Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

HPLC בשילוב עם טביעת אצבע כימית לזיהוי תבניות מרובות לזיהוי האותנטיות של קלמטידיס ארמנדי קאולי

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64690
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2, 2, 2, 1
1School of Pharmacy, The Second Class Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmaceutics, National Administration of Traditional Chinese Medicine, Chengdu Medical College, 2Pengzhou Second People's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), בשילוב עם זיהוי רב-תבניות של טביעות אצבע כימיות, המספק אסטרטגיה חדשה לזיהוי יעיל של הזנים האמיתיים של Clematidis Armandii Caulis וחומרי הניאוף שלו.

Abstract

שיטה לזיהוי חומרי מרפא סיניים וחומרי הניאוף הקשורים אליהם נבנתה על ידי לקיחת Clematidis Armandii Caulis (צ'ואנמוטונג, רפואה סינית מסורתית בשימוש אוניברסלי) כדוגמה. עשר אצוות של זני צ'ואנמוטונג מקוריים וחמש אצוות של ניאוף קשורים נותחו והושוו בהתבסס על טביעות האצבע של הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים (HPLC) בשילוב עם כימומטריה, כולל ניתוח אשכולות (CA), ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) וניתוח אפליה אורתוגונלית של ריבועים מינימליים (OPLS-DA). בנוסף, התוכן של β-sitosterol נקבע. טביעת האצבע הכימית של צ'ואנמוטונג הוקמה, וזוהו 12 פסגות נפוצות. הדמיון בין טביעת האצבע של 10 אצוות של זני צ'ואנמוטונג מקוריים לבין טביעת האצבע של הבקרה היה 0.910-0.989, בעוד שהדמיון בין חמש אצוות של ניאוף היה רק 0.133-0.720. בהתבסס על הפסגות הנפוצות בכרומטוגרמה, 15 אצוות של דגימות סווגו לשלוש רמות תוכן על ידי PCA, ונצברו לארבע קטגוריות על ידי CA, והשיגו הבחנה ברורה בין צ'ואנמוטונג אותנטי לבין ניאוף של צ'ואנמוטונג. יתר על כן, שבעה מרכיבים דיפרנציאליים שיכולים לזהות ביעילות צ'ואנמוטונג אותנטי וחומרי ניאוף של צ'ואנמוטונג נמצאו באמצעות OPLS-DA. תכולת β-סיטוסטרול של 10 אצוות של זני צ'ואנמוטונג מקוריים הייתה 97.53-161.56 מיקרוגרם/גרם, בעוד שתכולת β-סיטוסטרול של חמש קבוצות הניאוף הייתה שונה מאוד, ביניהן תכולת β-סיטוסטרול של Clematis peterae Hand.-Mazz. וקלמטיס גוריאנה רוקסב. ו. פינתי רהד. et Wils. היה נמוך משמעותית מזה של זנים אותנטיים של Chuanmutong. תכולת רכיבי אינדקס HPLC ושיטת זיהוי טביעות אצבע כימיות מרובות תבניות שנקבעו במחקר זה מספקות אסטרטגיה חדשה לזיהוי יעיל של חומרי מרפא סיניים אותנטיים וחומרי ניאוף קשורים.

Introduction

צ'ואנמוטונג, קאולי יבש של קלמטיס ארמנדי פראנץ'. או Clematis מונטנה Buch.-Ham., היא רפואה סינית מסורתית המשמשת בדרך כלל במרפאות 1,2,3. הוא משמש לטיפול בבעיות במתן שתן, בצקת, פצעים על הלשון והפה, ירידה בהפרשת חלב, נוקשות במפרקים וכאבי שרירים הנגרמים על ידי חום לח4. Chuanmutong תמיד הושג מזני בר, המופצים בעיקר בדרום מערב סין, במיוחד בסצ'ואן, שם ניתן למצוא את האיכות הטובה ביותר 5,6. קשה להבחין בין זנים אותנטיים לבין ניאוף קרוב שלהם בשל המאפיינים הדומים שלהם 7,8,9,10. תקן האיכות של Chuanmutong במהדורת 2020 של הפרמקופיאה הסינית קובע רק את המאפיינים, הזיהוי המיקרוסקופי וזיהוי השכבה הדקה ללא קביעת תוכן, שאינם יכולים לזהות ביעילות ניאוף, ולכן יש סיכונים פוטנציאליים. יתר על כן, ישנם דיווחים מעטים המשווים ומזהים צ'ואנמוטונג וצמחים קשורים. כתוצאה מכך, שיטת בקרת איכות כדי להבטיח את האותנטיות של Chuanmutong ראוי למחקר נוסף.

המרכיבים הכימיים של צ'ואנמוטונג מורכבים בעיקר מטריטרפנואידים פנטציקליים מסוג אולנאן והגליקוזידים, הפלבנואידים והחומצות האורגניותשלהם 11,12,13,14. ביניהם, חומצה אולאנולית, β-סיטוסטרול, סטיגמסטרול וארגוסטרול יש השפעות משתנות בעוצמות שונות, אשר עשוי להיות חומרים פרמקודינמיים פוטנציאליים לקידום diuresis והקלה על חנק15,16. טביעות אצבע כימיות מתקבלות על ידי הפרדה וגילוי של רכיבים כימיים רבים הכלולים בדגימות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), כרומטוגרפיית גז (GC) וכו '. אימוץ שיטות ניתוח סטטיסטיות מתאימות לניתוח המאפיינים של Chuanmutong יכול לקבוע את בקרת האיכות הכוללת ואת הזיהוי המדעי של הרפואה הסינית המסורתית17,18,19.

במחקר זה נאספו 10 אצוות של זנים אותנטיים של צ'ואנמוטונג וחמש אצוות של ניאוף. איכותם הושוותה ונותחה על ידי שיטת טביעת האצבע HPLC בשילוב עם זיהוי רב-תבניות, כולל ניתוח אשכולות (CA), ניתוח רכיבים עיקריים (PCA), ניתוח אפליה אורתוגונלית חלקית של ריבועים לפחות (OPLS-CA), וקביעת תוכן של הרכיב הפרמקודינמי. פרוטוקול זה קובע שיטה לזיהוי זנים אותנטיים עם ספציפיות גבוהה, אסטרטגיה חדשה לזיהוי מדעי של זנים אותנטיים וניאוף של חומרי מרפא סיניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שיטות לזיהוי טביעות אצבע כימיות

  1. תנאים כרומטוגרפיים
    1. מכינים את השלב הנייד אצטוניטריל (A)/מים (B). הגדר תוכנית הדרגתית באופן הבא בתוכנת HPLC: 0-20 דקות, 3% A-10%A; 20-25 דקות, 10% A-13%A; 25-65 דקות, 13% A-25%A; 65-75 דקות, 25% A-40%A; 75-76 דקות, 40% A-3%A; 76-85 דקות, 3% A-3%A.
    2. שמור על קצב הזרימה של השלב הנייד ב-1.0 מ"ל/דקה.
    3. בצע את ההפרדה הכרומטוגרפית על עמוד C18 (250 מ"מ x 4.6 מ"מ, 5 מיקרומטר) הנשמרת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    4. הגדר את נפח ההזרקה ל -10 μL.
    5. זהה את הדגימות באורך גל של 205 ננומטר.
      הערה: עבור ההגדרות הספציפיות של תנאים כרומטוגרפיים, עיין בנהלי ההפעלה של תוכנת העבודה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (טבלת חומרים).
  2. הכנת הפתרון לדוגמה
    1. טוחנים את חומרי הגלם לגודל חלקיקים אחיד על ידי העברתם דרך רשת ניילון בקוטר פנימי של 850 מיקרומטר ± 29 מיקרומטר.
    2. מניחים 2 גרם של חומר גלם הקרקע (שוקל במדויק) בתוך בקבוק חרוטי 50 מ"ל עם פקק ולהוסיף 50 מ"ל של מתנול. מניחים את הפקק על הבקבוקון ואולטרה סאונד (600 W, 40 קילוהרץ) למשך 30 דקות.
    3. לאחר מכן, מצננים את הבקבוקון לטמפרטורת החדר (RT). שקלו שוב את הדגימות, ופצו על המשקל ההתחלתי על ידי החלפת חומר המיצוי שאבד.
    4. יוצקים 4 מ"ל מתמיסת המתנול המכילה את התמציות הרפואיות לתוך בקבוק נפחי של 10 מ"ל. מוסיפים 6 מ"ל של H2O, מערבבים, ומניחים לו להסתפק במשך 10 דקות.
    5. לבסוף, סננו את הסופר-נטנט דרך קרום מסנן של 0.45 מיקרומטר והניחו אותו במצב המתנה.
  3. אימות שיטות זיהוי טביעות אצבע
    1. הכן את הדגימה כמתואר לעיל (שלב 1.2) והכפיף אותה לניתוח HPLC (שלב 1.1) שש פעמים ביום. כדי להעריך את הדיוק, חשב את סטיית התקן היחסית (RSD) של זמן השמירה היחסי ואזורי השיא היחסיים כמתואר בשלב 1.3.5.
    2. הערך את היציבות של פתרון המדגם על-ידי ניתוח אותו פתרון מדגם המאוחסן ב- RT עבור 0, 2, 4, 6, 8, 12 ו- 24 שעות, וחשב את ה- RSD של זמן שמירה יחסי ואזורי שיא יחסיים כמתואר בשלב 1.3.5.
    3. קח שישה שכפולים של אותה דגימה (CMT-4), הכן את פתרון הדגימה בהתאם להליך לעיל (שלב 1.2), וזהה את טביעת האצבע שלו ב- HPLC לאחר שלב 1.1. חשב את ה- RSD של זמן השמירה היחסי ואזורי השיא היחסיים, והערך את יכולת החזרה שלו כמתואר בשלב 1.3.5.
    4. לאחר מכן השתמש בשיא מספר 10 באיור 1B כשיא הייחוס וחשב את ה- RSD של זמן השמירה היחסי ושטח השיא היחסי של כל שיא משותף כמתואר בשלב 1.3.5.
    5. השתמש בנוסחאות המוזכרות להלן כדי לחשב את זמן השמירה היחסי ואת שטח השיא היחסי של כל שיא משותף:
      T re = מאפיין T/Tהפניה
      A re = הפניהאופיינית/A
      כאשר T re = זמן שמירה יחסי, מאפיין T = זמן שמירת שיא אופייני, הפניה T = זמן שימור שיא ייחוס, Are = אזור שיא יחסי, מאפיין = אזור שיא אופייני, ו- A הפניה = אזור שיא ייחוס.
      הערה: הקמת טביעות אצבע של רפואה סינית מסורתית דורשת בדרך כלל בחירת שיא כרומטוגרפי קל להשגה ובעל רזולוציה גבוהה. זה משמש כשיא ייחוס לזיהוי טביעות האצבעות ולבחינת יציבותן ושכפולן.

2. הקמת טביעת אצבע צ'ואנמוטונג וניתוח דמיון

  1. השתמש ב-10 אצוות של דגימות אותנטיות ו-5 אצוות של ניאוף כגון Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. (DC), קלמטיס פטרה יד.-מאז. (DE), קלמטיס גוריאנה רוקסב. ו. פינתי רהד. et Wils (XS), ו Clematis finetiana Levl. et Vaniot. (SMT) כדגימות לניתוח טביעות אצבע.
  2. הכן את הפתרונות לדוגמה כמתואר בשלב 1.2. בצע ניתוח טביעות אצבע של כל פתרונות הדגימה על ידי HPLC בהתאם לתנאים המתוארים בשלב 1.1.
  3. ייבא את הנתונים הרלוונטיים למערכת הערכת הדמיון של טביעות אצבע כרומטוגרפיות של הרפואה הסינית המסורתית (SESCF-TCM, גרסת 2012). המערכת תגדיר את הפסגות עם גובה סביר ורזולוציה טובה בכרומטוגרמות של כל הדגימות כפסגות נפוצות.
    הערה: ניתן להוריד את תוכנת SESCF-TCM לאחר הרישום באתר האינטרנט של ועדת הפרמקופיאה הסינית (http://114.247.108.158:8888/login).
    1. בתוכנה, לחץ על הגדר ספקטרום הפניה כפתור בתפריט.
    2. לאחר מכן, בחלון הגדרות פרמטרים, הגדר את רוחב חלון הזמן ל- 0.5 ובחר שיטת יצירת ספקטרום בקרה כשיטה החציונית.
    3. לחץ על כיול מרובה נקודות בתפריט הראשי, ולאחר מכן בחר התאמת שיא כהתאמת שיא ספקטרום מלאה.
    4. לבסוף, לחץ על צור שליטה כדי ליצור את טביעת האצבע הכרומטוגרפית של המין האותנטי של Chuanmutong.
  4. יבא את זמן השמירה ואזור השיא של 10 אצוות של דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות וחמש אצוות של ניאוף לתוך SESCF-TCM לניתוח. הפעולות הספציפיות הן כדלקמן:
    1. בתוכנה, לחץ על הגדר ספקטרום הפניה כפתור בתפריט הראשי.
    2. בחלון הגדרות פרמטרים , הגדר את טביעת האצבע הכרומטוגרפית של הייחוס של המין האותנטי של Chuanmutong כהפניה, בחר בשיטת יצירת ספקטרום הבקרה כשיטה החציונית והגדר את רוחב חלון הזמן ל- 0.5.
    3. לחץ על כיול מרובה נקודות בתפריט הראשי, ולאחר מכן בחר התאמת שיא כהתאמת שיא ספקטרום מלאה.
    4. לבסוף, לחץ על חשב דמיון כדי לחשב את הדמיון בהתבסס על טביעות האצבעות הכרומטוגרמיות של צ'ואנמוטונג. לבסוף, חשב את הדמיון בין טביעות אצבע באמצעות מערכת הערכת טביעות האצבע הכרומטוגרפית של הרפואה הסינית (גרסת 2012).
      הערה: עבור הפעולות הספציפיות, עיין במפרטי ההפעלה של מערכת הערכת טביעות האצבע הכרומטוגרפית של הרפואה הסינית (גרסת 2012).

3. ניתוח זיהוי תבניות מרובות של טביעת אצבע של צ'ואנמוטונג

  1. ניתוח אשכולות (CA)
    1. השתמש באזורי השיא של 12 פסגות נפוצות בטביעות האצבע של 10 אצוות של דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות וחמש אצוות הניאוף שלהן כמשתנים, והזן אותן לתוכנת ניתוח סטטיסטית לניתוח אשכולות שיטתי (CA).
    2. בחר בשיטה ' בין קבוצות ' והשתמש במקדם המתאם של פירסון כבסיס הסיווג כדי לצייר דיאגרמת ניתוח אשכולות של צ'ואנמוטונג והניאוף שלה. הפעולות הספציפיות הן כדלקמן:
      1. בתוכנת הניתוח הסטטיסטי, לחץ על קובץ כדי לייבא נתונים.
      2. לחץ על ניתוח בתפריט ולאחר מכן לחץ על אשכולות מערכת בסיווג.
      3. בחר את אזור השיא המשותף כמשתנה, והגדר את מספר האשכולות לארבעה.
      4. לחץ על שיטה, בחר את שיטת האשכולות כחיבור בין קבוצות, בחר את מרווח המדידה כמתאם פירסון ולחץ על אישור כדי לצייר את מפת CA.
  2. ניתוח רכיבים עיקריים (PCA)
    1. ייבא את אזור השיא המשותף יחסית של הזנים האותנטיים והניאוף שלהם לתוכנת הניתוח לניתוח PCA, והשתמש במפת ציוני PCA כדי להעריך את מפת מטריצת הניקוד של הבדלי הדגימה. הפעולות הספציפיות הן כדלקמן:
      1. פתח את תוכנת ניתוח הנתונים, לחץ על קובץ בתפריט וצור פרויקט רגיל חדש. יבא את אזור השיא של 12 פסגות נפוצות בגיליון אלקטרוני (לדוגמה, תבנית Excel) ממערכת HPLC. לאחר מכן לחץ על סיום כדי להשלים את ייבוא הנתונים.
      2. לחץ על חדש כדי ליצור דגם חדש כדי להגדיר את סוג הדגם עם PCA. לחץ על התאמה אוטומטית והוסף כדי להתאים לנתונים, ולאחר מכן לחץ על ניקוד כדי לקבל את מפת ציוני PCA.
  3. ניתוח אפליה אורתוגונלית חלקית בריבועים הפחותים (OPLS-DA)
    1. השתמש בשיטת ניתוח ההבחנה החלקית הפחותה-ריבועית האורתוגונלית עם מצב פיקוח כדי לנתח עוד יותר את פסגות אזור השיא המשותף יחסית של זני צ'ואנמוטונג האותנטיים וחומרי הניאוף ולצייר מפת ציוני סיווג OPLS-DA של כל הדגימות. הפעולות הספציפיות הן כדלקמן:
      1. בתוכנת ניתוח נתונים, לחץ על קובץ בתפריט כדי לייבא קובץ וליצור פרויקט רגיל חדש. יבא את אזור השיא של 12 פסגות נפוצות בגיליון אלקטרוני ממערכת HPLC, ולאחר מכן לחץ על סיום כדי להשלים את ייבוא הנתונים.
      2. לחץ על חדש כדי ליצור דגם חדש כדי להגדיר את סוג הדגם עם PCA. לחץ על התאמה אוטומטית והוסף כדי להתאים לנתונים. לאחר מכן לחץ על ציונים כדי לקבל את מפת הציונים של PCA.
      3. לחץ על חדש ובחר חדש כמודל 1 כדי להגדיר את סוג הדגם עם OPLS-DA.
      4. לחץ על קנה מידה והגדר סוג עם Par for All. לחץ תחילה על התאמה אוטומטית ולאחר מכן לחץ על ניקוד כדי לקבל את מפת הניקוד OPLS-DA.
    2. על מנת לקבוע את ההשפעה של כל פסגה משותפת בצ'ואנמוטונג על תוצאות הסיווג שלה ואת ההבדל בין חומרי צ'ואנמוטונג אותנטיים לבין ניאוף קשור, השתמש בחשיבות המשתנה בהקרנה (VIP) לניתוח.
    3. צייר את מפת ה- VIP של המרכיבים השונים של צ'ואנמוטונג. השתמש במפת ה- VIP המתקבלת כדי להעריך את ההשפעה של כל משתנה על הסיווג ולסנן רכיבים התורמים באופן משמעותי להבדלים בין הקבוצות. הפעולות הספציפיות הן כדלקמן:
      1. בתוכנת ניתוח הנתונים, לחץ על נתח בתפריט ולחץ על תמורות, הגדר את מספר התמורות ל -200, וקבל את R 2 ו- Q 2 של מפת הניקוד OPLS-DA.
      2. לחץ על VIP ובחר VIP חיזוי כדי לקבל את מפת ה- VIP.

4. קביעת β-סיטוסטרול בצ'ואנמוטונג על ידי HPLC

  1. תנאים כרומטוגרפיים (עיין בשלב 1.1)
    1. הכינו את השלב הנייד: מתנול-מים (97:3).
    2. הגדר את קצב הזרימה של השלב הנייד ל-1.0 מ"ל/דקה.
    3. בצע את ההפרדה הכרומטוגרפית על עמוד C18 (250 מ"מ x 4.6 מ"מ, 5 מיקרומטר) הנשמרת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    4. הגדר את נפח ההזרקה ל -10 μL.
    5. זהה את הרכיב באורך גל של 204 ננומטר.
  2. הכנת הפתרון לדוגמה
    1. הכינו את התמיסה הסטנדרטית של β-סיטוסטרול (0.1 מ"ג/מ"ל) על ידי המסת כמות שנשקלה במדויק של תקן הייחוס המתאים במתנול.
    2. טוחנים את דגימת הניתוח של חומר הגלם לגודל חלקיקים אחיד על ידי העברת הדגימה דרך רשת הניילון בקוטר פנימי של 180 מיקרומטר ± 7.6 מיקרומטר.
    3. מניחים 2 גרם של חומר גלם הקרקע (במשקל מדויק) בתוך בקבוק עם תחתית עגולה ולהוסיף 50 מ"ל של כלורופורם אליו.
    4. חברו את הבקבוקון למעבה ריפלוקס וחממו אותו באמבט מים רותחים (הרתחה מתונה) למשך 60 דקות. סנן את תמיסת החילוץ באמצעות נייר סינון של 15-20 מיקרומטר.
    5. מאדים את התסנין עד כמעט יובש באמבט מים רותחים (הרתחה מתונה) למשך כ-10 דקות.
    6. ממיסים את השאריות ומרכיבים את עוצמת הקול ל-5 מ"ל באמצעות מתנול. לבסוף, להעביר את supernatant דרך קרום מסנן 0.45 מיקרומטר, והניח אותו על המתנה.
  3. אימות שיטה
    1. קח את תמיסת המלאי של β-סיטוסטרול שהוכנה בתת-שלב 4.2.1, דילל אותו עם 100% מתנול, והכן פתרונות עם 100 מיקרוגרם / מ"ל, 80 מיקרוגרם / מ"ל, 60 מיקרוגרם / מ"ל, 50 מיקרוגרם / מ"ל, 40 מיקרוגרם / מ"ל, 30 מיקרוגרם / מ"ל, ו 20 מיקרוגרם / מ"ל ריכוזים.
    2. להזריק את הדגימות בתנאים הכרומטוגרפיים המתוארים בשלב 4.1 כדי לקבוע את אזור השיא, לבצע ניתוח רגרסיה עם אזור השיא לנפח ההזרקה, ולקבל את משוואת הרגרסיה ואת מקדם המתאם כדי להעריך את הלינאריות שלה.
    3. הכן את הדגימות כמתואר לעיל (שלב 4.2) והכפיף אותן לניתוח HPLC (שלב 4.1) שש פעמים באותו יום. לאחר מכן חשב את ה- RSD של אזורי השיא כדי להעריך את הדיוק.
    4. הערך את היציבות של פתרון המדגם על-ידי ניתוח אותם פתרונות לדוגמה המאוחסנים ב- RT עבור 0, 2, 4, 6, 8, 12 ו- 24 שעות, כמתואר בשלב 4.1. לאחר מכן חשב את ה- RSD של אזורי שיא כמתואר בשלב 1.3.5.
    5. בחן את יכולת החזרה על-ידי המסת אותה דגימה (CMT-4) ב-sextuplicate, שהוכנה כמתואר בשלב 4.2, והכפפתם לניתוח HPLC כמתואר בשלב 4.1. לאחר מכן חשב את ה- RSD של תוכן β-סיטוסטרול בשש דגימות.
    6. הערך את דיוק השיטה על ידי שימוש בשיטת התוספת הסטנדרטית. לשם כך, הוסף תמיסות ייחוס β-סיטוסטרול לדגימות ב- 80%, 100% ו- 120% מתכולת β-סיטוסטרול וחזור על כל מצב שלוש פעמים כמתואר בשלב 4.1. הערך את דיוק השיטה על-ידי חישוב ההתאוששות הממוצעת וה-RSD.
      הערה: נוסחת החישוב של קצב ההתאוששות (RR) היא כדלקמן:
      RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
      כאשר M t = איכות β-סיטוסטרול לאחר הוספת התקן, M 0 = איכות תמיסת הדגימה, ו- Ms = איכות β-סיטוסטרול נוסף.
  4. קביעת תכולת β-סיטוסטרול של דוגמאות
    1. קח 10 אצוות של חומרי מרפא סיניים אותנטיים וחמש אצוות של ניאוף קשור כדי להכין פתרונות לדוגמה על פי שלב 4.2.
    2. לאחר מכן להזריק כל תמיסת דגימה ותמיסת ייחוס β-סיטוסטרול כדי לקבוע את אזור השיא בתנאים המתוארים בשלב 4.1, ולחשב את תכולת β-סיטוסטרול של כל דגימה באמצעות השיטה הסטנדרטית החיצונית של נקודה אחת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

טביעת אצבע כרומטוגרפית של צ'ואנמוטונג וניתוח דמיון (SA)
ערכי ה-RSD של זמן השמירה היחסי של דיוק, חזרתיות ויציבות היו מתחת ל-0.46%, 1.65% ו-0.53%, בהתאמה; ערכי ה-RSD של אזור השיא היחסי היו נמוכים מ-4.23%, 3.56% ו-3.96%, בהתאמה. כפי שניתן לראות באיורים 1A,B, היו 12 פסגות משותפות שונות (משיא 1 עד שיא 12) בטביעות האצבע של HPLC ב-10 דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות. מכיוון ששטח השיא של מס '10 היה גדול יחסית, הרזולוציה הייתה טובה; מכיוון שהוא היה רכיב נוכח בכל דגימה, הוא שימש כשיא ייחוס כדי לחקור את היציבות והשכפול של טביעת האצבע. לאחר מכן, שיא מס ' 10 נלקח כשיא הייחוס (S), וזמן השמירה היחסי של 11 הפסגות הנותרות חושב.

בניתוח דמיון, ככל שמקדם המתאם קרוב יותר ל-1, כך הדמיון בין הדגימות גבוה יותר. כפי שמוצג בטבלה 1, דרגות הדמיון של 10 אצוות של Chuanmutong היו 0.910-0.989. תוצאות אלה הראו כי 10 אצוות של Chuanmutong היה דמיון גבוה ועקביות טובה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להעריך את האיכות הכוללת של Chuanmutong. כפי שניתן לראות באיור 1C, התקבלו טביעות אצבעות של חמש קבוצות של נואפים. הדמיון בין טביעות האצבעות של חמש קבוצות של ניאוף לבין טביעות האצבעות של צ'ואנמוטונג היה רק 0.133-0.720 (טבלה 1), מה שמצביע על כך שיש הבדלים ברורים בין הדגימות האותנטיות לבין הניאוף הקשור. ההבדלים התרכזו בעיקר במספרי השיא הכרומטוגרפיים על הכרומטוגרמה ב-28-55 דקות. לפיכך, טביעות האצבעות של צ'ואנמוטונג יכולות להבחין ביעילות בין הדגימות האותנטיות לבין הניאוף הקשור.

התוכנה הסטטיסטית SPSS 26 שימשה לניתוח CA בניסוי זה (איור 2A); 15 קבוצות של דגימות חולקו לשתי קטגוריות כאשר מרחק הסיווג היה 20. הקטגוריה הראשונה הייתה 10 אצוות של צ'ואנמוטונג והנואפים הרגילים שלו (CC). הקטגוריה השנייה הייתה הניאוף של צ'ואנמוטונג, כולל DC, DE, XS ו-SMT. כאשר מרחק הסיווג היה ארבעה, כל הדגימות חולקו לארבע קטגוריות. הקטגוריה הראשונה הייתה 10 קבוצות של Chuanmutong, הקטגוריה השנייה הייתה CC, הקטגוריה השלישית הייתה SMT ו- XS, והקטגוריה הרביעית הייתה DC ו- DE. תוצאות הסיווג הראו כי איכות הזנים האותנטיים של Chuanmutong היה בעצם זהה, והיו הבדלים ברורים עם כל הניאוף. יחד עם זאת, בהשוואה לניאוף אחרים, CC היה קרוב יותר למגוון האותנטי של Chuanmutong, אך עדיין ניתן להבחין בו כאשר מרחק הסיווג מצטמצם.

אזורי השיא המשותפים של 15 אצוות הדגימות יובאו לתוכנת ניתוח נתונים לניתוח PCA, ומטריצת הניקוד (R 2 x = 0.994, Q2 = 0.961) (איור 2B) הראתה כי אפקט האשכולות של 15 אצוות הדגימות היה בולט. בצד ימין של ציר ה-Y היו 10 קבוצות של צ'ואנמוטונג ו-CC. ביניהם, CC היה ממוקם ברביע הראשון, אשר שונה מן הזנים האותנטיים של Chuanmutong. הצד השמאלי של ציר ה-Y היה הניאוף, כולל SMT, XS, DE ו-DC. ביניהם, SMT ו- XS היו ממוקמים ברביע השני, ו- DE ו- DC היו ממוקמים ברביע השלישי. תוך השוואת הזנים האותנטיים של צ'ואנמוטונג לבין הניאוף הקונבנציונלי, ההבדל בין CC לזנים אותנטיים הוא קטן יחסית, בעוד שההבדל בין הזנים האותנטיים לאחרים ברור.

אזור השיא המשותף של צ'ואנמוטונג והניאוף שלו שימש כמשתנה, יובא לתוכנת ניתוח הנתונים עבור OPLS-DA, ואז צוירה מטריצת הניקוד (איור 3A). R 2 x [1] של מודל OPLS-DA היה 0.695, ו- R 2 x [2] היה 0.605, שניהם גדולים מ -0.5, מה שמעיד על כך שהמודל יציב ואמין וניתן להשתמש בו כדי להבחין בין דגימות אותנטיות לבין ניאוף.

ניתן לראות מאיור 3A שנקודות הדגימה של האותנטי ושל ניאוף אחר הופרדו לחלוטין, ולא היה שום צומת בין נקודות הדגימה. כל הדגימות חולקו לשלושה חלקים. הזנים האותנטיים של צ'ואנמוטונג ו- CC היו דומים. הדגימות של XS, DC ו- DE קובצו למחלקה אחת, והמדגם של SMT היה המחלקה האחרונה. יתר על כן, שיטת השיפוט בעלת החשיבות המשתנה בהקרנה (VIP) (איור 3B) שימשה לסינון הפסגות של רכיבים שונים בטביעת האצבע של כל דגימה. VIP > 1.0 נלקח כסטנדרט לסינון משתני seveb התורמים רבות לסיווג בין קבוצות המדגם. על פי תוצאות הסינון, מרכיבי הסמן העיקריים שגרמו להבדל בהרכב בין דגימות אותנטיות לבין הניאוף היו פסגות מס '9, מס' 5, מס' 7, מס' 6, מס' 10, מס' 3 ומס' 2. ערך ה-VIP של הפסגות הנותרות היה פחות מ-1, מה שהשפיע מעט על אפליית הדגימות.

הקשר הליניארי בין אזור השיא β-סיטוסטרול לבין ריכוז התמיסה שלו נמצא באמצעות ניתוח רגרסיה. תלות זו צייתה למשוואה Y = 5.4918 X-4.5563, כאשר Y הוא אזור השיא β-סיטוסטרול ו- X הוא תכולת β-סיטוסטרול במיקרוגרם/מ"ל. במקביל, מקדם המתאם r = 0.9995, אשר עונה על הדרישות. ה-RSD של מבחן הדיוק, מבחן היציבות ומבחן החזרה היו 1.76%, 4.22% ו-3.85%, בהתאמה. התוצאות מראות כי שיטת הקביעה של תכולת β-סיטוסטרול הייתה ליניארית, דיוק וחזרתיות טובים, ותמיסת הדגימה הייתה יציבה תוך 24 שעות. אחוז ההחלמה הממוצע בשלוש רמות היה 101.50%, 101.90% ו-100.72%; ה-RSD המקביל היה 2.56%, 1.56% ו-1.68%, בהתאמה. הסכמים טובים בין ערכים תיאורטיים לערכים שנקבעו בפועל אישרו את הדיוק והישימות של השיטה לניתוח. הכרומטוגרמה הנוזלית של β-סיטוסטרול מוצגת באיור 4, ותכולת ה-β-סיטוסטרול ב-15 אצוות של דגימות נקבעה (טבלה 2). התוצאות הראו כי ריכוז β-סיטוסטרול ב-10 אצוות של דגימות אותנטיות היה בטווח של 97.53-161.56 מיקרוגרם/גרם (יציב יחסית). רכיב זה זוהה בכל חמש אצוות של ניאוף, אבל התוכן השתנה מאוד.

Figure 1
איור 1: טביעות אצבע של צ'ואנמוטונג ושל הניאוף שלהם. (A) טביעות אצבעות של 10 אצוות של דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות (S1: CMT-1, S2: CMT-2, S3: CMT-3, S4: CMT-4, S5: CMT-5, S6: CMT-6, S7: CMT-7, S8: CMT-8, S9: CMT-9, S10: CMT-10). (B) טביעות האצבע של כרומטוגרמת הייחוס של דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות; זמני השמירה היחסיים היו 0.18 (שיא מס' 1), 0.22 (שיא מס' 2), 0.29 (שיא מס' 3), 0.72 (שיא מס' 4), 0.75 (שיא מס' 5), 0.82 (שיא מס' 6), 0.86 (שיא מס' 7), 0.92 (שיא מס' 8), 0.96 (שיא מס' 9), 1.00 (שיא מס' 10), 1.02 (שיא מס' 11), 1.37 (שיא מס' 12). (C) טביעות אצבעות של חמש קבוצות של חומרי ניאוף צ'ואנמוטונג (S1: CC, S2: DC, S3: DE, S4: XS, S5: SMT). (D) השוואה בין טביעות אצבע של כרומטוגרמי ייחוס של דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות לבין חמש האצוות של חומרי הניאוף שלהן (S1: טביעות אצבע של כרומטוגרמה ייחוס, S2: CC, S3: DC, S4: DE, S5: XS, S6: SMT). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח CA ו-PCA של 10 אצוות של דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות וחמש קבוצות של חומרי ניאוף. (A) ניתוח CA. (B) ניתוח PCA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מפת הניקוד OPLS-DA ומפת הניקוד VIP של 10 אצוות של דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות וחמש קבוצות של ניאוף. (A) מפת הניקוד OPLS-DA. (B) מפת ניקוד VIP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: הכרומטוגרמה הנוזלית של β-סיטוסטרול. S1: β-סיטוסטרול, S2: CMT-4, S3: XS, S4: DC, S5: SMT, S6: CC, S7: DE. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

דגימות שם דמיון
הזנים האמיתיים של צ'ואנמוטונג CMT-1 0.947
CMT-2 0.910
CMT-3 0.989
CMT-4 0.937
CMT-5 0.989
CMT-6 0.988
CMT-7 0.956
CMT-8 0.959
CMT-9 0.939
CMT-10 0.966
ניאוף עותק 0.599
DC 0.720
דה 0.133
XS 0.694
סמ"ט 0.180

טבלה 1: תוצאות הדמיון של 10 אצוות של דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות וחומרי הניאוף שלהן. על ידי ייבוא הנתונים הרלוונטיים למערכת הערכת טביעות האצבע הכרומטוגרפית של הרפואה הסינית, חושב הדמיון בין 10 אצוות של דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות וחמש אצוות של ניאוף לאף.

דגימות שם תוכן (מיקרוגרם/גרם)
הזנים האמיתיים של צ'ואנמוטונג CMT-1 103.5
CMT-2 124.6
CMT-3 131
CMT-4 121.1
CMT-5 97.5
CMT-6 113.8
CMT-7 105.6
CMT-8 161.6
CMT-9 118
CMT-10 123.5
ניאוף עותק 157.4
DC 165.6
דה 32.9
XS 69.7
סמ"ט 192.2

טבלה 2: תוצאות קביעה של תכולת β-סיטוסטרול בדגימות צ'ואנמוטונג האותנטיות ובחומרי הניאוף שלהן.

איור משלים 1: כרומטוגרפיה נוזלית בתנאי הכנת דגימה שונים ובתנאים כרומטוגרפיים שונים. (A) מערכות הפאזה הניידת (S1: תמיסת חומצה אצטונית-0.1% פורמית, S2: תמיסת חומצה אצטונית-0.5%, S3: מים טהורים אצטוניטריל, S4: תמיסת חומצה זרחתית 0.05%, S5: מים טהורים מתנול). (B) אורכי גל הגילוי (S1: 205 ננומטר, S2: 230 ננומטר, S3: 250 ננומטר, S4: 300 ננומטר). (C) טמפרטורות העמודה (S1: 20 °C, S2: 30 °C, S3: 40 °C). (D) קצבי הזרימה (S1: 0.8 מ"ל/דקה, S2: 0.9 מ"ל/דקה, S3: 1.0 מ"ל/דקה). (E) שיטות המיצוי (S1: מיצוי על-קולי, S2: מיצוי רפלוקס). (F) ממיסי המיצוי (S1: אתיל אצטט, S2: אתנול, S3: כלורופורם, S4: n-בוטאנול, S5: מתנול). (G) זמן החילוץ (S1: 15 דקות, S2: 30 דקות, S3: 60 דקות). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: הכרומטוגרמה הנוזלית של ארגוסטרול, סטיגמסטרול וצ'ואנמוטונג אותנטי. S1: סטיגמסטרול, S2: ארגוסטרול, S3: CMT-4. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

איסוף הדגימות למחקר הוא צעד המפתח הראשון לבניית זיהוי רב-תבניות בזיהוי האותנטיות של חומרי מרפא סיניים. באמצעות מחקר שוק, מצאנו כי סצ'ואן יאן, ליאנגשאן ולשאן הם אזורי הייצור העיקריים של משאבי הבר של צ'ואנמוטונג. גם לזנים הקשורים של אותו סוג יש אותה תפוצה גיאוגרפית 6,20; CC, DC, DE, XS ו- SMT משמשים לעתים קרובות לרעה כצ'ואנגמוטונג 16,21; לכן, במחקר זה, 10 אצוות של Chuanmutong אותנטי וחמש קבוצות של דגימות מעורבות נאספו במקומות המקור הנ"ל, ואת הדיוק של הזנים אושר.

שלב המפתח השני הוא לסנן את תנאי הזיהוי של טביעת האצבע HPLC, שיכולה להציג מידע רב ככל האפשר על הרכיבים הכימיים. במחקר זה, כפי שניתן לראות באיור משלים 1, התקבלו המספר והשטח של פסגות כרומטוגרפיות בתנאי הכנה שונים, כולל שיטות המיצוי, ממיסי המיצוי וזמן המיצוי. נקבעה שיטת ההכנה האופטימלית של פתרון המדגם Chuanmutong. מאידך גיסא, הושוו מספר ורזולוציה של פסגות כרומטוגרפיות של הדגימות בתנאים כרומטוגרפיים שונים. מערכות הפאזה הניידת, כגון תמיסת חומצה אצטוניתריל-0.1% פורמית, תמיסת חומצה אצטית-0.5% אצטית, מים טהורים אצטוניטריל, תמיסת חומצה זרחתית 0.05% אצטוניטריל, ומים טהורי מתנול, אורכי הגל לגילוי, כגון 205 ננומטר, 230 ננומטר, 250 ננומטר ו-300 ננומטר, טמפרטורות העמודה, כגון 20 מעלות צלזיוס, 30 מעלות צלזיוס ו-40 מעלות צלזיוס, וקצבי הזרימה, כגון 0.8-1.0 מ"ל/דקה, נחקרו. התנאים הכרומטוגרפיים האופטימליים לניתוח הדגימות של צ'ואנמוטונג נקבעו. יתר על כן, ההיתכנות שלה אושרה על ידי אימות מתודולוגי, ואת שיטת הזיהוי של טביעת אצבע HPLC של Chuanmutong נבנה בהצלחה.

שלב המפתח השלישי הוא לנתח ולמצוא את המידע השונה בטביעות האצבע של הרפואה הסינית האותנטית ועל הניאוף שלה. במחקר זה, ראשית, הדמיון של טביעות אצבע נותח באמצעות SESCF-TCM (גרסת 2012). נמצא כי הדמיון בין טביעות האצבע של 10 אצוות של דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות לבין טביעת האצבע האופיינית לבקרה היה גבוה מאוד. לשם השוואה, הדמיון בין טביעות האצבע של חמש קבוצות של ניאוף לבין טביעת האצבע האופיינית לבקרה היה נמוך משמעותית מזה של דגימות אותנטיות. CA, PCA ו-OPLS-DA הוצגו לאחר מכן כדי לנתח את מידע השיא המשותף של טביעות האצבע הכימיות. הן תוצאות CA והן תוצאות PCA מראות כי CC הניאוף הנפוץ בקרב ניאוף שונים קרוב יחסית לזה האותנטי, שקשה להבחין בו. עם זאת, כאשר מרחק הסיווג של CA משתנה לארבעה, ניתן להשיג את הזיהוי היעיל בין האותנטי לניאוף. בהתבסס על 12 הפסגות הנפוצות של חומרים אותנטיים, ערכי התרומה של פסגות דיפרנציאליות של ניאוף הוערכו כמותית על ידי OPLS-DA, והשיגו שבע פסגות כרומטוגרפיות דיפרנציאליות, כלומר שיא מס '9, שיא מס' 5, שיא מס' 7, שיא מס' 6, שיא מס' 10, שיא מס' 3 ושיא מס' 2. אלה יכולים לשמש כדי לזהות ביעילות את החומרים האותנטיים והמזויפים של Chuanmutong, שהם המרכיבים העיקריים המסומנים של ההבדל בין האותנטי לבין הניאוף.

המהדורה האחרונה של הפרמקופיאה הסינית עדיין לא כללה את קביעת התוכן של המרכיבים היעילים של Chuanmutong. על מנת לשפר את בקרת האיכות שלו, מחקר זה בחן שיטות לקביעת תוכן של רכיבים פעילים כגון β-סיטוסטרול, ארגוסטרול, סיטוסטרול וחומצה אולאנולית הקשורים לפעולת המשתן בדוחות קודמים 22,23,24,25,26. כפי שניתן לראות באיור משלים 2, ארגוסטרול לא זוהה בצ'ואנמוטונג אותנטי, וסטיגמסטרול היה קשה להפרדה בכרומטוגרמה ולא ניתן היה לכמת אותו במדויק. לבסוף, נקבעה שיטת קביעת התוכן של β-סיטוסטרול; תוצאות הגילוי הראו כי β-סיטוסטרול נמצא ב-10 אצוות של דגימות צ'ואנמוטונג אותנטיות ובחמש קבוצות של חומרי ניאוף. לכן, β-סיטוסטרול לא היה ייחודי לחומרים רפואיים מקוריים. למרות שניתן לספק מידע מסוים על איכות Chuanmutong, עדיין יש צורך לנתח עוד יותר את הפסגות הכרומטוגרפיות הדיפרנציאליות בטביעות האצבע בעתיד כדי לראות אם ניתן למצוא את המרכיבים הספציפיים הקשורים ליעילות של Chuanmutong.

כיום, תרופות סיניות מסורתיות מזוהות לעתים קרובות על ידי הדמיון של ספקטרום טביעות האצבע הכימי. עם זאת, אינדיקטור זה הוא פרמטר המבוסס על המידע הכולל של פסגות כרומטוגרפיות הדגימה, אשר אינו יכול לספק מידע נוסף על הזיהוי ועל ההבדלים העיקריים של דגימות שונות. לכן, מחקר זה השתמש גם ב- CA, PCA ו- OPLS-DA כדי לזהות את מידע השיא המשותף של טביעות אצבע כימיות, מצא את הפסגות הכרומטוגרפיות הדיפרנציאליות העיקריות בין דגימות אותנטיות ומהוללות של צ'ואנמוטונג, וזיהה אותן בהצלחה. לבסוף, נבנתה טביעת אצבע כימית מצומדת HPLC לזיהוי מרובה תבניות.

מכיוון שאין זה נדיר לערבב חומרי מרפא סיניים אותנטיים וחומרי הניאוף שלהם, כגון Fritillaria thunbergii, Herba Asari ו- Lonicera japonica, שיטה זו תספק אסטרטגיה חדשה לזיהוי ברור ומדעי של חומרי מרפא סיניים אותנטיים ושל חומרי הניאוף שלהם. אסטרטגיה זו תהיה בעלת משמעות רבה להבטחת איכות חומרי המרפא הסיניים ביישום קליני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מינהל הרפואה הסינית המסורתית של סצ'ואן (מס' 2020JC0088, מס' 2021MS203).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2017381038
Acetonitrile Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China WXBD5243V
β-Sitosterol Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China 20210201
 C18 column Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China Welch Ultimate LP
Chuanmutong Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China  19020103 CMT-1
Chuanmutong Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200701 CMT-2
Chuanmutong Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200701 CMT-3
Chuanmutong Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200901 CMT-4
Chuanmutong Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  210701 CMT-5
Chuanmutong Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  210401 CMT-6
Chuanmutong Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200901 CMT-7
Chuanmutong Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China  201201 CMT-8
Chuanmutong Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China  201001 CMT-9
Chuanmutong Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 210501 CMT-10
Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China  - CC
Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China  - DC
Clematis peterae Hand.-Mazz. Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China  - DE
Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China  - XS
Clematis finetiana Levl. et Vaniot. Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China  - SMT
Electronic balance Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai,  China  FA1204
Ergosterol Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China 20210201
Ethanol Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 2021112602
Ethyl acetate Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2017042043
Formic acid Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 2016062901
High performance liquid chromatography Agilent, USA. 1260
IBM SPSS Statistics version 26.0 International Business Machines Corporation, USA -
Methanol Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China WXBD6409V
Methanol Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 202010302
n-butyl alcohol Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2020071047
Petroleum ether Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2020090125
Phosphoric acid Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 20200110
SESCF-TCM version 2012 National Pharmacopoeia Commission, China - http://114.247.108.158:8888/login
Stigmasterol Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China 20210201
Trichloromethane Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China 20200214
Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 Umetrics, Sweden - https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download
Ultrapure water machine Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China UPH-II-10T
Ultrasonic cleaner Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China KH3200E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, C. R. Chinese Medicine Specimen Picture Book. , Shanghai World Book Company. Shanghai. 116 (1935).
  2. Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
  3. Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
  4. Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of The People's Republic of China: (Edition 2020). , The Medicine Science and Technology Press of China. China., Beijing. 38 (2020).
  5. Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696 (2007).
  6. Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
  7. Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
  8. Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
  9. Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
  10. Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
  11. Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
  12. Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
  13. Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
  14. Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245 (2021).
  15. Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
  16. Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
  17. Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
  18. Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
  19. Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281 (2021).
  20. Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
  21. Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
  22. Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q. Quality Research of Chuanmutong. Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine. 27 (6), 58-60 (2009).
  23. Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
  24. Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
  25. Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
  26. Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).

Tags

כימיה גיליון 189 טביעת אצבע כימית זיהוי רב-תבניות אנליזה של אשכולות אנליזה של רכיבים עיקריים ניתוח הבחנה של ריבועים לפחות חלקיים אורתוגונליים חומרי מרפא סיניים Clematidis Armandii Caulis
HPLC בשילוב עם טביעת אצבע כימית לזיהוי תבניות מרובות לזיהוי האותנטיות של <em>קלמטידיס ארמנדי קאולי</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, F., Qian, Z., Liao, G., Zeng,… More

Wang, F., Qian, Z., Liao, G., Zeng, J., Huang, D., Liu, Q., Xie, X. HPLC Coupled with Chemical Fingerprinting for Multi-Pattern Recognition for Identifying the Authenticity of Clematidis Armandii Caulis. J. Vis. Exp. (189), e64690, doi:10.3791/64690 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter