개별 골격근에서 정지 줄기 세포 집단의 분리
Summary
이 프로토콜은 마우스의 개별 골격근에서 근육 줄기 세포와 섬유 지방 생성 전구체의 분리를 설명합니다. 이 프로토콜에는 단일 근육 해부, 형광 활성화 세포 분류에 의한 줄기 세포 분리, 면역형광 염색에 의한 순도 평가, 5-ethynyl-2′-deoxyuridine 혼입 분석에 의한 S상 진입의 정량적 측정이 포함됩니다.
Abstract
골격근은 조직의 항상성과 복구에 기여하는 뚜렷한 성체 줄기 세포 집단을 가지고 있습니다. 골격근 줄기 세포(MuSC)는 새로운 근육을 만드는 능력이 있는 반면, 섬유 지방 생성 전구세포(FAP)는 기질 지지 조직에 기여하고 섬유아세포와 지방 세포를 만드는 능력이 있습니다. MuSC와 FAP는 모두 정지라고 하는 장기간의 가역적 세포 주기 종료 상태에 있습니다. 정지 상태는 기능의 핵심입니다. 정지 줄기 세포는 일반적으로 단일 샘플에 함께 모인 여러 근육 조직에서 정제됩니다. 그러나 최근 연구에서는 다른 근육에서 분리된 MuSC의 분자 프로파일과 정지 깊이에서 뚜렷한 차이가 있음이 밝혀졌습니다. 현재 프로토콜은 개별 골격근에서 MuSC 및 FAP의 분리 및 연구를 설명하고 줄기 세포 활성화의 분자 분석을 수행하기 위한 전략을 제시합니다. 횡격막, 삼두근, 그라실리스, 전경골근(TA), 비복근(GA), 가자미근, 장신근(EDL) 및 교근과 같은 다양한 발달 기원, 두께 및 기능의 근육을 분리하고 소화하는 방법을 자세히 설명합니다. MuSC 및 FAP는 형광-활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 정제되고, 면역형광 염색 및 5-에티닐-2′-데옥시우리딘 (EdU) 혼입 분석에 의해 분석된다.
Introduction
골격근은 근육 줄기 세포(MuSC)의 존재로 인해 재생 능력이 높습니다. MuSC는 기저층 아래의 근섬유에 위치하며 1,2,3,4번 출구로 나오는 장기간의 가역적 세포 주기의 정지 상태에 있습니다. 손상 시 MuSC는 활성화되고 세포 주기에 들어가 분화 및 융합하여 새로운 근섬유를 형성할 수 있는 증폭 전구체를 생성합니다 2,5. 이전 연구에서는 MuSC가 근육 재생에 절대적으로 필수적이라는 것을 보여주었습니다 6,7,8. 또한, 단일 MuSC는 새로운 줄기세포와 새로운 근섬유를 생착시켜 생성할 수 있다9. 골격근은 또한 섬유 지방 생성 전구 세포 (FAPs)라고 불리는 중간 엽 기질 세포 집단을 보유하고 있으며, 이는 근육 재생동안 MuSC 기능을 지원하는 데 중요한 역할을합니다 6,10,11,12.
근육 재생을 조정할 수 있는 잠재력으로 인해 MuSC와 FAP의 작동 방식을 이해하는 데 엄청난 관심이 있었습니다. 정지 MuSC는 전사 인자 Pax7 및 Sprouty1 및 세포 표면 단백질 칼시토닌 수용체의 발현으로 표시되는 반면, 정지 FAP는 세포 표면 단백질 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRa)10,12,13,14,15에 의해 표시됩니다. 이전 연구에서는 MuSC 및 FAP가 세포 표면 마커 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)9,15,16,17,18,19,20,21을 사용하여 골격근에서 정제될 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 프로토콜은 MuSC 및 FAP를 연구하는 능력을 크게 향상시켰지만 한 가지 단점은 이러한 프로토콜의 대부분이 서로 다른 근육 조직 풀에서 MuSC를 분리해야 한다는 것입니다. 우리와 다른 사람들의 최근 연구는 다른 조직에서 분리된 MuSC 간의 세포 표현형과 유전자 발현 수준의 차이를 밝혀냈습니다22,23. 횡격막, 삼두근 및 흉근의 MuSC는 하부 뒷다리 근육의 MuSC보다 빠른 활성화를 보이는 반면(22), 외안근의 MuSC는 횡격막과 하부 뒷다리 근육의 MuSC보다 더 빠른 분화를 보인다23.
이 프로토콜은 개별 골격근에서 MuSC 및 FAP의 분리를 설명합니다(그림 1). 여기에는 횡격막, 삼두근, 그라실리스, 전경골근(TA), 가자미근, 장신근(EDL), 비복근(GA) 및 교근의 박리가 포함됩니다. 해부된 근육은 콜라게나제 II(콜라겐의 Pro-X-Gly-Pro 아미노 서열을 특이적으로 표적으로 하여 결합 조직의 분해 및 조직 해리를 가능하게 하는 프로테아제)와 디스파아제(피브로넥틴과 콜라겐 IV를 절단하여 추가 세포 해리를 가능하게 하는 프로테아제)를 사용하는 효소 분해에 의해 해리됩니다25). MuSC 및 FAP는 FACS에 의해 단일 세포 현탁액으로부터 분리된다. 세포 분석을 위한 다운스트림 분석의 예로, 줄기 세포 활성화는 5-ethynyl-2′-deoxyuridine(EdU) 혼입을 분석하여 측정하고, 세포 순도는 세포 유형 특이적 마커인 Pax7 및 PDGFRa에 대한 면역형광 염색으로 측정합니다.
Protocol
본 프로토콜은 오르후스 대학교의 동물 관리 지침 및 지역 윤리 규정에 따라 수행되었습니다. 알림: 동물 실험 및 사후 설치류 샘플 취급에 대한 지역 윤리 위원회의 규정을 준수해야 합니다. 마우스는 알레르겐의 잠재적 공급원입니다. 가능한 경우 배기 환기를 켜고 알레르겐에 과도하게 노출되지 않도록 작업 공간 위에 놓으십시오. 또는 실험이 정기적으로 수행되는 경우 ?…
Representative Results
개별 골격근 분리를 위한 프로토콜(그림 2)에 따라 그라실리스, TA, EDL, GA, 가자미근, 삼두근, 교근 및 횡격막 근육을 지역 육종 프로그램에서 중단된 3마리의 스위스 수컷 이종 교배 마우스에서 분리했습니다(그림 2). 조직 해리 및 항체 염색에 이어 개별 근육의 MuSC 및 FAP를 FACS로 정제했습니다(그림 3). 염색되지 않은 샘플로 초기 ?…
Discussion
좋은 수율을 달성하기 위해 이 프로토콜을 실행하는 데 몇 가지 단계가 중요합니다. 개별 근육은 대량 격리 프로토콜에 사용되는 근육의 양에 비해 부피가 작습니다. 이로 인해 해부 중에 근육이 건조되어 수율이 감소할 위험이 있습니다. 이를 방지하려면 해부 직후 근육에 배지를 추가하는 것이 중요합니다. 또한 해부가 더 오래 걸리면 한 번에 한쪽 팔다리에서 피부를 제거하여 근육이 공기에 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
세포 분류는 덴마크 오르후스 대학교의 FACS Core Facility에서 수행되었습니다. 그림은 Biorender.com 사용하여 만들어졌습니다. 토끼 항-PDGFRa 항체를 공유해 주신 J. Farup 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 E.P.에 대한 AUFF 시작 보조금 및 NovoNordiskFonden에서 E.P. (0071113) 및 A.D.M. (0071116)에 대한 시작 패키지 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
| 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
| 5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
| 5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
| 50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
| Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
| F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
| Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
| MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
| Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
| Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
| Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
| Scissors | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
| Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
| Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
| Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
| Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).
- Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche. Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Uezumi, A., Fukada, S. -. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- Fukada, S. -. I., et al. Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle. Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Joe, A., Wang, J., Rossi, F. Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle. Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).
- Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).
- Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).
- de Morree, A., et al. Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function. Science. 366 (6466), 734-738 (2019).
- Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).
- Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities. Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).
- Liou, Y. -. R., Wang, Y. -. H., Lee, C. -. Y., Li, P. -. C. Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles. PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).
- Brett, J. O., et al. Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1. Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).
- Tabula Muris Consortium. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
- de Morrée, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).
Cite This Article
Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., de Morrée, A. Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles. J. Vis. Exp. (190), e64557, doi:10.3791/64557 (2022).