Выделение популяций стволовых клеток в состоянии покоя из отдельных скелетных мышц
Summary
Этот протокол описывает выделение мышечных стволовых клеток и фиброзно-адипогенных предшественников из отдельных скелетных мышц у мышей. Протокол включает в себя рассечение одной мышцы, выделение стволовых клеток путем сортировки клеток, активированных флуоресценцией, оценку чистоты путем иммунофлуоресцентного окрашивания и количественное измерение входа в S-фазу с помощью анализа включения 5-этинил-2′-дезоксиуридина.
Abstract
Скелетные мышцы содержат различные популяции взрослых стволовых клеток, которые способствуют гомеостазу и восстановлению ткани. Стволовые клетки скелетных мышц (MuSC) обладают способностью создавать новые мышцы, тогда как фиброзно-адипогенные предшественники (FAP) вносят свой вклад в стромальные поддерживающие ткани и обладают способностью создавать фибробласты и адипоциты. Как MuSC, так и FAP находятся в состоянии длительного обратимого выхода из клеточного цикла, называемого покоем. Состояние покоя является ключом к их функции. Спокойные стволовые клетки обычно очищаются от нескольких мышечных тканей, объединенных вместе в одном образце. Однако недавние исследования выявили явные различия в молекулярных профилях и глубине покоя MuSC, выделенных из разных мышц. В настоящем протоколе описывается выделение и изучение MuSC и FAP из отдельных скелетных мышц и представлены стратегии проведения молекулярного анализа активации стволовых клеток. В нем подробно описывается, как изолировать и переваривать мышцы различного происхождения развития, толщины и функций, такие как диафрагма, трицепс, грацилис, передняя большеберцовая кость (TA), икроножная мышца (GA), камбаловидная мышца, длинный разгибатель пальцев (EDL) и жевательные мышцы. MuSC и FAP очищают с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) и анализируют с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания и анализа включения 5-этинил-2′-дезоксиуридина (EdU).
Introduction
Скелетные мышцы обладают высокой способностью к регенерации благодаря наличию мышечных стволовых клеток (MuSC). MuSC расположены на миофибрах, под базальной пластинкой, и находятся в состоянии покоя с длительным обратимым выходомиз клеточного цикла 1,2,3,4. При повреждении MuSC активируются и вступают в клеточный цикл, образуя амплифицирующие предшественники, которые могут дифференцироваться и сливаться с образованием новых миоволокон 2,5. Предыдущая работа показала, что MuSC абсолютно необходимы для регенерации мышц 6,7,8. Более того, один MuSC может приживаться и генерировать как новые стволовые клетки, так и новые миоволокна9. Скелетные мышцы также содержат популяцию мезенхимальных стромальных клеток, называемых фиброадипогенными предшественниками (FAP), которые играют решающую роль в поддержке функции MuSC во время регенерации мышц 6,10,11,12.
Из-за их способности координировать регенерацию мышц существует огромный интерес к пониманию того, как работают MuSC и FAP. Покоившиеся MuSC отмечены экспрессией транскрипционных факторов Pax7 и Sprouty1, а также рецептора кальцитонина белка клеточной поверхности, тогда как покоящиеся FAP отмечены рецептором альфа-фактора роста, полученным из тромбоцитов белка клеточной поверхности (PDGFRa)10,12,13,14,15. Предыдущие исследования показали, что MuSC и FAP могут быть очищены от скелетных мышц с использованием маркеров клеточной поверхности и флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Несмотря на то, что эти протоколы значительно расширили возможности изучения MuSC и FAP, одним из недостатков является то, что большинство этих протоколов требуют выделения MuSC из пула различных мышечных тканей. Недавняя работа, проведенная нами и другими, выявила различия в фенотипе клеток и уровнях экспрессии генов между MuSC, выделенными из разных тканей22,23. MuSC диафрагмы, трицепса и грацилиса демонстрируют более быструю активацию, чем MuSC из мышц нижних задних конечностей 22, в то время как MuSC из экстраокулярной мышцы демонстрируют более быструю дифференцировку, чем MuSC из мышц диафрагмы и нижних мышцзадних конечностей23.
Этот протокол описывает выделение MuSC и FAP из отдельных скелетных мышц (рис. 1). Это включает в себя рассечение диафрагмы, трицепса, грацилиса, передней большеберцовой кости (ТА), камбаловидной мышцы, длинного разгибателя пальцев (EDL), икроножной мышцы (GA) и жевательных мышц. Рассеченные мышцы впоследствии диссоциируют путем ферментативного расщепления с использованием коллагеназы II (протеаза, которая специфически нацелена на аминокислотную последовательность Pro-X-Gly-Pro в коллагене, обеспечивая деградацию соединительной ткани и диссоциациютканей 24) и диспазу (протеаза, которая расщепляет фибронектин и коллаген IV, обеспечивая дальнейшую диссоциациюклеток 25). MuSC и FAP выделяются из одноклеточных суспензий с помощью FACS. В качестве примеров последующих анализов для клеточного анализа активация стволовых клеток определяется путем анализа включения 5-этинил-2′-дезоксиуридина (EdU), в то время как чистота клеток определяется иммунофлуоресцентным окрашиванием для специфических маркеров клеточного типа Pax7 и PDGFRa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несколько шагов являются ключевыми в выполнении этого протокола для достижения хороших урожаев. Отдельные мышцы имеют небольшой объем по сравнению с количеством мышц, используемых в протоколах объемной изоляции. Это приводит к риску высыхания мышц во время рассечения, что снижает уро…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Сортировка клеток проводилась на базовом объекте FACS, Орхусский университет, Дания. Фигуры были созданы с помощью Biorender.com. Мы благодарим доктора J. Farup за то, что он поделился антителом кролика против PDGFRa. Эта работа была поддержана стартовым грантом AUFF для E.P. и грантами Start Package от NovoNordiskFonden для E.P. (0071113) и A.D.M. (0071116).
Materials
| 1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
| 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
| 5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
| 5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
| 50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
| Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
| F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
| Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
| MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
| Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
| Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
| Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
| Scissors | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
| Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
| Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
| Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
| Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).
- Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche. Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Uezumi, A., Fukada, S. -. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- Fukada, S. -. I., et al. Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle. Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Joe, A., Wang, J., Rossi, F. Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle. Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).
- Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).
- Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).
- de Morree, A., et al. Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function. Science. 366 (6466), 734-738 (2019).
- Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).
- Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities. Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).
- Liou, Y. -. R., Wang, Y. -. H., Lee, C. -. Y., Li, P. -. C. Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles. PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).
- Brett, J. O., et al. Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1. Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).
- Tabula Muris Consortium. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
- de Morrée, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).
