تم قياس إنتاج الجلوكوز الكبدي وتكوين اليوريا وتحلل الدهون باستخدام نموذج كبد الفأر المنحرف
Summary
هنا ، نقدم طريقة قوية للتروية الموضعية لكبد الفأر لدراسة التنظيم الحاد والمباشر لعملية التمثيل الغذائي للكبد دون الإخلال بالبنية الكبدية ولكن في حالة عدم وجود عوامل خارج الكبد.
Abstract
الكبد له وظائف عديدة ، بما في ذلك التمثيل الغذائي للمغذيات. على عكس النماذج الأخرى في المختبر وفي الجسم الحي لأبحاث الكبد ، يسمح الكبد المعزول بدراسة بيولوجيا الكبد والتمثيل الغذائي في الكبد كله ببنية كبدية سليمة ، مفصولة عن تأثير العوامل خارج الكبد. تم تطوير نضح الكبد في الأصل للفئران ، ولكن تم تكييف الطريقة مع الفئران أيضا. هنا نصف بروتوكول التروية في الموقع من كبد الفأر. يتم اختراق الكبد مسبقا عبر الوريد البابي باستخدام عازل بيكربونات كريبس-هنسليت المؤكسج ، ويتم جمع الإخراج من الوريد الأجوف السفلي فوق الكبدي مع تثبيت الوريد الأجوف السفلي تحت الكبدي لإغلاق الدائرة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تقييم التأثيرات الكبدية المباشرة لمركب الاختبار بدقة زمنية مفصلة. وظائف الكبد وصلاحيتها مستقرة لمدة 3 ساعات على الأقل ، مما يسمح بإدراج الضوابط الداخلية في نفس التجربة. الاحتمالات التجريبية باستخدام هذا النموذج عديدة وقد تستنتج نظرة ثاقبة في فسيولوجيا الكبد وأمراض الكبد.
Introduction
الكبد هو عضو أساسي في عملية التمثيل الغذائي. يلعب دورا رئيسيا في التحكم في توازن طاقة الجسم بالكامل من خلال تنظيم استقلاب الجلوكوز والدهون والأحماض الأمينية. تبرز الزيادة في أمراض الكبد في جميع أنحاء العالم كعبء صحي عالمي كبير ، وهناك حاجة إلى مزيد من المعرفة حول الفيزيولوجيا المرضية وعواقبها على وظائف الكبد.
تم تطوير نماذج مختلفة في المختبر للبحث في الكبد لاستكمال الدراسات في الجسم الحي. تستخدم على نطاق واسع خلايا الكبد الأولية المعزولة والمستزرعة من القوارض والبشر. يمكن فصل الخلايا غير المتنية عن خلايا الكبد باستخدام الطرد المركزي التفاضلي والمتدرج ، كما أن الثقافة المشتركة لأنواع الخلايا المختلفة مفيدة لدراسة الحديث المتبادل بين الخلايا1. على الرغم من أن خلايا الكبد البشرية الأولية تعتبر المعيار الذهبي لاختبار سمية الدواء ، فقد أظهرت العديد من الدراسات أن خلايا الكبد تتمايز بسرعة في زراعة الأنسجة مما يؤدي إلى فقدان وظائف الكبد2،3،4. تعمل ثقافة خلايا الكبد في نظام كروي ثلاثي الأبعاد على تحسين عدم التمايز ، وهي أكثر استقرارا ، ويبدو أنها تحاكي الكبد في الجسم الحي بدرجة أعلى من أنظمة الثقافة 2D التقليدية5. شرائح الكبد المقطوعة بدقة هي نموذج آخر راسخ في المختبر يحافظ على بنية الأنسجة سليمة ويحتوي على الخلايا غير المتنية الموجودة في الكبد6. تشمل النماذج الأكثر تقدما في المختبر الكبد على رقاقة7 وعضويات الكبد8. ومع ذلك ، مع كل هذه الأساليب ، هناك فقدان للسلامة الهيكلية وديناميكيات التدفق ، بما في ذلك تدفق الوريد البابي الكبدي المتجه ، والذي من المحتمل أن يؤثر على قابلية التعميم.
تم وصف كبد الفئران المعزول لأول مرة من قبل كلود برنارد في عام 18559 ، ولا يزال يستخدم في مختلف المجالات العلمية لدراسات بيولوجيا الكبد وعلم السموم والفيزيولوجيا المرضية. تشمل مزايا الكبد المثقوب مقارنة بالنماذج المختبرية المذكورة أعلاه الحفاظ على البنية الكبدية ، وتدفق الأوعية الدموية ، وقطبية خلايا الكبد وتقسيم المناطق ، والتفاعلات بين خلايا الكبد والخلايا غير المتنية. بالمقارنة مع الدراسات في الجسم الحي ، يسمح الكبد المثقوب بدراسة استقلاب الكبد بطريقة معزولة لتجنب العوامل الكبدية الإضافية التي يحملها الدم مع التحكم الكامل في الظروف التجريبية. تم إجراء العديد من التعديلات لتحسين نموذج نضح كبد الفئران على مر السنين10،11،12،13. على الرغم من استخدام الفئران لدراسات الكبد المعزولة ، إلا أن الأدبيات المتاحة أقل. هنا ، نقدم طريقة للتروية في الموقع لكبد الفأر عن طريق قنية الوريد البابي والوريد الأجوف فوق الكبدي السفلي لدراسة الاستجابات الأيضية الحادة والمباشرة للركائز والهرمونات الأيضية كما تم قياسها في النفايات السائلة الوريدية الكبدية من كبد الفأر في الوقت الفعلي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد كبد الفأر المعزول أداة بحث قوية لدراسات الديناميات والآليات الجزيئية لعملية التمثيل الغذائي الكبدي. توفر إمكانية جمع العينات من دقيقة إلى دقيقة تقييما مفصلا للتأثير المباشر لمركب الاختبار على الكبد. بالمقارنة مع الدراسات في الجسم الحي ، يسمح لنا الكبد المثقوب بدراسة استقلاب الكبد ب?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم الدراسات ونيكولاي ج. وير ألبريشتسن من قبل منحة الباحث الناشئ المتميز لمؤسسة نوفو نورديسك – الغدد الصماء والتمثيل الغذائي (الطلب رقم. NNF19OC0055001) ، جائزة المؤسسة الأوروبية لدراسة مرض السكري في المستقبل (NNF21SA0072746) وصندوق البحوث المستقل الدنمارك ، Sapere Aude (1052-00003B). يتم دعم مركز مؤسسة نوفو نورديسك لأبحاث البروتين ماليا من قبل مؤسسة نوفو نورديسك (اتفاقية المنحة NNF14CC0001). تم إنشاء الشكل 1B باستخدام biorender.com. نشكر الدكتور رون إي كوهري (نوفو نورديسك إيه / إس) على المناقشات المثمرة حول كبد الفأر المثقوب.
Referências
- Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329 (2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Seirup, M., et al. Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro. Genomics. 114 (3), 110330 (2022).
- Gupta, R., et al. Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq. Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).
- Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX. Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
- Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. . Isolated Liver Perfusion and its Applications. , (1973).
- Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations. Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).
- Mischinger, H. J., et al. An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates. Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).
- Vairetti, M., et al. Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2. Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).
- Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).
- Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -. G. Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium. Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).
