Produção Hepática de Glicose, Urateagênese e Lipólise Quantificada usando o Modelo de Fígado de Camundongo Perfundido

Summary

Aqui, apresentamos um método robusto de perfusão in situ do fígado de camundongos para estudar a regulação aguda e direta do metabolismo hepático sem perturbar a arquitetura hepática, mas na ausência de fatores extra-hepáticos.

Abstract

O fígado tem inúmeras funções, incluindo o metabolismo de nutrientes. Em contraste com outros modelos in vitro e in vivo de pesquisa hepática, o fígado perfundido isolado permite o estudo da biologia e metabolismo hepático em todo o fígado com uma arquitetura hepática intacta, separada da influência de fatores extra-hepáticos. As perfusões hepáticas foram originalmente desenvolvidas para ratos, mas o método também foi adaptado para camundongos. Descrevemos aqui um protocolo de perfusão in situ do fígado de camundongos. O fígado é perfundido anterógrado através da veia porta com tampão de bicarbonato de Krebs-Henseleit oxigenado, e o débito é coletado da veia cava inferior supra-hepática com pinçamento da veia cava inferior infra-hepática para fechar o circuito. Usando este método, os efeitos hepáticos diretos de um composto de teste podem ser avaliados com uma resolução temporal detalhada. A função e a viabilidade hepática são estáveis por pelo menos 3 h, permitindo a inclusão de controles internos no mesmo experimento. As possibilidades experimentais utilizando este modelo são inúmeras e podem inferir conhecimentos sobre a fisiologia hepática e doenças hepáticas.

Introduction

O fígado é um órgão essencial no metabolismo. Ele desempenha um papel fundamental no controle do equilíbrio energético de todo o corpo, regulando o metabolismo de glicose, lipídios e aminoácidos. O aumento das doenças hepáticas em todo o mundo está emergindo como um grande fardo global para a saúde, e mais conhecimento é necessário sobre a fisiopatologia e suas consequências para as funções hepáticas.

Vários modelos in vitro têm sido desenvolvidos para pesquisas no fígado para complementar os estudos in vivo. Hepatócitos primários isolados e cultivados de roedores e humanos são amplamente utilizados. Células não-parenquimatosas podem ser separadas de hepatócitos usando centrifugação diferencial e gradiente, e o co-cultivo de diferentes tipos celulares é útil para o estudo de crosstalk^{intercelular1}. Embora hepatócitos humanos primários sejam considerados o padrão-ouro para testar a toxicidade de drogas, vários estudos têm demonstrado que os hepatócitos se desdiferenciam rapidamente em cultura de tecidos, resultando em perda das funções hepáticas ^2,3,4. A cultura de hepatócitos em um sistema esferoide 3D melhora a desdiferenciação, é mais estável e parece mimetizar o fígado in vivo em maior grau do que os sistemas tradicionais de cultura 2D⁵. Os cortes hepáticos cortados com precisão são outro modelo in vitro bem estabelecido que mantém intacta a arquitetura tecidual e contém as células não parenquimatosas presentes no fígado⁶. Modelos in vitro mais avançados incluem fígado-em-um-chip⁷ e organoides hepáticos⁸. No entanto, com todas essas abordagens, há uma perda da integridade estrutural e da dinâmica do fluxo, incluindo o fluxo vetorial da veia porta-hepática, o que provavelmente impacta a generalizabilidade.

O fígado de rato perfundido isolado foi descrito pela primeira vez por Claude Bernard em 1855⁹, e ainda é usado em vários campos científicos para estudos de biologia hepática, toxicologia e fisiopatologia. As vantagens do fígado perfundido em relação aos modelos in vitro citados incluem a manutenção da arquitetura hepática, o fluxo vascular, a polaridade e zonação dos hepatócitos e as interações entre hepatócitos e células não parenquimatosas. Comparado a estudos in vivo, o fígado perfundido permite o estudo do metabolismo hepático de forma isolada evitando fatores extra-hepáticos transportados pelo sangue e com controle completo sobre as condições experimentais. Várias modificações têm sido feitas para melhorar o modelo de perfusão hepática de ratos ao longo dos anos^10,11,12,13. Embora camundongos tenham sido usados para estudos de fígado perfundido isolado, menos literatura está disponível. Apresentamos aqui um método de perfusão in situ do fígado de camundongos por canulação da veia porta e da veia cava supra-hepática inferior para estudar as respostas metabólicas agudas e diretas a substratos metabólicos e hormônios medidos no efluente venoso hepático do fígado de camundongos em tempo real.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados com permissão da Inspetoria Dinamarquesa de Experimentação Animal, Ministério do Meio Ambiente e Alimentação da Dinamarca (licença 2018-15-0201-01397), e do comitê de ética local de acordo com a diretiva da UE 2010/63/UE, os Institutos Nacionais de Saúde (publicação nº 85-3) e seguindo as diretrizes da legislação dinamarquesa que rege a experimentação animal (1987). Trata-se de um procedimento terminal, cuja causa de morte é exsanguinação e perfuraç?…

Representative Results

Uma linha de base estável é necessária para determinar se um estímulo ou substrato leva à liberação da molécula de interesse. A Figura 3A mostra um exemplo de experimento bem-sucedido. A produção de ureia no fígado perfundido é medida em intervalos de 2 min e mostrada como média ± EPM. Os períodos basais que precedem cada um dos dois períodos de estimulação são estáveis. A produção média de ureia durante os dois períodos de estimulaç?…

Discussion

O fígado isolado de camundongos perfundidos é uma forte ferramenta de pesquisa para estudos da dinâmica e mecanismos moleculares do metabolismo hepático. A possibilidade de coleta minuto-a-minuto de amostras fornece uma avaliação detalhada do efeito direto de um composto teste no fígado. Comparado a estudos de vivo, o fígado perfundido permite estudar o metabolismo hepático de forma isolada evitando fatores extra-hepáticos transportados pelo sangue e com controle completo sobre as condições experimen…