Glukoseproduktion, Harnstoffgenese und Lipolyse in der Leber quantifiziert mit dem perfundierten Mauslebermodell
Summary
In dieser Arbeit stellen wir eine robuste Methode für die in situ Perfusion der Mausleber vor, um die akute und direkte Regulation des Leberstoffwechsels zu untersuchen, ohne die Leberarchitektur zu stören, aber de Abwesenheit von extrahepatischen Faktoren.
Abstract
Die Leber hat zahlreiche Funktionen, unter anderem den Nährstoffstoffwechsel. Im Gegensatz zu anderen in vitro und in vivo Modellen der Leberforschung ermöglicht die isolierte perfundierte Leber die Untersuchung der Leberbiologie und des Leberstoffwechsels de der gesamten Leber mit einer intakten Leberarchitektur, getrennt vom Einfluss extrahepatischer Faktoren. Leberperfusionen wurden ursprünglich für Ratten entwickelt, aber die Methode wurde auch an Mäuse angepasst. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die in situ Perfusion der Mausleber. Die Leber wird antegrad durch die Pfortader mit sauerstoffhaltigem Krebs-Henseleit-Bicarbonatpuffer perfundiert, und der Ausgang wird von der suprahepatischen unteren Hohlvene unter Klemmung der infrahepatischen unteren Hohlvene gesammelt, um den Kreislauf zu schließen. Mit dieser Methode können die direkten hepatischen Effekte einer Testverbindung mit einer detaillierten Zeitauflösung bewertet werden. Leberfunktion und Lebensfähigkeit sind für mindestens 3 h stabil, so dass interne Kontrollen in dasselbe Experiment einbezogen werden können. Die experimentellen Möglichkeiten mit diesem Modell sind zahlreich und können Aufschluss über die Leberphysiologie und Lebererkrankungen geben.
Introduction
Die Leber ist ein essentielles Organ im Stoffwechsel. Es spielt eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle des Energiehaushalts des gesamten Körpers, indem es den Glukose-, Lipid- und Aminosäurestoffwechsel reguliert. Die Zunahme von Lebererkrankungen weltweit entwickelt sich zu einer großen globalen Gesundheitsbelastung, und es wird mehr Wissen über die Pathophysiologie und ihre Folgen für die Leberfunktionen benötigt.
Für die Forschung an der Leber wurden verschiedene In-vitro-Modelle entwickelt, die In-vivo-Studien ergänzen. Isolierte und kultivierte primäre Hepatozyten von Nagetieren und Menschen sind weit verbreitet. Nicht-parenchymale Zellen können mit Hilfe von Differential- und Gradientenzentrifugation von Hepatozyten getrennt werden, und die Kokultur verschiedener Zelltypen ist nützlich für die Untersuchung des interzellulären Crosstalks1. Obwohl primäre menschliche Hepatozyten als Goldstandard für die Prüfung der Arzneimitteltoxizität gelten, haben mehrere Studien gezeigt, dass die Hepatozyten in Gewebekulturen schnell dedifferenzieren, was zu einem Verlust der Leberfunktionen führt 2,3,4. Die Hepatozytenkultur in einem 3D-Sphäroidsystem verbessert die Dedifferenzierung, ist stabiler und scheint die Leber in vivo in höherem Maße nachzuahmen als die herkömmlichen 2D-Kultursysteme5. Präzisionsgeschnittene Leberschnitte sind ein weiteres etabliertes In-vitro-Modell, das die Gewebearchitektur intakt hält und die in der Leber vorhandenen nicht-parenchymalen Zellen enthält6. Zu den fortgeschritteneren In-vitro-Modellen gehören Liver-on-a-Chip7 und Leberorganoide8. Bei all diesen Ansätzen kommt es jedoch zu einem Verlust der strukturellen Integrität und der Strömungsdynamik, einschließlich des vektoriellen portal-hepatischen Venenflusses, was sich wahrscheinlich auf die Generalisierbarkeit auswirkt.
Die isolierte perfundierte Rattenleber wurde erstmals 1855 von Claude Bernard beschrieben 9 und wird immer noch in verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen für Studien der Leberbiologie, Toxikologie und Pathophysiologie verwendet. Zu den Vorteilen der perfundierten Leber im Vergleich zu den oben genannten In-vitro-Modellen gehören die Aufrechterhaltung der Leberarchitektur, des Gefäßflusses, der Hepatozytenpolarität und -zonierung sowie die Wechselwirkungen zwischen Hepatozyten und nicht-parenchymalen Zellen. Im Vergleich zu In-vivo-Studien ermöglicht die perfundierte Leber die isolierte Untersuchung des Leberstoffwechsels unter Vermeidung von extrahepatischen Faktoren, die vom Blut getragen werden, und mit vollständiger Kontrolle über die Versuchsbedingungen. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Modifikationen vorgenommen, um das Leberperfusionsmodell der Ratte zu verbessern10,11,12,13. Obwohl Mäuse für isolierte perfundierte Leberstudien verwendet wurden, ist weniger Literatur verfügbar. Hier stellen wir eine Methode zur in situ Perfusion der Mausleber durch Kanülierung der Pfortader und der suprahepatischen Vena cava inferior vor, um die akuten und direkten metabolischen Reaktionen auf metabolische Substrate und Hormone zu untersuchen, wie sie im hepatischen venösen Ausfluss aus der Mausleber in Echtzeit gemessen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die isolierte perfundierte Mäuseleber ist ein starkes Forschungswerkzeug für die Untersuchung der Dynamik und der molekularen Mechanismen des Leberstoffwechsels. Die Möglichkeit der minütlichen Probenentnahme ermöglicht eine detaillierte Bewertung der direkten Wirkung einer Testsubstanz auf die Leber. Im Vergleich zu In-vivo-Studien ermöglicht uns die perfundierte Leber, den Leberstoffwechsel isoliert zu untersuchen, extrahepatische Faktoren aus dem Blut zu vermeiden und die Versuchsbedingungen vollständ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studien und Nicolai J. Wewer Albrechtsen wurden durch den Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant – Endocrinology and Metabolism (Antrags-Nr. NNF19OC0055001), European Foundation for the Study of Diabetes Future Leader Award (NNF21SA0072746) und Independent Research Fund Denmark, Sapere Aude (1052-00003B). Das Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research wird von der Novo Nordisk Foundation finanziell unterstützt (Grant Agreement NNF14CC0001). Abbildung 1B wurde mit biorender.com erstellt. Wir danken Dr. Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) für die fruchtbaren Diskussionen über die perfundierte Mäuseleber.
Referências
- Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329 (2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Seirup, M., et al. Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro. Genomics. 114 (3), 110330 (2022).
- Gupta, R., et al. Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq. Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).
- Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX. Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
- Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. . Isolated Liver Perfusion and its Applications. , (1973).
- Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations. Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).
- Mischinger, H. J., et al. An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates. Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).
- Vairetti, M., et al. Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2. Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).
- Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).
- Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -. G. Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium. Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).
