यह प्रोटोकॉल चूहों में व्यक्तिगत कंकाल की मांसपेशियों से मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं और फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वजों के अलगाव का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल में एकल मांसपेशी विच्छेदन, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा स्टेम सेल अलगाव, इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा शुद्धता मूल्यांकन, और 5-एथिनिल-2′-डीऑक्सीयूरिडीन निगमन परख द्वारा एस-चरण प्रविष्टि का मात्रात्मक माप शामिल है।
कंकाल की मांसपेशी वयस्क स्टेम कोशिकाओं की अलग-अलग आबादी को आश्रय देती है जो होमियोस्टैसिस और ऊतक की मरम्मत में योगदान करती है। कंकाल की मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (एमयूएससी) में नई मांसपेशियों को बनाने की क्षमता होती है, जबकि फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वज (एफएपी) स्ट्रोमल सहायक ऊतकों में योगदान करते हैं और फाइब्रोब्लास्ट और एडिपोसाइट्स बनाने की क्षमता रखते हैं। एमयूएससी और एफएपी दोनों लंबे समय तक प्रतिवर्ती सेल चक्र निकास की स्थिति में रहते हैं, जिसे क्विसेंस कहा जाता है। क्वीसेंट स्थिति उनके कार्य की कुंजी है। क्विसेंट स्टेम कोशिकाओं को आमतौर पर एक ही नमूने में एक साथ पूल किए गए कई मांसपेशियों के ऊतकों से शुद्ध किया जाता है। हालांकि, हाल के अध्ययनों ने विभिन्न मांसपेशियों से अलग किए गए एमयूएससी के आणविक प्रोफाइल और क्वीसेंस गहराई में अलग-अलग अंतर का खुलासा किया है। वर्तमान प्रोटोकॉल व्यक्तिगत कंकाल की मांसपेशियों से एमयूएससी और एफएपी के अलगाव और अध्ययन का वर्णन करता है और स्टेम सेल सक्रियण के आणविक विश्लेषण करने के लिए रणनीतियों को प्रस्तुत करता है। यह विभिन्न विकास मूल, मोटाई और कार्यों की मांसपेशियों को अलग करने और पचाने का विवरण देता है, जैसे कि डायाफ्राम, ट्राइसेप्स, ग्रैसिलिस, टिबियल एंटीरियर (टीए), गैस्ट्रोकेनेमस (जीए), सोलस, एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल), और मासेटर मांसपेशियां। एमयूएससी और एफएपी को प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) द्वारा शुद्ध किया जाता है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग और 5-एथिनाइल-2′-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू) निगमन परख द्वारा विश्लेषण किया जाता है।
मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (एमयूएससी) की उपस्थिति के कारण कंकाल की मांसपेशियों में पुनर्जनन की उच्च क्षमता होती है। एमयूएससी बेसल लैमिना के नीचे, मायोफाइबर पर स्थित होते हैं, और लंबे समय तक, प्रतिवर्ती सेल चक्र निकास 1,2,3,4 की एक स्थिर अवस्था में रहते हैं। चोट लगने पर, एमयूएससी सक्रिय हो जाते हैं और कोशिका चक्र में प्रवेश करते हैं ताकि पूर्वजों को बढ़ाया जा सके जो अंतर कर सकते हैं और नए मायोफाइबर 2,5 बनाने के लिए फ्यूज कर सकते हैं। पिछले काम से पता चला है कि मांसपेशियों के पुनर्जनन 6,7,8 के लिए एमयूएससी बिल्कुल आवश्यक हैं। इसके अलावा, एक एकल एमयूएससी नई स्टेम कोशिकाओं और नए मायोफाइबरदोनों को एनग्राफ्ट और उत्पन्न कर सकता है। कंकाल की मांसपेशी भी फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वजों (एफएपी) नामक मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं की एक आबादी को आश्रय देती है, जो मांसपेशी पुनर्जनन 6,10,11,12 के दौरान एमयूएससी समारोह का समर्थन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है।
मांसपेशियों के पुनर्जनन को समन्वित करने की उनकी क्षमता के कारण, यह समझने में जबरदस्त रुचि रही है कि एमयूएससी और एफएपी कैसे काम करते हैं। क्यूसेंट एमयूएससी को प्रतिलेखन कारकपैक्स 7 और स्प्राउटी 1, और सेल सतह प्रोटीन कैल्सीटोनिन रिसेप्टर की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित किया जाता है, जबकि क्विसेंट एफएपी को सेल सतह प्रोटीन प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर अल्फा (पीडीजीएफआरए) 10,12,13,14,15 द्वारा चिह्नित किया जाता है।. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि सेल सतह मार्करों और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) 9,15,16,17,18,19,20,21 का उपयोग करके कंकाल की मांसपेशियों से एमयूएससी और एफएपी को शुद्ध किया जा सकता है। हालांकि इन प्रोटोकॉल ने एमयूएससी और एफएपी का अध्ययन करने की क्षमता को बहुत उन्नत किया है, एक दोष यह है कि इनमें से अधिकांश प्रोटोकॉल को विभिन्न मांसपेशियों के ऊतकों के पूल से एमयूएससी के अलगाव की आवश्यकता होती है। हमारे और अन्य लोगों के हालिया काम ने विभिन्न ऊतकों से अलग एमयूएससी के बीच सेल फेनोटाइप और जीन अभिव्यक्ति के स्तर में अंतर का खुलासा कियाहै। डायाफ्राम, ट्राइसेप्स और ग्रेसिलिस से एमयूएससी निचले हिंदलिम्ब मांसपेशियों से एमयूएससी की तुलना में तेजी से सक्रियण दिखाते हैं, जबकि एक्स्ट्राओकुलर मांसपेशी से एमयूएससी डायाफ्राम और निचले हिंदलिम्बमांसपेशियों से एमयूएससी की तुलना में तेजीसे भेदभाव दिखाते हैं।
यह प्रोटोकॉल व्यक्तिगत कंकाल की मांसपेशियों से एमयूएससी और एफएपी के अलगाव का वर्णन करता है (चित्रा 1)। इसमें डायाफ्राम, ट्राइसेप्स, ग्रैसिलिस, टिबियल एंटीरियर (टीए), सोलस, एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल), गैस्ट्रोकेनेमस (जीए), और मासेटर मांसपेशियों का विच्छेदन शामिल है। विच्छेदित मांसपेशियों को बाद में कोलेजनेस II (एक प्रोटीज जो विशेष रूप से कोलेजन में प्रो-एक्स-ग्लाइ-प्रो अमीनो अनुक्रम को लक्षित करता है, संयोजी ऊतक और ऊतक पृथक्करण24 के क्षरण को सक्षम करता है) और डिस्पेस (एक प्रोटीज जो फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन IV को रोकता है, आगे सेल पृथक्करणको सक्षम करता है) का उपयोग करके एंजाइमेटिक पाचन द्वारा अलग किया जाता है।). एमयूएससी और एफएपी को एफएसीएस द्वारा एकल-सेल निलंबन से अलग किया जाता है। सेल विश्लेषण के लिए डाउनस्ट्रीम परख के उदाहरण के रूप में, स्टेम सेल सक्रियण 5-एथिनिल-2′-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू) निगमन द्वारा निर्धारित किया जाता है, जबकि सेल शुद्धता सेल-प्रकार विशिष्ट मार्कर पैक्स 7 और पीडीजीएफआरए के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा निर्धारित की जाती है।
अच्छी पैदावार प्राप्त करने के लिए इस प्रोटोकॉल के निष्पादन में कई कदम महत्वपूर्ण हैं। थोक अलगाव प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली मांसपेशियों की मात्रा की तुलना में व्यक्तिगत मांसपेशियों में एक छोटी …
The authors have nothing to disclose.
सेल सॉर्टिंग एफएसीएस कोर सुविधा, आरहुस विश्वविद्यालय, डेनमार्क में की गई थी। Biorender.com का उपयोग करके आंकड़े बनाए गए थे। हम खरगोश एंटी-पीडीजीएफआरए एंटीबॉडी साझा करने के लिए डॉ जे फारुप को धन्यवाद देते हैं। इस काम को ईपी के लिए एयूएफएफ शुरुआती अनुदान और नोवोनॉर्डिस्क फोन्डेन से ईपी (0071113) और एडीएम (0071116) को स्टार्ट पैकेज अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
Scissors | FST | 14568-09 | |
Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |