בידוד אוכלוסיות תאי גזע שקטים משרירי שלד בודדים
Summary
פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאי גזע שריריים ואבות פיברו-אדיפוגניים משרירי שלד בודדים בעכברים. הפרוטוקול כולל דיסקציה של שריר יחיד, בידוד תאי גזע על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי, הערכת טוהר על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית, ומדידה כמותית של כניסה לשלב S על ידי בדיקת שילוב 5-ethynyl-2′-deoxyuridine.
Abstract
שרירי השלד מכילים אוכלוסיות שונות של תאי גזע בוגרים התורמים להומאוסטזיס ולתיקון הרקמה. לתאי גזע של שרירי השלד (MuSCs) יש את היכולת לייצר שריר חדש, בעוד שאבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs) תורמים לרקמות תומכות סטרומה ויש להם את היכולת לייצר פיברובלסטים ואדיפוציטים. גם MuSCs וגם FAPs חיים במצב של יציאה הפיכה ממושכת של מחזור התא, הנקרא שקט. המצב השקט הוא המפתח לתפקודם. תאי גזע שקטים מטוהרים בדרך כלל מרקמות שריר מרובות המאוגדות יחד בדגימה אחת. עם זאת, מחקרים אחרונים גילו הבדלים ברורים בפרופילים המולקולריים ובעומק השקט של MuSCs שבודדו משרירים שונים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והמחקר של MuSCs ו- FAPs משרירי שלד בודדים ומציג אסטרטגיות לביצוע ניתוח מולקולרי של הפעלת תאי גזע. הוא מפרט כיצד לבודד ולעכל שרירים ממוצא התפתחותי שונה, עוביים ותפקודים, כגון הסרעפת, תלת ראשי, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), ואת שרירי Masseter. MuSCs ו- FAPs מטוהרים על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) ומנותחים על ידי צביעת immunofluorescence ובדיקת שילוב 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU).
Introduction
שרירי השלד הם בעלי יכולת התחדשות גבוהה בשל נוכחות תאי גזע שריריים (MuSCs). MuSCs ממוקמים על myofibers, מתחת למינה הבסיסית, ומתגוררים במצב שקט של מחזור תאים ממושך והפיך יציאה 1,2,3,4. עם פציעה, MuSCs מופעלים ונכנסים למחזור התא כדי ליצור אבות מגבירים שיכולים להתמיין ולהתמזג ליצירתמיופייבר 2,5 חדשים. עבודות קודמות הראו כי MuSCs חיוניים לחלוטין להתחדשות שרירים 6,7,8. יתר על כן, MuSC יחיד יכול להשתיל וליצור גם תאי גזע חדשים וגם מיוסיבים חדשים9. שרירי השלד מכילים גם אוכלוסייה של תאי סטרומה מזנכימליים הנקראים אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs), אשר ממלאים תפקיד מכריע בתמיכה בתפקוד MuSC במהלך התחדשות שרירים 6,10,11,12.
בשל הפוטנציאל שלהם לתאם התחדשות שרירים, היה עניין עצום בהבנת האופן שבו MuSCs ו- FAPs עובדים. MuSCs שקטים מסומנים על ידי ביטוי של גורמי השעתוק Pax7 ו- Sprouty1, וקולטן הקלציטונין של חלבון פני השטח של התא, בעוד ש- FAPs שקטים מסומנים על ידי קולטן גורם גדילה הנגזר מטסיות הדם של פני התא אלפא (PDGFRa)10,12,13,14,15 . מחקרים קודמים הראו כי MuSCs ו- FAPs יכולים להיות מטוהרים משרירי השלד באמצעות סמנים של פני השטח של התא ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) 9,15,16,17,18,19,20,21. בעוד פרוטוקולים אלה קידמו מאוד את היכולת לחקור MuSCs ו- FAPs, חסרון אחד הוא שרוב הפרוטוקולים הללו דורשים בידוד של MuSCs ממאגר של רקמות שריר שונות. עבודות אחרונות שלנו ושל אחרים חשפו הבדלים בפנוטיפ התא וברמות ביטוי הגנים בין MuSCs שבודדו מרקמות שונות22,23. MuSCs מהסרעפת, התלת ראשי והגרציליס מראים הפעלה מהירה יותר מאשר MuSCs משרירי הגפיים האחוריות התחתונות22, בעוד MuSCs משריר חוץ-עיני מראים התמיינות מהירה יותר מאשר MuSCs מהסרעפת ומשרירי הגפיים האחוריות התחתונות23.
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של MuSCs ו-FAPs משרירי שלד בודדים (איור 1). זה כולל את הדיסקציה של הסרעפת, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius (GA), ואת שרירי masseter. שרירים מנותחים מנותקים לאחר מכן על ידי עיכול אנזימטי באמצעות collagenase II (פרוטאז המכוון באופן ספציפי לרצף האמינו Pro-X-Gly-Pro בקולגן, המאפשר פירוק של דיסוציאציה של רקמת חיבור ורקמות24) ו dispase (פרוטאז המבקע פיברונקטין וקולגן IV, המאפשר דיסוציאציה נוספת של תאים25). MuSCs ו- FAPs מבודדים מתרחיפים של תא יחיד על ידי FACS. כדוגמאות לבדיקות במורד הזרם לניתוח תאים, הפעלת תאי גזע נקבעת על ידי שילוב 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU), בעוד טוהר התא נקבע על ידי צביעת immunofluorescence עבור סמנים ספציפיים מסוג התא Pax7 ו- PDGFRa.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר שלבים הם המפתח בביצוע פרוטוקול זה כדי להשיג תשואות טובות. לשרירים הבודדים יש נפח קטן בהשוואה לכמות השריר המשמשת בפרוטוקולי בידוד בתפזורת. התוצאה היא סיכון שהשריר יתייבש במהלך הדיסקציה, מה שמקטין את התפוקה. כדי למנוע זאת, חשוב להוסיף מדיום לשרירים מיד לאחר הדיסקציה. בנוסף, אם הדיסקציה …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מיון התאים בוצע במתקן הליבה FACS, אוניברסיטת ארהוס, דנמרק. הדמויות נוצרו באמצעות Biorender.com. אנו מודים לד”ר ג’יי פארופ על שיתוף נוגדן הארנב נגד PDGFRa. עבודה זו נתמכה על ידי מענק התחלתי של AUFF ל- E.P. ו- Start Package מ- NovoNordiskFonden ל- E.P. (0071113) ול- A.D.M. (0071116).
Materials
| 1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
| 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
| 5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
| 5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
| 50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
| Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
| F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
| Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
| MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
| Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
| Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
| Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
| Scissors | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
| Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
| Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
| Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
| Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).
- Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche. Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Uezumi, A., Fukada, S. -. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- Fukada, S. -. I., et al. Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle. Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Joe, A., Wang, J., Rossi, F. Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle. Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).
- Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).
- Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).
- de Morree, A., et al. Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function. Science. 366 (6466), 734-738 (2019).
- Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).
- Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities. Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).
- Liou, Y. -. R., Wang, Y. -. H., Lee, C. -. Y., Li, P. -. C. Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles. PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).
- Brett, J. O., et al. Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1. Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).
- Tabula Muris Consortium. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
- de Morrée, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).
