Sessiz Kök Hücre Popülasyonlarının Bireysel İskelet Kaslarından İzolasyonu
Summary
Bu protokol, kas kök hücrelerinin ve fibro-adipojenik progenitörlerin farelerde bireysel iskelet kaslarından izolasyonunu tanımlar. Protokol, tek kas diseksiyonu, floresan aktive hücre sıralama ile kök hücre izolasyonu, immünofloresan boyama ile saflık değerlendirmesi ve 5-etinil-2′-deoksiüridin dahil etme testi ile S-faz girişinin kantitatif ölçümünü içerir.
Abstract
İskelet kası, dokunun homeostazına ve onarımına katkıda bulunan yetişkin kök hücrelerin farklı popülasyonlarını barındırır. İskelet kası kök hücreleri (MuSC’ler) yeni kas yapma yeteneğine sahipken, fibro-adipojenik progenitörler (FAP’ler) stromal destek dokularına katkıda bulunur ve fibroblastlar ve adipositler yapma yeteneğine sahiptir. Hem MuSC’ler hem de FAP’lar, sessizlik adı verilen uzun süreli geri dönüşümlü hücre döngüsü çıkışı durumunda bulunur. Sessiz durum, işlevlerinin anahtarıdır. Sessiz kök hücreler genellikle tek bir numunede bir araya getirilen çoklu kas dokularından saflaştırılır. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan çalışmalar, farklı kaslardan izole edilen MuSC’lerin moleküler profillerinde ve sessizlik derinliğinde belirgin farklılıklar ortaya koymuştur. Bu protokol, MuSC’lerin ve FAP’ların bireysel iskelet kaslarından izolasyonunu ve çalışmasını açıklamakta ve kök hücre aktivasyonunun moleküler analizini gerçekleştirmek için stratejiler sunmaktadır. Diyafram, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastroknemius (GA), soleus, ekstansör digitorum longus (EDL) ve masseter kasları gibi farklı gelişimsel kökenli, kalınlıklı ve fonksiyonlardaki kasların nasıl izole edileceğini ve sindirileceğini ayrıntılarıyla açıklar. MuSC’ler ve FAP’lar floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ile saflaştırılır ve immünofloresan boyama ve 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) birleştirme testi ile analiz edilir.
Introduction
İskelet kası, kas kök hücrelerinin (MuSC’ler) varlığı nedeniyle yenilenme için yüksek bir kapasiteye sahiptir. MuSC’ler miyofiberler üzerinde, bazal laminanın altında bulunur ve uzamış, geri dönüşümlü hücre döngüsü çıkışı 1,2,3,4’ün sessiz bir durumunda bulunur. Yaralanma üzerine, MuSC’ler aktive olur ve yeni miyofiberler oluşturmak için farklılaşabilen ve kaynaşabilen çoğaltıcı progenitörlere yol açmak için hücre döngüsüne girer 2,5. Önceki çalışmalar, MuSC’lerin kas yenilenmesi için kesinlikle gerekli olduğunu göstermiştir 6,7,8. Dahası, tek bir MuSC hem yeni kök hücreleri hem de yeni miyofiberleri aşılayabilir ve üretebilir9. İskelet kası ayrıca, kas rejenerasyonu sırasında MuSC fonksiyonunu desteklemede çok önemli bir rol oynayan fibro-adipojenik progenitörler (FAP’ler) adı verilen mezenkimal stromal hücrelerin bir popülasyonunu barındırır 6,10,11,12.
Kas rejenerasyonunu koordine etme potansiyelleri nedeniyle, MuSC’lerin ve FAP’ların nasıl çalıştığını anlamaya büyük ilgi duyulmuştur. Sessiz MuSC’ler, transkripsiyon faktörleri Pax7 ve Sprouty1’in ve hücre yüzey proteini kalsitonin reseptörünün ekspresyonu ile işaretlenirken, sessiz FAP’lar hücre yüzeyi proteini trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü alfa (PDGFRa) 10,12,13,14,15 ile işaretlenir . Önceki çalışmalar, MuSC’lerin ve FAP’ların hücre yüzey belirteçleri ve floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) kullanılarak iskelet kaslarından saflaştırılabileceğini göstermiştir9,15,16,17,18,19,20,21. Bu protokoller MuSC’leri ve FAP’ları inceleme yeteneğini büyük ölçüde geliştirmiş olsa da, bir dezavantajı, bu protokollerin çoğunun MuSC’lerin farklı kas dokularından oluşan bir havuzdan izole edilmesini gerektirmesidir. Bizden ve diğerlerinden yapılan son çalışmalar, farklı dokulardan izole edilen MuSC’ler arasındaki hücre fenotipinde ve gen ekspresyon düzeylerinde farklılıklar olduğunu ortaya koymuştur22,23. Diyafram, triseps ve gracilisten gelen MuSC’ler, alt arka ekstremite kaslarından MuSC’lerdendaha hızlı aktivasyon gösterirken, ekstraoküler kaslardan MuSC’ler, diyaframdan ve alt arka ekstremite kaslarından MuSC’lerden daha hızlı farklılaşma gösterir23.
Bu protokol, MuSC’lerin ve FAP’ların bireysel iskelet kaslarından izolasyonunu tanımlar (Şekil 1). Buna diyafram, triseps, gracilis, tibialis anterior (TA), soleus, ekstansör digitorum longus (EDL), gastroknemius (GA) ve masseter kaslarının diseksiyonu dahildir. Disseke kaslar daha sonra kollajenaz II (kollajendeki Pro-X-Gly-Pro amino dizisini spesifik olarak hedef alan, bağ dokusunun ve doku ayrışmasının bozulmasını sağlayan bir proteaz)24) ve dispaz (fibronektin ve kollajen IV’ü parçalayan ve daha fazla hücre ayrışmasını sağlayan bir proteaz) kullanılarak enzimatik sindirim ile ayrıştırılır25). MuSC’ler ve FAP’lar, FACS tarafından tek hücreli süspansiyonlardan izole edilir. Hücre analizi için aşağı akış tahlillerine örnek olarak, kök hücre aktivasyonu 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) katılımı ile belirlenirken, hücre saflığı, hücre tipine özgü belirteçler Pax7 ve PDGFRa için immünofloresan boyaması ile belirlenir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İyi verim elde etmek için bu protokolün yürütülmesinde birkaç adım anahtardır. Bireysel kaslar, toplu izolasyon protokollerinde kullanılan kas miktarına kıyasla küçük bir hacme sahiptir. Bu, diseksiyon sırasında kasın kuruma riski ile sonuçlanır ve bu da verimi azaltır. Bunu önlemek için, diseksiyondan hemen sonra kaslara orta eklemek önemlidir. Ek olarak, diseksiyon daha uzun sürüyorsa, kasların havaya maruz kalma süresini azaltmak için cilt bir seferde bir uzuvdan çıkarılabilir. Daha kü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hücre ayıklama, Danimarka’daki Aarhus Üniversitesi, FACS Çekirdek Tesisi’nde gerçekleştirildi. Rakamlar Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Tavşan anti-PDGFRa antikorunu paylaştığı için Dr. J. Farup’a teşekkür ederiz. Bu çalışma, NovoNordiskFonden’den E.P.’ye (0071113) ve A.D.M.’ye (0071116) bir AUFF Başlangıç Hibesi ve Başlangıç Paketi hibeleri ile desteklenmiştir.
Materials
| 1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
| 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
| 5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
| 5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
| 50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
| Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
| F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
| Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
| MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
| Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
| Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
| Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
| Scissors | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
| Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
| Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
| Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
| Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).
- Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche. Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Uezumi, A., Fukada, S. -. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- Fukada, S. -. I., et al. Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle. Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Joe, A., Wang, J., Rossi, F. Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle. Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).
- Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).
- Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).
- de Morree, A., et al. Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function. Science. 366 (6466), 734-738 (2019).
- Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).
- Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities. Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).
- Liou, Y. -. R., Wang, Y. -. H., Lee, C. -. Y., Li, P. -. C. Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles. PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).
- Brett, J. O., et al. Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1. Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).
- Tabula Muris Consortium. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
- de Morrée, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).
