturmedier. Forsikre deg om at elektroden holdes i en 90 ° vinkel til bunnen av innsatsen for stabile avlesninger.
  7. Beregn elektrisk motstand (i Ω · cm 2) over monolaget ved hjelp av formelen, TEER = nettomotstand (Ω) x overflateareal av filterinnsats (cm2); Her er nettoresistens forskjellen mellom motstanden til hver brønn (vekstmedium med celler) og den tomme brønnen (bare vekstmedium).
  8. Utfør videre behandling av cellene først etter at TEER-verdien når ~ 20 Ω · cm2. Hvis ønsket TEER-nivå ikke nås, hold platen i inkubatoren og mål TEER dagen etter.
    MERK: HRMEC-samløp kan også valideres ved morfologisk undersøkelse av celleform (under et mikroskop) med typisk brosteinsmorfologi og/eller ved tilstedeværelse av cellekoblingsproteiner med immunhistokjemifarging separat.

4. Transcytose analyse

  1. Clathrin-mediert in vitro transcytoseanalyse ved bruk av Cy3-merket transferrin (figur 5)
    1. Ved konfluens med TEER-verdier rundt 20 Ω · cm 2, fratar serum cellene i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2 ved bruk av 0,5% FBS i EBM (serumredusert medium) i begge kamre (apikalt kammer: 250 μL og basolateralt kammer: 750 μL) før behandling med liganden. Serumredusert EBM ble brukt gjennom hele analysen.
    2. Inkuber cellene (ved hjelp av det serumreduserte mediet i trinn 4.1.1.) i apikalkammeret med fluorescerende (cyanin 3)-merket transferrinligand (Cy3-Tf) (endelig konsentrasjon på 40 μg/ml) i 60 minutter ved 37 °C.
      MERK: Plater som inneholder Cy3-Tf bør beskyttes mot lys for å unngå fotobleking av Cy3-Tf ved å pakke inn i dem aluminiumsfolie og utføre eksperimentet i en cellekulturhette med lysene slått av.
    3. Etter 1 time, legg platen på is og vask monolaget apikalt og basolateralt 4x (3-5 min per vask) med det serumreduserte mediet ved RT for å fjerne den frie ubundne Cy3-Tf.
      MERK: Vasking er viktig for å fjerne frie spormolekyler og tillate nøyaktig avlesning av transcytose uten potensiell lekkasje fra den paracellulære ruten.
    4. Tilsett ferskt serumredusert medium (som i trinn 4.1.1.) til de grundig vaskede filterinnsatsene som inneholder celler, og overfør innsatsene til friske brønner på 24-brønnsplaten som inneholder forvarmet serumredusert medium.
    5. Inkuber cellene i ytterligere 90 minutter i inkubatoren (37 ° C og 5% CO2), og samle deretter mediet fra det basolaterale kammeret.
    6. Registrer fluorescensintensiteten til løsningen fra det basolaterale kammeret ved hjelp av en fluorescensdetektor. Nivåene av fluorescensintensitet, målt som relative fluorescerende enheter (RFU), indikerer mengden Cy3-Tf-kompleks transcytosert over HRMEC-monolaget via clathrin-avhengig transcytose.
  2. Caveolae-mediert in vitro transcytoseanalyse ved bruk av HRP (figur 6)
    1. Ved full konfluens med TEER-verdier rundt 20 Ω·cm 2, fratar serum cellene i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2 ved bruk av 0,5 % FBS-holdig EBM-medium (serumredusert medium) før behandling (som i trinn 4.1.1.). Serumredusert EBM-medium ble brukt gjennom hele analysen.
    2. Behandle cellene i apikalkammeret med de ønskede behandlingene og kjøretøykontrollene.
      MERK: Her har vi brukt Wnt-modulatorer som et eksempel for å demonstrere reguleringen av caveolae-mediert transcytose ved Wnt-signalveien i HRMECs: human rekombinant Norrin og Wnt-hemmer XAV939. I et typisk eksperiment ble cellene behandlet i 24 timer i en inkubator (37 °C og 5 % CO2) med følgende konsentrasjoner: Norrin (125 ng/ml), norrin (125 ng/ml) + XAV939 (10 μM) og kjøretøystyringsløsning. I tillegg ble Wnt3a-kondisjonert medium (produsert fra L Wnt-3A-celler) også brukt.
    3. Inkuber cellene i apikalkammeret med HRP (5 mg/ml) i 15 minutter ved 37 °C.
    4. Etterpå legger du 24-brønnsplaten på is og vasker de apikale og basolaterale kamrene intensivt 6x med P-buffer (10 mM HEPES pH = 7,4, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM glukose, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) for å fjerne den frie ekstracellulære HRP.
      MERK: Vasking er viktig for å fjerne frie spormolekyler og tillate nøyaktig avlesning av transcytose uten potensiell lekkasje fra den paracellulære ruten.
    5. Tilsett ferskt serumredusert medium (som i trinn 4.1.1.) i apikalkammeret og overfør innleggene til en frisk brønn som inneholder forvarmede medier.
    6. Inkuber monolaget i ytterligere 90 minutter i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2 før du samler mediet fra det basolaterale kammeret.
    7. Til det oppsamlede mediet, tilsett 100 μL HRP fluorogent peroksidasesubstrat (materialtabell) i henhold til produsentens instruksjoner, og inkuber ved RT i 10 minutter før reaksjonen stoppes med 100 μL stoppløsning.
    8. Oppdag nivåene av HRP-substratreaksjonsprodukt i mediet ved hjelp av en fluorescensplateleser. Mål fluorescensintensiteten ved 420 nm emisjonsbølgelengde (med 325 nm eksitasjon) og som relative fluorescerende enheter (RFU). Verdiene indikerer nivået av HRP-transcytose over HRMEC-laget gjennom caveolae-mediert transcytose.
      MERK: Det fluorescerende produktet som brukes her (Materialfortegnelse) fotobleker ikke. Lysbeskyttelse mot fotobleking er ikke nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EM-bilder av retinalt vaskulært endotel viser transcytotisk vesikulær transport og huleolære vesikler i endotelceller in vivo.
EC-transcytose kan visualiseres in vivo i retinale tverrsnitt med mørkebrunt bunnfall som reflekterer HRP-holdige blodkar under et lysmikroskop (figur 3A) og som elektrontett bunnfall som indikerer HRP-holdige transcytotiske vesikler (figur 3B, C) ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop (TEM), og demonstrerer dermed EC-transcytose over iBRB. Store vesikler reflekterer potensielt makropinocytose (hvit pilspiss; Figur 3B), og små vesikler representerer sannsynligvis caveolar vesikler (hvite pilspisser; Figur 3C). Videre kan lokalisering av caveolae i retinale blodkar ses som samfarging av caveolae-markør CAV-1-antistoff med isolektin (EC-markør) i blodkaret under et fluorescensmikroskop (figur 3D). CAV-1 positive caveolar vesikler ble identifisert under TEM av immunogold-merkede CAV-1 antistoffer (svarte prikker; Figur 3E) i retinale vaskulære endotelceller. Protokoller for in vivo-studiene kan fås fra Wang et al.24.

VEGF-behandling øker vaskulær permeabilitet i HRMEC målt ved trans-endotelial elektrisk motstand (TEER)
Før du utfører EC-transcytoseanalyser, bør HRMECs dyrkes til full sammenheng, som viser karakteristisk brosteinsmorfologi, som kan observeres under et lysmikroskop. Fullcellekonfluens kan valideres ved måling av transendotelial elektrisk motstand (TEER) (figur 4A), med avlesninger som når ~ 20 Ω · cm2 for konfluent HRMECs30, noe som tyder på lave nivåer av paracellulær transport over monolaget gjennom tette eller gapkryss. Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) ble brukt som et eksempel for å demonstrere TEER-måling. Behandling av HRMEC med VEGF reduserte TEER-nivåene betydelig, noe som reflekterte økt HRMEC-permeabilitet (figur 4B). En reduksjon i TEER-verdier ble også observert i kontrollceller, potensielt på grunn av varigheten av kultur og flere målinger tatt med forskjellige tidsintervaller som kan være skadelige for celler31.

Transport av Cy3-transferrin kan benyttes til å vurdere clathrin-mediert EC-transcytose ved HRMEC
For clathrin-mediert EC-transcytose ble konfluent HRMEC dyrket på porøs membran inkubert med fluorescerende (Cy3)-merket transferrin for å oppdage transport over ECs (figur 5A). Denne analysen utnytter det faktum at transport av transferrin er en reseptormediert transcytoseprosess. Cy3-transferrin endocytose (rød) ble observert i HRMEC monolag co-farget med nukleær flekk, DAPI (blå) (figur 5B), som bekrefter opptaket i cellene. Fluorescensintensiteten til (Cy3)-merket transferrin kan kvantifiseres fra bilder for å vurdere endocytoseprosessen og/eller måles fra mediet samlet inn fra brønnens basolaterale kammer for å kvantifisere nivåene av klathrinmediert transcytose27.

Wnt-signalveien regulerer caveolae-mediert EC-transcytose på tvers av HRMEC i en HRP-basert analyse
Tidligere har det blitt funnet at Wnt-signalering regulerer MFSD2A-avhengig caveolae-mediert transcytose over retinale vaskulære ECs for å opprettholde iBRB24. Effektene av WNT-modulatorer ble evaluert i en HRP-basert in vitro transcytoseanalyse (figur 6A). Fullt konfluente HRMEC ble behandlet med Wnt-baneaktivatorer: Wnt3a-kondisjonert medium (Wnt3a-CM) eller human rekombinant Norrin, med eller uten Wnt/β-catenin-signalhemmer XAV939, og nivåene av transcytosert HRP på tvers av HRMEC ble detektert. Behandling med Wnt3a-CM eller Norrin viste signifikant reduserte nivåer av transcytosert HRP, noe som indikerer redusert caveolar transcytose. I tillegg viste kombinert behandling med WNT-signalhemmer XAV939 oppregulerte nivåer av transcytosert HRP i HRMEC, og dermed effekten av Wnt-aktivatorer på HRMEC-permeabilitet (figur 6B, C) 24.

Figure 1
Figur 1: Ulike transportveier over retinalt vaskulært endotel. Skjematisk illustrasjon som viser forskjellige ruter av molekylær fluks over retinale mikrovaskulære endotelceller (RMECs). Transport over retinale vaskulære endotelceller i den indre blod-retinale barrieren foregår via to hovedruter: paracellulære og transcellulære veier, inkludert transcytose. Denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Yemanyi et al.5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Oversikt over transcytotiske vesikulære transportveier på tvers av endotelceller og deres respektive in vitro-vurdering . I endotelceller (ECs) skjer transcellulær translokasjon av makromolekyler gjennom tre hovedtyper av vesikler: caveolar vesikler (50-100 nm), clathrin-belagte vesikler (70-150 nm) eller clathrin-uavhengige makropinosomer (200-500 nm). Caveolae er kolbeformede, sfæriske, lipidrike mikrodomener i plasmamembranen, sammensatt av caveolin og cavins. Nivåer av transcytose gjennom disse vesiklene kan bestemmes ved fluorescensbaserte in vitro-analyser i EC-kultur ved bruk av pepperrotperoksidase (HRP) kombinert med fluorescerende substrat, fluorescerende merket transferrin (Cy3-Tf) eller tetrametylrhodamin-merket bovint serumalbumin (TMR-BSA) for caveolae-mediert transcytose, clathrin-mediert transcytose og makropinocytose, henholdsvis for å evaluere indre blod-retinal barriere (iBRB) permeabilitet. Mens hver vei har forskjellige egenskaper og transportmekanismer, kan overlappende funksjon og substanstransport forekomme, spesielt mellom caveolar transport og makropinocytose, begge er clathrin-uavhengige. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Visualisering av EC-transcytose i netthinnen. (A) Lysmikroskopbilde viser et HRP-fylt blodkarlumen fra en 3 måneder gammel villtype (WT) mus retinal seksjon, farget med 3,3'-diamino benzidin (DAB) (svart). HRP ble retro-orbitalt injisert i WT-mus, etterfulgt av øyeisolering og vevsinnbygging. Tynne seksjoner ble farget med elektrontett DAB-substrat for kolorimetrisk påvisning av HRP som mørkebrunt bunnfall og avbildet under et lysmikroskop for å avsløre HRP i retinal blodkarlumen. (B,C) Prøver ble deretter videre behandlet med transmisjonselektronmikroskop (TEM) ultratynn seksjonering for å visualisere HRP-holdige transcytotiske vesikler, som viser EC-transcytose over iBRB. TEM-bilder viser en retinal del av en 3 måneder gammel WT-mus med HRP-fylt blodkar lumen og HRP-holdige vesikler i RMECs. (B) En og annen stor vesikkel reflekterer potensielt makropinosom (pilspiss) i ECs, med tilstedeværelse av røde blodlegemer (stjerne) på luminalsiden. (C) Små vesikler er sannsynligvis caveolar vesikler (pilspisser). (D) Immunhistokjemi co-farging av CAV-1 antistoff (grønn) og isolectin B 4 (IB4, rød, EC markør) demonstrerer lokalisering av CAV-1 i retinal blodkar i 3 måneder gammel WT mus retina (DAPI, blå). (E) TEM-bilde av immungold-merket CAV-1 (svarte prikker, piler) i retinal ECs; innfelt viser et forstørret bilde av en CAV-1 positiv caveolar vesikkel. Forkortelser: HRP = pepperrotperoksidase; GCL = ganglioncellelag; IPL = indre plexiform lag; INL = indre kjernefysisk lag; OPL = ytre plexiform lag; ONL = ytre kjernefysisk lag; RPE = retinal pigmentepitel; E = endotelcelle; og L = blodkar lumen. Forstørrelse: (A, D) 20x. Skala barer: (A) 50 μm, (B) 2 μm, (D) 100 μm, og (C, E) 200 nm. Panel (E) ble tilpasset med tillatelse fra Wang et al.24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Validering av fullstendig sammenflytende HRMEC og økt vaskulær permeabilitet i HRMEC etter VEGF-behandling. (A) Skjematisk diagram som viser plasseringen av elektroder i brønnenes apikale og basolaterale kamre for måling av trans-endotelial elektrisk motstand (TEER) som en vurdering av vaskulær permeabilitet og integritet av cellemonolaget. (B) Graf som viser TER-registreringer av fullt konfluerte HRMEC med og uten tidligere behandling med vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF). Behandling med VEGF etter 18 timer (18 timer) resulterer i redusert TEER ved fullt sammenflytende HRMEC31. s≤0.001. Panel (B) ble tilpasset med tillatelse fra Tomita et al.31. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Skjematisk illustrasjon av clathrinmediert EC-transcytoseanalyse i HRMEC ved bruk av transferrin (Tf). (A) HRMEC ble dyrket til full konfluens på gelatinbelagte innlegg og serum sultet over natten ved 37 °C før analyse. Cellene ble apikalt inkubert med fluorescerende Cy3-konjugert transferrin (Cy3-Tf) i 60 minutter ved 37 °C. Etter inkubasjon ble cellene vasket intensivt med et friskt medium for å fjerne ubundet ekstracellulær Cy3-Tf. Innsatsene som inneholdt ferskt medium ble deretter overført til en ny plate som inneholdt varmt medium i det basolaterale kammeret, og cellene ble inkubert ved 37 °C i ytterligere 90 minutter for å frigjøre endocytosert Cy3-Tf. Mediet fra det basolaterale kammeret kan samles, og fluorescensintensiteten som tilsvarer clathrin-avhengig (Cy3-Tf) EC-transcytose kan måles ved hjelp av en fluorescensplateleser. (B) Cy3-transferrin (rød) ble observert i HRMECs farget med DAPI (blå), som bekrefter endocytose. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Wnt-signalering regulerer caveolae-mediert HRMEC-transcytose i en in vitro HRP-basert analyse. (A) Skjematisk illustrasjon som demonstrerer HRP-basert analyse for å vurdere caveolae-mediert transcytose. Fullt sammenflytende HRMEC dyrket på gelatinbelagte innlegg ble serumsultet over natten i 0,5 % føtalt bovint serum (FBS) + EBM medium ved 37 °C før behandling. EC-monolaget i apikalkammeret ble behandlet med ønsket behandling i 24 timer ved 37 °C. Etterpå ble cellene inkubert med pepperrotperoksidase (HRP) ved 37 °C i 15 minutter og vasket intensivt for å fjerne fri ekstracellulær HRP. Innlegg med ferskt medium ble deretter overført til en ny plate med varmt medium i basolaterale kamre, og cellene ble inkubert i ytterligere 90 minutter ved 37 °C. Mediet fra det basolaterale kammeret ble samlet, og HRP-nivåene ble kvantifisert ved reaksjon med fluorogent peroksidasesubstrat. Fluorescens tilsvarende caveolae-mediert EC-transcytose ble målt ved hjelp av en fluorescensplateleser. (B,C) I dette eksemplet ble celler behandlet med Wnt-veimodulatorer: Wnt3a-kondisjonert medium (Wnt3a-CM) eller dets kontrollbetingede medium (Ctrl-CM), humant rekombinant Norrin eller dets kontrollløsning (Ctrl), og med eller uten Wnt/β-catenin-signalhemmer (XAV939) eller dets kjøretøykontroll (kjøretøy). Deres effekter på HRMEC caveolar transcytose ble evaluert i HRP-basert analyse. Etter behandling ble nivåene av HRP overført til det basolaterale kammeret målt, noe som indikerer caveolae-medierte EC-transcytosenivåer på tvers av HRMECs. WNT-aktivatorer reduserte nivåene av HRP-basert transcytose, som ble reversert av XAV939. * s≤0.05, ** s≤0.01. Panelene (B) og (C) ble tilpasset med tillatelse fra Wang et al.24. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BRB spiller en viktig rolle i retinal helse og sykdom. In vitro-teknikker som vurderer vaskulær permeabilitet har vist seg å være avgjørende verktøy i studier om utvikling og funksjon av barriere (BRB/BBB). Prosedyren beskrevet her kan brukes til å studere de molekylære mekanismene som ligger til grunn for EC-transcytose eller evaluere relaterte molekylære modulatorer som påvirker BRB-permeabilitet. In vitro EC-transcytoseanalyser har flere fordeler i forhold til in vivo-analyser eller teknikker som brukes til å evaluere vaskulær permeabilitet. De er raske å utføre med høy gjennomstrømning og kan brukes til å analysere effekten av mange forskjellige variabler eller isolerte molekyler av spesifikke signalveier med både genetisk og farmakologisk modulering. Det rene EC-kultursystemet utsletter dyrevariasjon som ofte observeres in vivo og begrenser også effekten av mulig modifikasjon eller endocytose av målmolekylene av andre celletyper32. Håndtering av HRMEC-celler er enkelt, og krever grunnleggende cellekulturutstyr tilgjengelig i de fleste laboratorier, og cellekultur er ofte mer kostnadseffektiv sammenlignet med in vivo dyreforsøk. Selv om in vitro transcytoseanalyser ikke fullt ut replikerer de in vivo fysiologiske forholdene33, kan de være verdifulle verktøy for å utfylle in vivo-studier og fremme vår kunnskap om BRB-kontroll.

Flere viktige tekniske parametere krever vurdering, inkludert porestørrelsen på filterinnsatsen, typen substratum og cellesåtettheten. En større porestørrelse på de permeable filterinnsatsene kan føre til uønsket migrasjon og vekst av celler på undersiden av innsatsen, og forvirre den resulterende målingen og dens tolkning. Selv om denne tilbøyeligheten kan variere med de forskjellige celletypene, tjener porediametre ≤1 μm godt for de fleste celletyper, inkludert ECs34. Valget av et egnet substratum er et annet avgjørende skritt fordi noen celler viser høyere polaritet og større differensiering når de dyrkes på porøst substratum og badet i et kulturmedium på begge sider35,36. Behandlede mikroporøse polykarbonatfiltre er et bedre alternativ for ECs fordi de er tynnere og gir større tilgang av reagensene til monolagets basolaterale sone med minimal bakgrunnsfluorescens for immunoassays35. Til slutt, for å oppnå et fullt sammenflytende monolag, må cellesåtettheten optimaliseres basert på den spesifikke celletypen. Mens for lav såtetthet kan påvirke differensieringstilstanden, kan for høy såtetthet derimot favorisere raskt feste celler som danner flere cellelag i stedet for et monolag, til slutt endre den cellulære morfologien og resultere i unøyaktig transcytosemåling37.

Dannelsen og integriteten til EC-monolaget er avgjørende for denne analysen og kan valideres ved å måle TEER-verdier for å sikre oppnåelse av ønsket TEER. En tom kontroll, det vil si et filterinnlegg uten celler, bør alltid inkluderes for å måle de basale nivåene av motstand over den permeable membranen som skal trekkes fra de fra celleinnlegg. Ulike faktorer som temperatur, cellepassasjenummer, sammensetning av kulturmedium, kulturvarighet og krysslengdeendringer kan alle forårsake mindre variasjoner i TEER-verdier 25,38,39. TEER-verdier påvirkes også sterkt av visse behandlinger, for eksempel VEGF. VEGF ble først oppdaget som en potent induktor av karpermeabilitet40, og påvirker vaskulær permeabilitet ved å regulere paracellulær transport, dvs. gjennom fosforylering av tette kryssproteiner ZO-1, okkludin og forstyrrelsen av tett kryssprotein claudin-5 41,42 samt transcellulær transport 43 . Ytterligere validering av monolagsdannelse kan gjøres med morfologisk undersøkelse og tilstedeværelse av karakteristiske kryssproteiner med farging. Gjennom hele kulturen anbefales det å endre medier i både apikale og basolaterale kamre med jevne mellomrom for å holde cellene i optimal kulturtilstand med det ideelle pH-området og næringstilgjengeligheten.

Forskere som bruker denne analysen, bør være oppmerksom på et kritisk iboende trekk ved hjerne- og retinale ECs: apikobasal polaritet, som er et cellulært kjennetegn for BBB44 og på samme måte BRB. Transcytoseretningen bestemmes av den relative fordelingen av proteinmålreseptorer av interesse og tilhørende transcytosemaskineri i apikale/luminale vs. basolaterale/abluminale domener i EC-membranen. Hjerne- og retinale ECer er i stand til å frigjøre mange faktorer fra både apikale / luminale og basolaterale / abluminale membraner44. Clathrin-avhengig transcytose av transferrin, interessant, ser ut til å forekomme hovedsakelig ensrettet fra blodsiden til hjernen eller netthinnen, siden transferrinreseptorer hovedsakelig er lokalisert på apikal / luminal membran45. Caveolær transcytose forekommer derimot toveis og kan stamme fra enten apikal / luminal eller basolateral / abluminal membran og over til den andre siden, avhengig av lokalisering av vesikkellast og deres reseptorer46. MFSD2A, en transmembran lipidreseptor (for omega-3 fettsyre dokosaheksaensyre) og suppressor av caveolar transcytose, er også lokalisert på apikale / luminale domener av ECs23,47. Uttrykket av MFSD2A er transkripsjonelt regulert av Wnt-signalering for å formidle dens innvirkning på BRB-kontroll, som illustrert som et eksempel i denne protokollen24. Teknikken beskrevet her innebærer derfor påvisning av et spormolekyl plassert på det øvre/apikale kammeret etter opptak av EC-monolaget og frigjøring i bunn/basolateralt kammer, som etterligner transcytose i apikal/luminal/blod til basolateral/abluminal/vevsretning. Denne protokollen kan modifiseres for å oppdage transcytose i motsatt retning ved å plassere spormolekyler i bunnkammeret og overvåke opptak og frigjøring i det apikale kammeret for å dekke behovet for etterforskere. Videre vil et ytterligere trinn for å bestemme intracellulær akkumulering/nedbrytning av det endocytoserte sporbundne målmolekylet gi ytterligere måling av transcytotiske vesikler som er igjen i cytosol32.

Den beskrevne analysen har mange fordeler og fungerer som et viktig verktøy i BRB / BBB-relaterte studier, men det er noen begrensninger. Det er et isolert system uten interaksjoner fra andre celletyper av iBRB, som pericytter og gliaceller, og kunne derfor ikke akkurat etterligne det fysiologiske in vivo-miljøet. TER-verdier kan variere mellom målinger på grunn av endring i temperatur eller posisjonering av elektrodene 25,38. Å balansere cellene fra 37 °C til romtemperatur før målinger, forsiktig håndtering av elektrodene og inkludert blanke kontroller kan imidlertid bidra til å minimere svingningen. I tillegg, selv med tilstrekkelig vask, kan lekkasje fra den paracellulære ruten, men i spormengde, ikke helt utelukkes. Overlapping av HRP-transport mellom ulike transcytoseveier, for eksempel mellom caveolar transport og makropinocytose, som begge er clathrin-uavhengige, kan også forekomme. Etter behov kan skillet undersøkes nærmere ved hjelp av spesifikke modulatorer og/eller hemmere av caveolae og mikropinocytose.

Oppsummert beskriver denne artikkelen en in vitro transcytoseanalyse som tillater kvantifisering av caveolae- eller bærermediert transcytose over BRB/BBB. In vitro-analysen kan være til stor hjelp ved screening av forskjellige pro-/antiangiogene molekyler31, signalveimodulatorer24, eller legemiddelleveringssystemer27,48 knyttet til BRB/BBB-kontroll. Undersøkelse av EC-polaritet og retningsbestemt transcytose kan også dra nytte av dette brukervennlige systemet. Med tanke på den begrensede tilgjengeligheten av in vitro-modeller for iBRB og okulær forskning, kan prosedyren som er skissert her, også modifiseres som et samkultursystem sammen med pericytter, astrocytter og 3-D organotypiske kulturer49, eller ved hjelp av avanserte cellebaserte modeller som mikrofysiologiske nevrovaskulære systemer50, for ytterligere å undersøke cellulære interaksjoner og bedre etterligne fysiologiske forhold in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter eller økonomiske interesser å opplyse om.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd (R01 EY028100, EY024963 og EY031765) til JC. ZW ble støttet av en Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , Wiley. Hoboken, NJ. 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, Pt 4 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).

Tags

Medisin utgave 184 Blod-retinal barriere caveolae endotelceller transcytose Wnt
Endotelcelletranscytoseanalyse som en <em>in vitro-modell</em> for å evaluere indre blod-retinal barrierepermeabilitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F.,… More

Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F., Maurya, M., Blomfield, A. K., Tomita, Y., Chen, J. Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (184), e64076, doi:10.3791/64076 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter