Summary
يمثل التلاعب بتداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) تحديا هائلا في العديد من الأنواع الطفيلية ذات الحجم الصغير ، مثل دبابير Trichogramma . حددت هذه الدراسة طريقة RNAi فعالة في Trichogramma denrolimi. توفر المنهجية الحالية نموذجا قويا للتحقيق في تنظيم الجينات في دبابير Trichogramma .
Abstract
يتم التعرف على طفيليات البيض ، Trichogramma spp ، كعوامل مكافحة بيولوجية فعالة ضد مختلف آفات حرشفيات الأجنحة في الزراعة والغابات. تتطور المراحل غير الناضجة من نسل Trichogramma داخل البويضة المضيفة ، وتظهر ضآلة ملحوظة (حوالي 0.5 مم في طول البالغين). برزت منهجية تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) كأداة حاسمة لتوضيح وظائف الجينات في العديد من الكائنات الحية. ومع ذلك ، فإن التلاعب بالحمض النووي الريبي في بعض الأنواع الطفيلية الصغيرة ، مثل Trichogramma ، قد شكل تحديات كبيرة بشكل عام. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة RNAi فعالة في Trichogramma denrolimi. يشمل الإجراء المحدد الحصول على عينات T. dendrolimi الفردية وعزلها من بيض المضيف ، وتصميم وتوليف الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل (dsRNA) ، وزرع وزراعة الشرانق T. dendrolimi في المختبر ، والحقن الدقيق ل dsRNA ، والتقييم اللاحق للضربة القاضية الجينية المستهدفة من خلال تحليل RT-qPCR. توفر هذه الدراسة إجراء شاملا ومفصلا بصريا لإجراء تجارب RNAi في T. dendrolimi ، مما يمكن الباحثين من التحقيق في تنظيم الجينات في هذا النوع. علاوة على ذلك ، فإن هذه المنهجية قابلة للتكيف مع دراسات RNAi أو الحقن الدقيقة في أنواع Trichogramma الأخرى مع تعديلات طفيفة ، مما يجعلها مرجعا قيما لإجراء تجارب RNAi في الأنواع الطفيلية الداخلية الأخرى.
Introduction
Trichogramma spp. هي مجموعة من طفيليات البيض التي تم استخدامها على نطاق واسع كعوامل مكافحة بيولوجية عالية الكفاءة ضد مجموعة واسعة من الآفات حرشفية الأجنحة في النظم الإيكولوجية الزراعية والغابات في جميع أنحاء العالم1،2،3،4. يوفر تطبيق Trichogramma الذي يتم تربيته على نطاق واسع نهجا صديقا للبيئة للإدارة المستدامة للآفات5،6،7. يوفر فهم البيولوجيا الجزيئية لدبابير Trichogramma رؤى قيمة لتعزيز كفاءة التربية الجماعية والأداء الميداني لعوامل المكافحة البيولوجية هذه 8,9 من خلال التحقيق في منهجية تنظيم الجينات وتحرير الجينوم10.
منذ اكتشاف التداخل الجيني المحدد المزدوج الشريط (dsRNA) بوساطة Caenorhabditis elegans في عام 1998 ، تطورت طريقة تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) إلى مجموعة أدوات وراثية حيوية لاستكشاف الآليات التنظيمية للكائنات الحية عن طريق قمع التعبير عن الجينات المستهدفة11. أصبحت تجارب RNAi منهجية قياسية مطبقة على نطاق واسع لدراسة وظيفة الجينات في العديد من أنواع الحشرات12,13. ومع ذلك ، فإن التلاعب بالحمض النووي الريبي يمثل تحديا هائلا في العديد من الأنواع الطفيلية ، لا سيما بين تلك التي تنتمي إلى عائلة Chalcidoidea الطفيليةالداخلية 14،15،16. تم توثيق طريقة RNAi في ما لا يقل عن 13 نوعا طفيليا14،15،16،17،18،19. من بين هذه ، تم إجراء نهج RNAi بشكل شامل في دبابير Nasonia وهو قابل للتطبيق طوال مراحل النمو ، بما في ذلك الأجنة واليرقات والشرانق والبالغين14،15،16. من الجدير بالذكر أن دبابير Nasonia هي طفيليات خارجية ، حيث يتطور نسلها في الفضاء الخلالي بين الخادرة المضيفة و puparium ، مما يتيح زراعتها في المختبر ويجعلها تتحمل علاجات معينة ، مثل الحقن الدقيق. على عكس دبابير ناسونيا ، يخضع أفراد Trichogramma لتطورهم الجنيني واليرقات والعذراء بالكامل داخل البويضة المضيفة. تمثل الطبقة في مراحل الجنين واليرقات (التي قد تعيق نفاذية dsRNA) ، والتعرض للتلف ، وصعوبة البقاء على قيد الحياة في المختبر عقبات هائلة20،21،22. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحجم الصغير لأفراد Trichogramma ، حوالي ~ 0.5 مم في طول البالغين أو العذراء ، يجعلهم معقدين للغاية للتلاعبب 20،21،22.
في هذه الدراسة ، نحدد إجراء شاملا لإجراء تجارب تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) في Trichogramma denrolimi Matsumura. يشمل هذا الإجراء الإجراءات التالية: (1) تصميم وتوليف الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل (dsRNA) ، (2) الحقن المجهري لشرانق T. denrolimi ، (3) زرع هذه الشرانق وتحضينها في المختبر ، و (4) الكشف عن ضربة قاضية للجين المستهدف من خلال تحليل RT-qPCR. الجين المستهدف المختار لتجربة RNAi هو تماثل سلسلة الفيريتين الثقيلة (Ferhch). يحتوي FerHCH ، وهو بروتين ملزم للحديد ، على مركز فيروكسيديز يتمتع بقدرات مضادة للأكسدة ، مما يسهل أكسدة Fe2+ إلى Fe3+. يلعب دورا لا غنى عنه في نمو وتطور الكائنات الحية المختلفة من خلال الحفاظ على توازن الأكسدة والاختزال وتوازن الحديد. ويمكن أن يؤدي استنفاد سداسي كلور حلقي الهكسان إلى الإفراط في تراكم الحديد، مما يؤدي إلى تلف الأنسجة بشكل لا رجعة فيه، وغالبا ما يبلغ ذروته في تغيرات كبيرة في النمط الظاهري، بما في ذلك عيوب النمو والتشوهات والوفيات23 و24. تقدم هذه الدراسة دليلا خطوة بخطوة لإجراء RNAi في T. denrolimi ، والذي سيكون لا يقدر بثمن للتحقيق في وظائف الجينات في السياق الأوسع لدبابير Trichogramma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات والبرامج والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. جمع وصيانة زراعة الحشرات
- قم بلصق مجموعة من ~ 5000 بيضة من Corcyra cephalonica (Stainton) على بطاقة 9 سم × 16 سم باستخدام محلول 1: 5 (v / v) من مسحوق الصمغ العربي والماء25,26.
ملاحظة: تجنب إرفاق الكثير من بيض المضيف بالبطاقة لأن الاكتظاظ يجعلها غير عملية لإجراءات النقل والتشريح اللاحقة. - لمنع فقس بيض المضيف ، قم بإخضاع بطاقات البيض المضيفة لمدة 30 دقيقة من الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 1-i). بعد ذلك ، قم بتقطيع الورق بالبيض المعطل إلى بطاقات بيض يبلغ سمكها 1 سم وقطرها 8 سم ، تحتوي كل منها على حوالي 300-500 بيضة (الشكل 1-ii)25،26،27.
- أدخل مجموعة من الدبابير 80-120 T. denrolimi في أنبوب زجاجي يبلغ قطره 2 سم وطوله 8 سم. ختم الأنبوب بالقطن.
ملاحظة: الحفاظ على الدبابير عند درجة حرارة 25 ± 1 درجة مئوية ، مع دورة الضوء / الظلام من 16 ساعة من الضوء و 8 ساعات من الظلام والحفاظ على رطوبة نسبية تبلغ حوالي 75٪. - قدم بطاقة بيضة مضيفة إلى الدبابير للتطفل (الشكل 1-ii). اسمح للدبابير بإيداع بيضها في البيض المضيف لمدة 6 ساعات ، وبعد ذلك قم بإزالة الدبابير على الفور.
ملاحظة: تجنب إطالة فترة التطفل بشكل مفرط لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى اكتظاظ نسل T. denrolimi داخل البويضة المضيفة ، مما يؤدي إلى زيادة معدل وفيات دبابير النسل28,29.
2. تخليق dsRNA
- تصميم مجموعات التمهيدي التي تحتوي على مروج T7 لتوليف الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل (dsRNA). اختر شريحة 300-400 bp من الجين المستهدف (Ferhch) لتخليق dsRNA.
- الحصول على مجموعات أولية مركبة تجاريا لإنتاج dsRNA للجين المستهدف و dsGFP لاستخدامها كعنصر تحكم سلبي.
- استخرج محتوى الحمض النووي الريبي من 100 دبابير T. denrolimi باستخدام المجموعة المشار إليها باتباع بروتوكولالشركة المصنعة 9. تحقق من جودة محتوى الحمض النووي الريبي ؛ تابع إذا كانت قيمة OD260 / OD280 تتراوح من 1.8 إلى 2.09.
- قم بتنقية محتوى الحمض النووي الريبي باستخدام 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت 5x (1 وحدة / 50 ميكرولتر) ، و 1 ميكرولتر من DNAse (1 وحدة / 50 ميكرولتر) ، و 6.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (~ 100 نانوغرام / ميكرولتر) ، 0.5 ميكرولتر من H2O عند 42 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
- إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR) لإنشاء قالب cDNA مع 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المنقى (~ 100 نانوغرام / ميكرولتر) ، 4 ميكرولتر من 5x buffer (1 U / 50 μL) ، 1 ميكرولتر من مزيج الإنزيم I (1 U / 50 μL) ، و 4 ميكرولتر من H2O. قم بإجراء RT-PCR باستخدام الإعدادات التالية: 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، 85 درجة مئوية لمدة 5 ثوان. قم بتخزين منتج cDNA في درجة حرارة -4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم تسلسلات dsRNA وفقا للمزيج الرئيسي المشار إليه (10 ميكرولتر من Taq II [1 U / 50 μL] ، 0.8 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي [0.4 μM] ، 0.8 ميكرولتر من التمهيدي العكسي [0.4 ميكرومتر] ، 0.8 ميكرولتر من قالب الحمض النووي [40 نانوغرام / ميكرولتر] ، و 7.6 ميكرولتر من H2O). إجراء PCR باستخدام الإعدادات التالية: 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ؛ 35 دورة مع 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ؛ 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- تقييم جودة منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الكهربائي على هلام الأغاروز 2.0٪ 5,9 وتأكيد التسلسل المستهدف من خلال تسلسل سانجر.
- قم بتنقية منتج PCR باستخدام مجموعة استخراج الجل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة 9,23.
- استخدم نظام RNAi لتجميع dsRNA للجين المستهدف مع 10 ميكرولتر من 2x buffer (0.02 وحدة / ميكرولتر) ، و 8 ميكرولتر من قالب الحمض النووي (75 نانوغرام / ميكرولتر) ، و 2 ميكرولتر من مزيج الإنزيم (1 وحدة / 50 ميكرولتر) مع الإعدادات التالية: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، و 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تخلص من dsRNA المركب ب 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز.
- قم بتقييم جودة منتج dsRNA من خلال تصوره على هلام أغاروز 1.0٪ 5,9. تمييع dsRNA إلى 7000 نانوغرام / ميكرولتر. تحقق من جودة منتج dsRNA ؛ تابع إذا كانت قيمة OD260 / OD280 تتراوح من 1.8 إلى 2.09. قم بتخزين منتج dsRNA في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. زرع الشرانق T. denrolimi
- قم بزراعة بيض المضيف المتطفل لمدة 8 أيام تقريبا عند 25 ± 1 درجة مئوية ، مع الحفاظ على دورة مظلمة لمدة 16 ساعة / 8 ساعات ورطوبة نسبية ~ 75٪. سوف يتحول لون البيض المضيف المتطفل إلى اللون الأسود بعد 5 أيام30 (الشكل 1-iv ، v).
- نقل بطاقة البيض المضيف إلى المجهر تشريح. استخدم زوجا من إبر التنغستن (الشكل 1-السادس) لإزالة المشيم بدقة من البيض المضيف (الشكل 1-السابع) واستعادة الخادرة من الداخل (الشكل 1-الثامن)5،17،18.
ملاحظة: يجب أن يكون طرف إبرة التشريح أقل من 0.05 مم. - إعداد لوحة نظيفة للركيزة. اسكب 10-15 مل من محلول أجار 15 جم / لتر ، مما يسمح له بالتبريد بشكل طبيعي (الشكل 2-ط).
ملاحظة: امزج محلول أجار مع 0.5 جم من الستربتومايسين لمنع نمو الملوثات في المختبر. - استخدم جرافا مطهرا لحفر عدة أخاديد بعمق 0.2-0.3 مم وعرض 0.4-0.8 مم (الشكل 2-ii).
- استخدم فرشاة صغيرة (الشكل 2-iii) لزرع خادرة من البويضة المضيفة المشرحة في أحد الأخاديد الموجودة على ركيزة الآجار (الشكل 2-iv).
- كرر الخطوتين 3.4 و 3.5 ، وزرع 100-300 خادرة بشكل فردي في الأخاديد واحدة تلو الأخرى (الشكل 2-v).
4. حقن دقيق ل dsRNA في T. denrolimi pupa
- استخدم مجتذب إبرة زجاجية لسحب الشعيرات الدموية الزجاجية (الشكل 3-i ، ii). اضبط الحرارة على 280 ، والسرعة على 170 ، والتأخير على 250 ، والسحب على 30 على مجتذب الإبرة (الشكل 3-iii). تحضير إبر زجاجية شعرية متعددة للحقن المجهري (الشكل 3-iv ، v).
- شطبة طرف الإبرة الزجاجية باستخدام لوحة كاشطة (الشكل 3-السادس).
ملاحظة: تأكد من أن طرف إبرة الحقن لا يزال حادا ؛ خلاف ذلك ، قد يؤدي إلى وفيات العذراء أو إعاقة تدفق الكاشف عبر الإبرة (الشكل 3-السابع). - قم بتحميل ما يقرب من 2 ميكرولتر من محلول حقن dsRNA مع 7000 نانوغرام / ميكرولتر في إبرة الحقن المعدة باستخدام مضخة حقن دقيقة (الشكل 3-السابع).
- انقل ركيزة الآجار التي تحتوي على مئات الشرانق إلى منصة المجهر المركب (الشكل 3-الثامن).
- أدخل إبرة الحقن بعناية في بطن خادرة T. denrolimi بزاوية ~ 30 درجة إلى البطن تحت العدسة (الشكل 3-التاسع).
- حقن تدريجيا ~ 5 nL من محلول الحقن (الخطوة 4.3) في خادرة T. denrolimi بلطف قدر الإمكان.
ملاحظة: قد تنتفخ خادرة T. denrolimi قليلا عند حقن محلول dsRNA. قد يؤدي حقن كمية زائدة من المحلول في الخادرة أو استخدام الإبر ذات الفتحات الكبيرة جدا إلى موت العذراء المبكر. قم بتغيير الإبر عندما تصبح مسدودة بعد حقن عدة إلى عشرات الشرانق. - كرر الخطوتين 4.5 و 4.6 ، حقن dsRNA في 600 خادرة واحدة تلو الأخرى.
ملاحظة: لتحليل RT-qPCR الموثوق به ، يجب عزل محتوى الحمض النووي الريبي من 100 خادرة على الأقل. حقن ما لا يقل عن 600 خادرة لثلاث تكرارات في علاج dsRNA وثلاثة مكررات في التحكم السلبي dsGFP 9.
5. حضانة الشرانق T. denrolimi
- نقل الركيزة التي تحتوي على الشرانق المحقونة إلى حاضنة عند 25 ± 1 درجة مئوية مع دورة ضوء / ظلام 16 ساعة / 8 ساعات و ~ 75٪ رطوبة نسبية.
- احتضان ما يقرب من 700 T. denrolimi الشرانق لكل علاج لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة. استخراج محتوى الحمض النووي الريبي من مجموعة من 100 خادرة لكل نسخة مكررة9.
ملاحظة: إزالة الشرانق المنكمشة (الشرانق الميتة) من العينات; خلاف ذلك ، قد يؤدي إلى أخطاء في الكشف عن التعبير الجيني. - احتضان ~ 50 T. denrolimi الشرانق لكل علاج حتى تظهر الدبابير (الشكل 3-x). سجل معدل الظهور ومعدل التشوه.
6. الكشف عن التعبير الجيني المستهدف
- صمم مجموعة التمهيدي للجين المستهدف والجينات المرجعية ل RT-qPCR باستخدام أداة تصميم.
ملاحظة: تأكد من عدم تداخل تسلسلات بادئات RT-qPCR مع المنطقة المستهدفة من dsRNA. - استخدام صندوق شوكة الجين O (FoxO) كجين مرجعي في تحليل RT-qPCR ؛ تم الإبلاغ عن الاشعال من FoxO سابقا9.
- الحصول على مجموعات التمهيدي توليفها تجاريا. قم بإجراء RT-qPCR مع 10 ميكرولتر من Taq II (1 U / 50 μL) ، 0.8 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي (0.4 μM) ، 0.8 ميكرولتر من التمهيدي العكسي (0.4 ميكرومتر) ، 0.8 ميكرولتر من القالب (10 نانوغرام / ميكرولتر) ، و 7.6 ميكرولتر من H2O. قم بإجراء RT-qPCR باستخدام الإعدادات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 35 دورة مع 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، 57 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ؛ 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ؛ 60 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، و 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان.
- احسب قيمة التعبير للجين المستهدف باستخدام طريقة 2-ΔΔCt 9,25.
- استخدم اختبار Kruskal-Wallis لتحليل التعبير عن الجين المستهدف تحت تأثير العلاجات المختلفة (dsFerhch ، dsGFP ، عدم الحقن).
ملاحظة: تجنب استخدام الاختبارات البارامترية (على سبيل المثال ، اختبار t) للمقارنات اللاحقة لأن عدم تجانس البيانات وعدم طبيعتها قد يؤدي إلى استنتاجات خاطئة25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كان معدل ظهور الشرانق T. denrolimi المحقونة ب dsFerhch أقل بكثير من أولئك الذين تم حقنهم ب dsGFP أو أولئك الذين لم يحقنوا (الجدول 1). من بين الدبابير الناشئة ، 51.85 ٪ من الدبابير T. denrolimi التي تعرضت ل dsFerhch وضعت أجنحة صغيرة مشوهة. لم تلاحظ الدبابير المشوهة في الدبابير المحقونة ب dsGFP أو بدون أي حقن (الجدول 1). علاوة على ذلك ، أظهرت بطون الشرانق T. denrolimi المحقونة ب dsFerhch الميلانية التي هي النمط الظاهري لاستقلاب الحديد غيرالطبيعي 23. لم يلاحظ الميلانية في الشرانق T. denrolimi المحقونة ب dsGFP أو تلك التي لا تحتوي على أي حقن (الشكل 4).
أظهر تحليل RT-qPCR أن تعبير Ferhch في الشرانق T. denrolimi ، بعد 24 ساعة من حقن dsFerhch (0.6460 ± 0.0056) ، قد انخفض بشكل كبير مقارنة بأولئك الذين تم حقنهم ب dsGFP (1.4514 ± 0.5402 ؛ ف = 0.0415). ومع ذلك ، لم يختلف اختلافا كبيرا عن التعبير في الشرانق دون أي حقن (1.0000 ± 0.1953; ف = 0.8725). تم تخفيض تنظيم تعبير Ferhch في الشرانق T. denrolimi ، بعد 48 ساعة من حقن dsFerhch (0.5170 ± 0.0575) ، بشكل كبير مقارنة بالشرانق المحقونة باستخدام dsGFP (0.8515 ± 0.0233 ؛ P = 0.0182) وأولئك الذين ليس لديهم أي حقن (1.0548 ± 0.3006 ؛ P = 0.0113) (الشكل 5).
الشكل 1: جمع وصيانة ثقافة Trichogramma denrolimi . (ط) تعريض بطاقات البيض المضيفة للإشعاع فوق البنفسجي. (ii) قطع الورق مع البيض المعطل في بطاقات البيض. (iii) تقديم بطاقة بيضة مضيفة إلى الدبابير للتطفل. (iv) زراعة بيض المضيف المتطفل لمدة 8 أيام. (ت) سوف يتحول لون بيض المضيف المتطفل إلى اللون الأسود بعد 5 أيام. (vi) إبرة التشريح بطرف 0.04 مم. (vii) إزالة المشيم من البيض المضيف. (ثامنا) ت. دينروليمي خادرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: زرع وحضانة الشرانق الشجرية المشعرة . (ط) ركيزة الآجار. (ii) استخدم قبرا مطهرا لحفر عدة أخاديد على الركيزة. (iii) استخدم فرشاة صغيرة ل (iv) زرع الشرانق من البويضة المضيفة المشرحة في أخدود على الركيزة. (ت) زرع 100-300 خادرة بشكل فردي في الأخاديد واحدة تلو الأخرى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إجراء الحقن المجهري. (ط) الشعيرات الدموية الزجاجية. (ii) مجتذب إبرة زجاجية. (iii) إعدادات مجتذب الإبرة. (iv) تحضير إبر زجاجية شعرية متعددة للحقن المجهري. (v) قمة إبرة الزجاج الشعري. (vi) قم بشطبة طرف الإبرة الزجاجية باستخدام لوحة كاشطة. (vii) تحميل حوالي 2 ميكرولتر من محلول حقن dsRNA. (viii) المجهر المركب. (ix) أدخل إبرة الحقن في البطن وحقن محلول الحقن. (خ) ظهور الدبابير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الخصائص المورفولوجية لخادرة Trichogramma denrolimi والدبور. تظهر الخادرة والدبور المحقونان ب dsFerhch الميلانية مع لون الجسم الأسود. يظهر المحقون ب dsFerhch زوجا من الأجنحة الصغيرة المشوهة. لا يتم ملاحظة الميلانية والأجنحة المشوهة في الخادرة والدبابير المحقونة ب dsGFP أو تلك التي لا تحتوي على أي حقن. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التعبير عن الجين المستهدف Ferhch بالنسبة إلى FoxO عند 24 ساعة و 48 ساعة بعد حقنds Ferhch أو dsGFP ، أو عدم الحقن. تشير أشرطة الخطأ إلى الأخطاء القياسية. تشير الأحرف الصغيرة المختلفة إلى اختلاف كبير عند P < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المتغيرات | دي إسفيرتش | dsGFP | بدون حقن | χ2 | P |
| معدل الظهور | 54.00٪ (27/50) ب | 78.00٪ (39/50) أمبير | 90.00٪ (45/50) أمبير | 17.46 | <.001 |
| معدل التشوه | 51.85٪ (14/27) أمبير | 0٪ (0/39) ب | 0٪ (0/45) ب | 49.84 | <.001 |
الجدول 1: ظهور وتشوه Trichogramma denrolimi عن طريق الحقن بواسطة dsFerhch ، dsGFP ، أو بدون حقن. تشير الأحرف الصغيرة المختلفة إلى اختلافات كبيرة في معدل الظهور عند P < 0.05. تشير الأحرف الكبيرة المختلفة إلى اختلافات كبيرة في معدل التشوه عند P < 0.05. يتم تقدير قيم χ2 و P المدرجة في الجدول بواسطة الاختبار المستقل χ2 وتشير إلى التأثير الكلي لثلاثة مستويات علاج على معدل الظهور ومعدل التشوه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ومن المسلم به أن الدبابير Trichogramma هي عوامل مكافحة بيولوجية فعالة، وتستهدف على وجه التحديد مجموعة من الآفات حرشفية الأجنحة في الزراعة والحراجة1. تخضع هذه الدبابير الصغيرة لمراحلها غير الناضجة داخل البويضة المضيفة ، وهي خاصية تمثل تحديات في إجراء تجارب RNAi 5,18. تقدم هذه الدراسة دليلا مرئيا شاملا لإجراء تجارب RNAi في T. denrolimi. بالنظر إلى السمات البيولوجية المشتركة بين أنواع Trichogramma ، يمكن تكييف الإجراء بسهولة لدراسات RNAi أو الحقن الدقيقة في أنواع Trichogramma الأخرى وأنواع الطفيليات الداخلية مع بعض التعديلات.
يقدم الإجراء العديد من الأساليب المبتكرة ، مما يسهل الحقن الدقيقة الفعالة لمحتوى dsRNA ، وتبسيط عملية RT-qPCR ل T. denrolimi ، وتحسين عملية الزرع والحضانة في المختبر لشرانق T. denrolimi. وفقا لهذه الدراسة ، بلغ معدل ظهور الشرانق المزروعة 90٪ دون أي حقن. عندما تعرضت الشرانق المزروعة لحقن dsGFP ، كان معدل ظهور هذه الشرانق 78٪ (الجدول 1). تتوقف تجارب RNAi الناجحة في Trichogramma بشكل كبير على الحقن الدقيقة الدقيقة والحضانة الدقيقة للشرانق في المختبر. قد تنجم قابلية الشرانق Trichogramma المعزولة للتلف أثناء الحقن عن إبر الحقن الدقيقة كبيرة الحجم أو تقنيات الحقن المتسرع أو التلوث الميكروبي على ركيزة الآجار. تقدم الطريقة المرئية التفصيلية المعروضة هنا أيضا نظرة ثاقبة لتقنية الحقن المجهري في T. denrolimi ، والتي ليست ضرورية فقط لأدوات التحرير الجيني الأخرى (على سبيل المثال ، نظام CRISPR-Cas9) ولكن أيضا لإجراء تجارب فسيولوجية مختلفة (على سبيل المثال ، النقل الاصطناعي للمتعايشات وتوصيل مثبطات أو منشطات الاستجابات الفسيولوجية)1،14،15،16.
لتحليل RT-qPCR ، تم حقن ما يقرب من 1500 خادرة في هذه الدراسة. نظرا لصغر حجم T. denrolimi ، من الضروري وجود ما لا يقل عن 100 خادرة لكل نسخة مكررة لضمان جودة وكمية كافية من الحمض النووي الريبي لتحليل RT-qPCR9. وبالتالي ، فإن حقن dsRNA في مئات الشرانق أمر حتمي. بالإضافة إلى ذلك ، يلزم إجراء تحسينات في إجراء عزل الحمض النووي الريبي (على سبيل المثال ، استخدام مجموعة محددة لاستخراج الحمض النووي الريبي ، وتحسين برامج تفاعل البوليميراز المتسلسل) للحصول على محتوى الحمض النووي الريبي المؤهل من عدد مخفض من أفراد Trichogramma لكل نسخة مكررة. يتضمن النهج البديل توصيل dsRNA من خلال النقع أو التغذية ، والتي قد تكون أكثر ملاءمة للحصول على عدد كبير من الأفراد الخاضعين ل dsRNA. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري ملاحظة أن إجراء RNAi الحالي قابل للتطبيق فقط في مرحلة العذراء من T. denrolimi. يجب أن تركز الأبحاث المستقبلية بشكل خاص على تطوير طرق RNAi الفعالة لمراحل الجنين واليرقات15،16.
باختصار ، حددت هذه الدراسة طريقة RNAi فعالة في T. denrolimi. لعقود من الزمان ، نادرا ما تم استكشاف وظائف الجينات داخل جنس Trichogramma بأكمله. توفر المنهجية الحالية نموذجا قويا للتحقيق في اللوائح الجينية أثناء الأنشطة التنموية والفسيولوجية في دبابير Trichogramma. يجب أن تركز البحوث المستقبلية على تطوير الأدوات الوراثية ، مثل تحرير الجينوم وتداخل الحمض النووي الريبي في دبابير Trichogramma. يقدم الاستكشاف العميق للبيولوجيا الجزيئية لدبابير Trichogramma رؤى قيمة لتحسين كفاءة التربية الجماعية والأداء الميداني لعوامل المكافحة البيولوجية هذه لمكافحة الآفات 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل مشاريع المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32172476 ، 32102275) ، وبرنامج ابتكار العلوم والتكنولوجيا الزراعية (CAAS-ZDRW202203 ، CAAS-ZDRW202108) ، والصناديق المركزية التي توجه تطوير العلوم والتكنولوجيا المحلية (XZ202301YD0042C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2x ES Taq MasterMix (Dye) | Cowin Biotech, China | CW0690H | To amplify the dsRNA sequences |
| 20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6) | Sangon Biotech, China | B540627-0500 | To dilute dsRNA |
| Agar strip | Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China | n/a | To make culture medium |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech, China | A610028 | To make culture medium |
| Bioer Constant temperature metal bath | BIOER, China | MB-102 | To synthesis dsRNA |
| Borosilicate glass capillary | WPI, USA | 1B100-4 | To pull capillary glass needle |
| Clean bench | Airtech, China | SW-CJ-1FD | To extract RNA |
| Double distilled water | Sangon Biotech, China | A500197-0500 | To dilute cDNA |
| Environmental Testing chamber | Panasonic, Japan | MLR-352H-PC | To culture T. denrolimi |
| Eppendorf Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5418R | To store RNA content |
| Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendrof, Germany | FemtoJet 4i | To inject T. denrolimi |
| Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5810R | Centrifuge |
| Ethanol solution (75%, RNase-free) | Aladdin, China | M052131-500ml | To extract RNA |
| Gel Extraction Kit | Omega, USA | D25000-02 | To extract cDNA |
| GUM Arabic | Solarbio, China | CG5991-500g | To make egg card |
| Isopropyl alchohol | Aladdin, China | 80109218 | To extract RNA |
| Laser-Based Micropipette Puller | SUTTER, USA | P-2000 | To pull capillary glass needle |
| Microloader | Eppendrof, Germany | 20 µL | To load dsRNA |
| Multi-sample tissue grinder | LICHEN, China | LC-TG-24 | To grind T. denrolimi |
| Needle Grinder | SUTTER, USA | BV-10-E | To grind capillary glass needle |
| Nuclease-Free Water | Sangon Biotech, China | To dilute RNA | |
| OLYMPUS Microscope | OLYMPUS, Japan | XZX16 | To observe T. denrolimi |
| PCR machine | Bio-rad, USA | S-1000 | For DNA amplification |
| PowerPac Basic | Bio-rad, USA | PowerPacTM Basic | To detect the quality of dsRNA |
| Primer of dsGFP (Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA |
||
| Primer of dsGFP (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG |
||
| Primer of Ferhch for qPCR (Forward) | TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT | ||
| Primer of Ferhch for qPCR (Reverse) | CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT | ||
| Primer of Ferhch for RNAi (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC |
||
| Primer of Ferhch for RNAi(Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG |
||
| Primer of FoxO for qPCR (Forward) | CTACGCCGATCTCATAACGC | ||
| Primer of FoxO for qPCR (Reverse) | TGCTGTCGCCCTTGTCCT | ||
| PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) | TaKaRa, Japan | RR047A | |
| Quantitative Real-time PCR | Bio-rad, USA | CFX 96 Touch | To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) |
| Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool | https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ | ||
| T7 RiBoMAX Express RNAi System | Promega, USA | P1700 | To synthesis dsRNA in vitro |
TB Green Premix Ex TaqTM  (Til RnaseH Plus) |
TaKaRa, Japan | RR820A | To perform RT-qPCR |
| Trichloromethane | KESHI, China | GB/T682-2002 | To extract RNA |
| TRIzol Reagent | Ambion, USA | 15596018 | To extract total RNA content from samples |
| Ultra-low Temperature Freezer | Thermo, USA | Forma 911 |
References
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
- Zhou, J. C., et al. Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Lepidoptera: Saturniidae). Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).
- Li, T. H., et al. Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids. J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).
- Zhou, J. C., et al. Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing. Sci Rep. 9 (1), 18114 (2019).
- Zhou, J. C., et al. Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs. Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).
- Huang, N. X., et al. Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China. Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).
- Wang, P., et al. Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis. Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).
- Ning, S. F., et al. The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). Front Physiol. 14, 1243753 (2023).
- Huo, L. X., et al. Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883 (2022).
- Leung, K., et al. Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics. Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
- Sun, Y., et al. Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants. Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. J Vis Exp. 130, e56990 (2017).
- Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis. J Vis Exp. 166, e61892 (2020).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
- Zhu, K. Y., Palli, S. R. Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference. Annu Rev Entomol. 65, 293-311 (2020).
- Colinet, D., et al. Development of RNAi in a Drosophila endoparasitoid wasp and demonstration of its efficiency in impairing venom protein production. J Insect Physiol. 63, 56-61 (2014).
- Wang, B., et al. A digestive tract expressing α-amylase influences the adult lifespan of Pteromalus puparum revealed through RNAi and rescue analyses. Pest Manag Sci. 75 (12), 3346-3355 (2019).
- Zhou, J. C., et al. Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi is outcompeted by its uninfected counterpart in superparasitism but does not have developmental delay. Pest Manag Sci. 79 (3), 1005-1017 (2023).
- Zhou, J. C., et al. Posterior concentration of Wolbachia during the early embryogenesis of the host dynamically shapes the tissue tropism of Wolbachia in host Trichogramma wasps. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1198428 (2023).
- Lee, T. Y. The development of Trichogramma evanescens Westw. and its influence on the embryonic development of its host, Attacus cynthia ricini Boisd. Acta Entomol Sin Z. 11 (1), 89-119 (1961).
- Shen, Y., Chen, Y. Z., Zhang, C. X. RNAi-mediated silencing of genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens affects survival, growth and female fecundity. Pest Manag Sci. 77 (1), 365-377 (2021).
- Wu, S., Yin, S., Zhou, B. Molecular physiology of iron trafficking in Drosophila melanogaster. Curr Res Insect Sci. 50, 100888 (2022).
- Zhou, J. C., et al. Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission. mBio. 13 (6), e0236222 (2022).
- Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia. PeerJ. 7, e7567 (2019).
- Zhang, C., et al. Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi. Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).
- Zhang, X., et al. Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi. Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).
- Zhou, J. C., et al. Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts. Front Ecol Evol. 9, 730664 (2021).
- Flanders, S. E. Notes on the life history and anatomy of Trichogramma. Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).
