عزل مجموعات الخلايا الجذعية الهادئة عن العضلات الهيكلية الفردية
Summary
يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا الجذعية العضلية والأسلاف الليفية المسببة للدهون من عضلات الهيكل العظمي الفردية في الفئران. يتضمن البروتوكول تشريح عضلة واحدة ، وعزل الخلايا الجذعية عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، وتقييم النقاء عن طريق تلطيخ التألق المناعي ، والقياس الكمي لدخول المرحلة S بواسطة مقايسة دمج 5-ethynyl-2′-deoxyuridine .
Abstract
تحتوي العضلات الهيكلية على مجموعات متميزة من الخلايا الجذعية البالغة التي تساهم في الاتزان الداخلي وإصلاح الأنسجة. تتمتع الخلايا الجذعية العضلية الهيكلية (MuSCs) بالقدرة على تكوين عضلات جديدة ، في حين تساهم الخلايا الجذعية الليفية (FAPs) في الأنسجة الداعمة للوحمة ولديها القدرة على صنع الخلايا الليفية والخلايا الشحمية. يتواجد كل من MuSCs و FAPs في حالة خروج دورة الخلية القابلة للانعكاس لفترات طويلة ، تسمى السكون. الحالة الهادئة هي مفتاح وظيفتها. عادة ما يتم تنقية الخلايا الجذعية الهادئة من أنسجة عضلية متعددة مجمعة معا في عينة واحدة. ومع ذلك ، فقد كشفت الدراسات الحديثة عن اختلافات واضحة في الملامح الجزيئية وعمق الهدوء من MuSCs المعزولة من العضلات المختلفة. يصف هذا البروتوكول عزل ودراسة MuSCs و FAPs من عضلات الهيكل العظمي الفردية ويقدم استراتيجيات لإجراء التحليل الجزيئي لتنشيط الخلايا الجذعية. يوضح بالتفصيل كيفية عزل وهضم العضلات ذات الأصول والسماكات والوظائف التنموية المختلفة ، مثل الحجاب الحاجز ، ثلاثية الرؤوس ، جراسيليس ، الظنبوب الأمامي (TA) ، الساق (GA) ، النعل ، الباسطة الرقمية الطويلة (EDL) ، وعضلات العضلة. يتم تنقية MuSCs و FAPs عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) وتحليلها عن طريق تلطيخ التألق المناعي ومقايسة دمج 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU).
Introduction
تتمتع العضلات الهيكلية بقدرة عالية على التجدد بسبب وجود الخلايا الجذعية العضلية (MuSCs). تقع MuSCs على الألياف العضلية ، أسفل الصفيحة القاعدية ، وتقيم في حالة هادئة من خروج دورة الخلية المطولة والقابلة للانعكاس1،2،3،4. عند الإصابة ، تنشط MuSCs وتدخل دورة الخلية لتؤدي إلى تضخيم السلف التي يمكن أن تتمايز وتندمج لتشكيل ألياف عضلية جديدة 2,5. أظهر العمل السابق أن MuSCs ضرورية للغاية لتجديد العضلات6،7،8. علاوة على ذلك ، يمكن ل MuSC واحد أن ينقش ويولد خلايا جذعية جديدة وألياف عضلية جديدة9. تحتوي العضلات الهيكلية أيضا على مجموعة من الخلايا اللحمية المتوسطة تسمى الأسلاف الليفية الأمينية (FAPs) ، والتي تلعب دورا مهما في دعم وظيفة MuSC أثناء تجديد العضلات6،10،11،12.
نظرا لقدرتها على تنسيق تجديد العضلات ، كان هناك اهتمام كبير بفهم كيفية عمل MuSCs و FAPs. يتم تمييز MuSCs الهادئة بالتعبير عن عوامل النسخ Pax7 و Sprouty1 ، ومستقبلات كالسيتونين بروتين سطح الخلية ، بينما يتم تمييز FAPs الهادئة بواسطة مستقبلات عامل النمو ألفا المشتقة من الصفائح الدموية لبروتين سطح الخلية (PDGFRa)10،12،13،14،15. أظهرت الدراسات السابقة أنه يمكن تنقية MuSCs و FAPs من العضلات الهيكلية باستخدام علامات سطح الخلية وفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) 9،15،16،17،18،19،20،21. في حين أن هذه البروتوكولات قد طورت بشكل كبير القدرة على دراسة MuSCs و FAPs ، فإن أحد العيوب هو أن معظم هذه البروتوكولات تتطلب عزل MuSCs من مجموعة من الأنسجة العضلية المختلفة. كشفت الأعمال الأخيرة منا ومن آخرين عن اختلافات في النمط الظاهري للخلية ومستويات التعبير الجيني بين MuSCs المعزولة من أنسجة مختلفة22,23. تظهر MuSCs من الحجاب الحاجز وثلاثية الرؤوس والجراسيليس تنشيطا أسرع من MuSCs من عضلات الأطراف الخلفية السفلية22 ، بينما تظهر MuSCs من العضلات خارج العين تمايزا أسرع من MuSCs من الحجاب الحاجز وعضلات الأطراف الخلفيةالسفلية 23.
يصف هذا البروتوكول عزل MuSCs و FAPs من العضلات الهيكلية الفردية (الشكل 1). وهذا يشمل تشريح الحجاب الحاجز ، ثلاثية الرؤوس ، جراسيليس ، الظنبوب الأمامي (TA) ، النعل ، الباسطة الرقمية الطويلة (EDL) ، الساق (GA) ، وعضلات العضلة. يتم فصل العضلات المقطعة لاحقا عن طريق الهضم الأنزيمي باستخدام كولاجيناز II (بروتياز يستهدف على وجه التحديد تسلسل Pro-X-Gly-Pro الأميني في الكولاجين ، مما يتيح تدهور النسيج الضام وتفكك الأنسجة24) و dispase (بروتياز يشق الفبرونيكتين والكولاجين الرابع ، مما يتيح المزيد من تفكك الخلايا25). يتم عزل MuSCs و FAPs من معلقات الخلية الواحدة بواسطة FACS. كأمثلة على المقايسات النهائية لتحليل الخلايا ، يتم تحديد تنشيط الخلايا الجذعية عن طريق فحص دمج 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) ، بينما يتم تحديد نقاء الخلية عن طريق تلطيخ التألق المناعي للعلامات المحددة لنوع الخلية Pax7 و PDGFRa.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك عدة خطوات أساسية في تنفيذ هذا البروتوكول لتحقيق عوائد جيدة. العضلات الفردية لها حجم صغير مقارنة بكمية العضلات المستخدمة في بروتوكولات العزل السائبة. ينتج عن هذا خطر جفاف العضلات أثناء التشريح ، مما يقلل من الغلة. لمنع ذلك ، من المهم إضافة وسيط إلى العضلات مباشرة بعد التشريح. بالإضافة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأجري فرز الخلايا في المرفق الأساسي لنظام مراقبة الأصول الميدانية في جامعة آرهوس، الدانمرك. تم إنشاء الأرقام باستخدام Biorender.com. نشكر الدكتور ج. فاروب على مشاركة الجسم المضاد للأرانب المضاد PDGFRa. تم دعم هذا العمل من خلال منحة بدء AUFF إلى E.P. ومنح حزمة البدء من NovoNordiskFonden إلى E.P. (0071113) وإلى A.D.M. (0071116).
Materials
| 1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
| 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
| 5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
| 5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
| 50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
| Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
| F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
| Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
| MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
| Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
| Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
| Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
| Scissors | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
| Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
| Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
| Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
| Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).
- Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche. Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Uezumi, A., Fukada, S. -. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- Fukada, S. -. I., et al. Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle. Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Joe, A., Wang, J., Rossi, F. Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle. Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).
- Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).
- Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).
- de Morree, A., et al. Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function. Science. 366 (6466), 734-738 (2019).
- Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).
- Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities. Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).
- Liou, Y. -. R., Wang, Y. -. H., Lee, C. -. Y., Li, P. -. C. Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles. PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).
- Brett, J. O., et al. Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1. Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).
- Tabula Muris Consortium. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
- de Morrée, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).
