Isolamento de Populações de Células-Tronco Quiescentes de Músculos Esqueléticos Individuais
Summary
Este protocolo descreve o isolamento de células-tronco musculares e progenitores fibroadipogênicos de músculos esqueléticos individuais em camundongos. O protocolo envolve dissecção muscular única, isolamento de células-tronco por classificação de células ativadas por fluorescência, avaliação da pureza por coloração de imunofluorescência e medição quantitativa da entrada da fase S pelo ensaio de incorporação de 5-etinil-2′-desoxiuridina.
Abstract
O músculo esquelético abriga populações distintas de células-tronco adultas que contribuem para a homeostase e reparo do tecido. As células-tronco musculares esqueléticas (MuSCs) têm a capacidade de produzir novos músculos, enquanto os progenitores fibroadipogênicos (FAPs) contribuem para os tecidos de suporte estromais e têm a capacidade de produzir fibroblastos e adipócitos. Tanto MuSCs quanto FAPs residem em um estado de saída prolongada e reversível do ciclo celular, chamado quiescência. O estado quiescente é fundamental para sua função. As células-tronco quiescentes são comumente purificadas a partir de múltiplos tecidos musculares agrupados em uma única amostra. No entanto, estudos recentes têm revelado diferenças distintas nos perfis moleculares e na profundidade de quiescência de MuSCs isolados de diferentes músculos. O presente protocolo descreve o isolamento e estudo de MuSCs e FAPs de músculos esqueléticos individuais e apresenta estratégias para realizar análise molecular da ativação de células-tronco. Ele detalha como isolar e digerir músculos de diferentes origens de desenvolvimento, espessuras e funções, como diafragma, tríceps, grácil, tibial anterior (TA), gastrocnêmio (GA), sóleo, extensor longo dos dedos (EDL) e músculos masseteres. MuSCs e FAPs são purificados por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e analisados por coloração de imunofluorescência e ensaio de incorporação de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU).
Introduction
O músculo esquelético tem uma alta capacidade de regeneração devido à presença de células-tronco musculares (MuSCs). As MuSCs localizam-se nas miofibras, abaixo da lâmina basal, e residem em estado quiescente de saída prolongada e reversível do ciclo celular 1,2,3,4. Após a lesão, as MuSCs ativam-se e entram no ciclo celular para dar origem a progenitores amplificadores que podem se diferenciar e fundir-se para formar novas miofibras 2,5. Trabalhos anteriores mostraram que as CTms são absolutamente essenciais para a regeneração muscular 6,7,8. Além disso, uma única MuSC pode enxertar e gerar tanto novas células-tronco quanto novas miofibras9. O músculo esquelético também abriga uma população de células estromais mesenquimais denominadas progenitores fibroadipogênicos (PAFs), que desempenham papel crucial no suporte da função de MuSC durante a regeneração muscular 6,10,11,12.
Devido ao seu potencial para coordenar a regeneração muscular, tem havido um enorme interesse em entender como MuSCs e FAPs funcionam. MuSCs quiescentes são marcadas pela expressão dos fatores de transcrição Pax7 e Sprouty1 e do receptor de calcitonina da proteína de superfície celular, enquanto as FAPs quiescentes são marcadas pelo receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas da proteína de superfície celular (PDGFRa)10,12,13,14,15 . Estudos prévios mostraram que MuSCs e FAPs poderiam ser purificados de músculos esqueléticos usando marcadores de superfície celular e classificação celular ativada por fluorescência (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Embora esses protocolos tenham avançado muito a capacidade de estudar MuSCs e FAPs, uma desvantagem é que a maioria desses protocolos requer o isolamento de MuSCs de um pool de diferentes tecidos musculares. Trabalhos recentes nossos e de outros têm revelado diferenças no fenótipo celular e nos níveis de expressão gênica entre MuSCs isolados de diferentestecidos22,23. As CPm do diafragma, tríceps e grácil apresentam ativação mais rápida do que as CPm dos músculos dos membros posterioresinferiores 22, enquanto as CP das MuSC do músculo extraocular apresentam diferenciação mais rápida do que as CP do diafragma e dos músculos dos membros posterioresinferiores 23.
Este protocolo descreve o isolamento de MuSCs e FAPs de músculos esqueléticos individuais (Figura 1). Isso inclui a dissecção dos músculos diafragma, tríceps, grácil, tibial anterior (TA), sóleo, extensor longo dos dedos (EDL), gastrocnêmio (GA) e masseter. Os músculos dissecados são posteriormente dissociados por digestão enzimática utilizando colagenase II (protease que tem como alvo específico a sequência amino Pro-X-Gly-Pro no colágeno, possibilitando a degradação do tecido conjuntivo e dissociação tecidual24) e dispase (protease que cliva fibronectina e colágeno IV, possibilitando maior dissociação celular25). MuSCs e FAPs são isolados de suspensões de célula única por FACS. Como exemplos de ensaios a jusante para análise celular, a ativação de células-tronco é determinada pelo ensaio de incorporação de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU), enquanto a pureza celular é determinada pela coloração por imunofluorescência para os marcadores específicos de tipo celular Pax7 e PDGFRa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Várias etapas são fundamentais na execução deste protocolo para alcançar bons rendimentos. Os músculos individuais têm um volume pequeno em comparação com a quantidade de músculo utilizada em protocolos de isolamento em massa. Isso resulta em um risco de o músculo secar durante a dissecção, o que reduz o rendimento. Para evitar isso, é importante adicionar meio aos músculos imediatamente após a dissecção. Além disso, se a dissecção estiver demorando mais, a pele pode ser removida de um membro de cada…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A triagem celular foi realizada no FACS Core Facility, Universidade de Aarhus, Dinamarca. As figuras foram criadas usando Biorender.com. Agradecemos ao Dr. J. Farup por compartilhar o anticorpo anti-PDGFRa do coelho. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção inicial da AUFF para E.P. e Start Package da NovoNordiskFonden para E.P. (0071113) e para A.D.M. (0071116).
Materials
| 1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
| 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
| 5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
| 5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
| 50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
| Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
| F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
| Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
| MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
| Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
| Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
| Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
| Scissors | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
| Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
| Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
| Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
| Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
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