يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا الجذعية العضلية والأسلاف الليفية المسببة للدهون من عضلات الهيكل العظمي الفردية في الفئران. يتضمن البروتوكول تشريح عضلة واحدة ، وعزل الخلايا الجذعية عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، وتقييم النقاء عن طريق تلطيخ التألق المناعي ، والقياس الكمي لدخول المرحلة S بواسطة مقايسة دمج 5-ethynyl-2′-deoxyuridine .
تحتوي العضلات الهيكلية على مجموعات متميزة من الخلايا الجذعية البالغة التي تساهم في الاتزان الداخلي وإصلاح الأنسجة. تتمتع الخلايا الجذعية العضلية الهيكلية (MuSCs) بالقدرة على تكوين عضلات جديدة ، في حين تساهم الخلايا الجذعية الليفية (FAPs) في الأنسجة الداعمة للوحمة ولديها القدرة على صنع الخلايا الليفية والخلايا الشحمية. يتواجد كل من MuSCs و FAPs في حالة خروج دورة الخلية القابلة للانعكاس لفترات طويلة ، تسمى السكون. الحالة الهادئة هي مفتاح وظيفتها. عادة ما يتم تنقية الخلايا الجذعية الهادئة من أنسجة عضلية متعددة مجمعة معا في عينة واحدة. ومع ذلك ، فقد كشفت الدراسات الحديثة عن اختلافات واضحة في الملامح الجزيئية وعمق الهدوء من MuSCs المعزولة من العضلات المختلفة. يصف هذا البروتوكول عزل ودراسة MuSCs و FAPs من عضلات الهيكل العظمي الفردية ويقدم استراتيجيات لإجراء التحليل الجزيئي لتنشيط الخلايا الجذعية. يوضح بالتفصيل كيفية عزل وهضم العضلات ذات الأصول والسماكات والوظائف التنموية المختلفة ، مثل الحجاب الحاجز ، ثلاثية الرؤوس ، جراسيليس ، الظنبوب الأمامي (TA) ، الساق (GA) ، النعل ، الباسطة الرقمية الطويلة (EDL) ، وعضلات العضلة. يتم تنقية MuSCs و FAPs عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) وتحليلها عن طريق تلطيخ التألق المناعي ومقايسة دمج 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU).
تتمتع العضلات الهيكلية بقدرة عالية على التجدد بسبب وجود الخلايا الجذعية العضلية (MuSCs). تقع MuSCs على الألياف العضلية ، أسفل الصفيحة القاعدية ، وتقيم في حالة هادئة من خروج دورة الخلية المطولة والقابلة للانعكاس1،2،3،4. عند الإصابة ، تنشط MuSCs وتدخل دورة الخلية لتؤدي إلى تضخيم السلف التي يمكن أن تتمايز وتندمج لتشكيل ألياف عضلية جديدة 2,5. أظهر العمل السابق أن MuSCs ضرورية للغاية لتجديد العضلات6،7،8. علاوة على ذلك ، يمكن ل MuSC واحد أن ينقش ويولد خلايا جذعية جديدة وألياف عضلية جديدة9. تحتوي العضلات الهيكلية أيضا على مجموعة من الخلايا اللحمية المتوسطة تسمى الأسلاف الليفية الأمينية (FAPs) ، والتي تلعب دورا مهما في دعم وظيفة MuSC أثناء تجديد العضلات6،10،11،12.
نظرا لقدرتها على تنسيق تجديد العضلات ، كان هناك اهتمام كبير بفهم كيفية عمل MuSCs و FAPs. يتم تمييز MuSCs الهادئة بالتعبير عن عوامل النسخ Pax7 و Sprouty1 ، ومستقبلات كالسيتونين بروتين سطح الخلية ، بينما يتم تمييز FAPs الهادئة بواسطة مستقبلات عامل النمو ألفا المشتقة من الصفائح الدموية لبروتين سطح الخلية (PDGFRa)10،12،13،14،15. أظهرت الدراسات السابقة أنه يمكن تنقية MuSCs و FAPs من العضلات الهيكلية باستخدام علامات سطح الخلية وفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) 9،15،16،17،18،19،20،21. في حين أن هذه البروتوكولات قد طورت بشكل كبير القدرة على دراسة MuSCs و FAPs ، فإن أحد العيوب هو أن معظم هذه البروتوكولات تتطلب عزل MuSCs من مجموعة من الأنسجة العضلية المختلفة. كشفت الأعمال الأخيرة منا ومن آخرين عن اختلافات في النمط الظاهري للخلية ومستويات التعبير الجيني بين MuSCs المعزولة من أنسجة مختلفة22,23. تظهر MuSCs من الحجاب الحاجز وثلاثية الرؤوس والجراسيليس تنشيطا أسرع من MuSCs من عضلات الأطراف الخلفية السفلية22 ، بينما تظهر MuSCs من العضلات خارج العين تمايزا أسرع من MuSCs من الحجاب الحاجز وعضلات الأطراف الخلفيةالسفلية 23.
يصف هذا البروتوكول عزل MuSCs و FAPs من العضلات الهيكلية الفردية (الشكل 1). وهذا يشمل تشريح الحجاب الحاجز ، ثلاثية الرؤوس ، جراسيليس ، الظنبوب الأمامي (TA) ، النعل ، الباسطة الرقمية الطويلة (EDL) ، الساق (GA) ، وعضلات العضلة. يتم فصل العضلات المقطعة لاحقا عن طريق الهضم الأنزيمي باستخدام كولاجيناز II (بروتياز يستهدف على وجه التحديد تسلسل Pro-X-Gly-Pro الأميني في الكولاجين ، مما يتيح تدهور النسيج الضام وتفكك الأنسجة24) و dispase (بروتياز يشق الفبرونيكتين والكولاجين الرابع ، مما يتيح المزيد من تفكك الخلايا25). يتم عزل MuSCs و FAPs من معلقات الخلية الواحدة بواسطة FACS. كأمثلة على المقايسات النهائية لتحليل الخلايا ، يتم تحديد تنشيط الخلايا الجذعية عن طريق فحص دمج 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) ، بينما يتم تحديد نقاء الخلية عن طريق تلطيخ التألق المناعي للعلامات المحددة لنوع الخلية Pax7 و PDGFRa.
هناك عدة خطوات أساسية في تنفيذ هذا البروتوكول لتحقيق عوائد جيدة. العضلات الفردية لها حجم صغير مقارنة بكمية العضلات المستخدمة في بروتوكولات العزل السائبة. ينتج عن هذا خطر جفاف العضلات أثناء التشريح ، مما يقلل من الغلة. لمنع ذلك ، من المهم إضافة وسيط إلى العضلات مباشرة بعد التشريح. بالإضافة …
The authors have nothing to disclose.
وأجري فرز الخلايا في المرفق الأساسي لنظام مراقبة الأصول الميدانية في جامعة آرهوس، الدانمرك. تم إنشاء الأرقام باستخدام Biorender.com. نشكر الدكتور ج. فاروب على مشاركة الجسم المضاد للأرانب المضاد PDGFRa. تم دعم هذا العمل من خلال منحة بدء AUFF إلى E.P. ومنح حزمة البدء من NovoNordiskFonden إلى E.P. (0071113) وإلى A.D.M. (0071116).
1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
Scissors | FST | 14568-09 | |
Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |