Summary
La manipulación del ARN de interferencia (ARNi) presenta un desafío formidable en muchas especies de parasitoides con tamaño diminuto, como las avispas Trichogramma . Este estudio delineó un método eficiente de ARNi en Trichogramma denrolimi. La presente metodología proporciona un modelo robusto para investigar la regulación génica en avispas Trichogramma .
Abstract
Los parasitoides del huevo, Trichogramma spp, son reconocidos como agentes de control biológico eficientes contra diversas plagas de lepidópteros en la agricultura y los bosques. Las etapas inmaduras de la descendencia de Trichogramma se desarrollan dentro del huevo huésped, exhibiendo una notable diminución (aproximadamente 0,5 mm de longitud adulta). La metodología de ARN de interferencia (ARNi) se ha convertido en una herramienta crucial para dilucidar las funciones de los genes en numerosos organismos. Sin embargo, la manipulación del ARNi en ciertas especies de parasitoides pequeños, como Trichogramma, generalmente ha planteado desafíos significativos. En este estudio, presentamos un método eficiente de ARNi en Trichogramma denrolimi. El procedimiento descrito abarca la adquisición y el aislamiento de muestras individuales de T. dendrolimi a partir de óvulos del huésped, el diseño y la síntesis de ARN bicatenario (dsRNA), el trasplante in vitro y el cultivo de pupas de T. dendrolimi , la microinyección de dsRNA y la posterior evaluación de la eliminación del gen diana mediante el análisis RT-qPCR. Este estudio proporciona un procedimiento completo y visualmente detallado para realizar experimentos de ARNi en T. dendrolimi, lo que permite a los investigadores investigar la regulación génica en esta especie. Además, esta metodología es adaptable para estudios de ARNi o microinyecciones en otras especies de Trichogramma con pequeños ajustes, lo que la convierte en una referencia valiosa para la realización de experimentos de ARNi en otras especies endoparásitas.
Introduction
Trichogramma spp. es un grupo de parasitoides de huevos que han sido ampliamente utilizados como agentes de control biológico altamente eficientes contra un amplio espectro de plagas de lepidópteros en ecosistemas agrícolas y forestales en todo el mundo 1,2,3,4. La aplicación de Trichogramma criado en masa proporciona un enfoque respetuoso con el medio ambiente para el manejo sostenible de plagas 5,6,7. La comprensión de la biología molecular de las avispas Trichogramma proporciona información valiosa para mejorar la eficiencia de la cría masiva y el rendimiento en el campo de estos agentes de control biológico 8,9 mediante la investigación de la metodología de regulación génica y edición del genoma10.
Desde el descubrimiento de la interferencia genética específica mediada por ARN bicatenario (dsRNA) en Caenorhabditis elegans en 1998, el método de ARN de interferencia (ARNi) se ha convertido en un conjunto de herramientas genéticas vitales para explorar los mecanismos reguladores de los organismos mediante la supresión de la expresión de genes diana11. Los experimentos con ARNi se han convertido en una metodología estándar ampliamente aplicada para estudiar la función génica en numerosas especies de insectos12,13. Sin embargo, la manipulación del ARNi presenta un desafío formidable en muchas especies de parasitoides, particularmente entre las pertenecientes a la familia endoparásita Chalcidoidea 14,15,16. El método ARNi ha sido documentado en al menos 13 especies de parasitoides 14,15,16,17,18,19. Entre estos, el enfoque de ARNi se ha llevado a cabo de manera integral en avispas Nasonia y es aplicable a lo largo de las etapas de desarrollo, incluidos embriones, larvas, pupas y adultos 14,15,16. Cabe destacar que las avispas Nasonia son ectoparasitoides, y sus crías se desarrollan en el espacio intersticial entre la pupa huésped y el pupario, lo que permite su cultivo in vitro y las hace tolerar ciertos tratamientos, como la microinyección. A diferencia de las avispas Nasonia, los individuos de Trichogramma experimentan todo su desarrollo embrionario, larval y pupal dentro del huevo huésped. La capa en estadios embrionario y larvario (que puede impedir la permeabilidad del dsRNA), la vulnerabilidad al daño y la dificultad para sobrevivir in vitro presentan obstáculos formidables 20,21,22. Además, el diminuto tamaño de los individuos de Trichogramma, aproximadamente ~0,5 mm de longitud adulta o pupa, los hace extremadamente intrincados para manipular 20,21,22.
En el presente estudio, describimos un procedimiento integral para realizar experimentos de ARN de interferencia (ARNi) en Trichogramma denrolimi Matsumura. Este procedimiento engloba los siguientes procedimientos: (1) el diseño y síntesis de ARN bicatenario (dsRNA), (2) microinyección de pupas de T. denrolimi, (3) el trasplante e incubación in vitro de estas pupas, y (4) la detección de knockdown de genes diana mediante análisis RT-qPCR. El gen diana seleccionado para el experimento de ARNi es la homología de cadena pesada de ferritina (Ferhch). El FerHCH, una proteína de unión al hierro, contiene un centro de ferroxidasa dotado de capacidades antioxidantes, lo que facilita la oxidación de Fe2+ a Fe3+. Desempeña un papel indispensable en el crecimiento y desarrollo de diversos organismos al mantener el equilibrio redox y la homeostasis del hierro. La depleción de FerHCH puede dar lugar a la acumulación excesiva de hierro, lo que conduce a daños irreversibles en los tejidos y, a menudo, culmina en alteraciones fenotípicas significativas, incluidos defectos de crecimiento, deformidades y mortalidad23,24. Este estudio ofrece una guía paso a paso para realizar ARNi en T. denrolimi, que será invaluable para investigar las funciones génicas dentro del contexto más amplio de las avispas Trichogramma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos, software y reactivos utilizados en este protocolo.
1. Recolección y mantenimiento del cultivo de insectos
- Adherir un grupo de ~5.000 huevos de Corcyra cephalonica (Stainton) en una tarjeta de 9 cm por 16 cm utilizando una solución 1:5 (v/v) de goma arábiga en polvo y agua25,26.
NOTA: Evite colocar demasiados huevos del huésped en la tarjeta, ya que el hacinamiento hace que no sea práctico para los procedimientos posteriores de transferencia y disección. - Para evitar la eclosión de los huevos del huésped, someta las tarjetas de huevos del huésped a 30 minutos de irradiación ultravioleta (UV) (Figura 1-i). Posteriormente, corte el papel con huevos inactivados en tarjetas de huevo de 1 cm de grosor y 8 cm de diámetro, conteniendo cada una aproximadamente 300-500 huevos (Figura 1-ii)25,26,27.
- Introducir una cohorte de 80-120 avispas T. denrolimi en un tubo de vidrio de 2 cm de diámetro y 8 cm de longitud. Sella el tubo con algodón.
NOTA: Mantener las avispas a una temperatura de 25 ± 1 °C, con un ciclo de luz/oscuridad de 16 h de luz y 8 h de oscuridad y mantener una humedad relativa de aproximadamente el 75%. - Presente una tarjeta de huevo del huésped a las avispas para que las parasiten (Figura 1-ii). Deje que las avispas depositen sus huevos en los huevos del huésped durante 6 h, después de lo cual retire rápidamente las avispas.
NOTA: Evite prolongar excesivamente el período de parasitación, ya que esto puede conducir a un hacinamiento de la descendencia de T. denrolimi dentro de un huevo huésped, lo que resulta en un aumento de la mortalidad de la avispa de la descendencia28,29.
2. Síntesis de dsRNA
- Diseñar conjuntos de cebadores que contengan un promotor T7 para la síntesis de ARN bicatenario (dsRNA). Elija un segmento de 300-400 pb del gen objetivo (Ferhch) para la síntesis de dsRNA.
- Adquirir conjuntos de cebadores sintetizados comercialmente para la producción de dsRNA para el gen objetivo y dsGFP para su uso como control negativo.
- Extraer el contenido de ARN de 100 avispas T. denrolimi utilizando el kit de referencia siguiendo el protocolo del fabricante9. Comprobar la calidad del contenido de ARN; si el valor de OD260/OD280 oscila entre 1,8 y 2,09.
- Purifique el contenido de ARN con 2 μL de tampón 5x (1 U/50 μL), 1 μL de ADNasa (1 U/50 μL) y 6,5 μL de ARN (~100 ng/μL), 0,5 μL deH2O a 42 °C durante 2 min.
- Realice la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) para generar una plantilla de ADNc con 10 μL de ARN purificado (~100 ng/μL), 4 μL de tampón 5x (1 U/50 μL), 1 μL de mezcla de enzimas I (1 U/50 μL) y 4 μL deH2O. Realice la RT-PCR con los siguientes ajustes: 37 °C durante 15 min, 85 °C durante 5 s. Almacenar el producto de ADNc a -4 °C hasta su uso.
- Realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de dsRNA de acuerdo con la mezcla maestra de referencia (10 μL de Taq II [1 U/50 μL], 0,8 μL de cebador directo [0,4 μM], 0,8 μL de cebador inverso [0,4 μM], 0,8 μL de molde de ADN [40 ng/μL] y 7,6 μL deH2O). Realice la PCR con los siguientes ajustes: 94 °C durante 2 min; 35 ciclos con 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s; 72 °C durante 2 min.
- Evaluar la calidad de los productos de PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2,0% 5,9 y confirmar la secuencia diana mediante secuenciación Sanger.
- Purifique el producto de PCR con el kit de extracción de gel según las pautas del fabricante 9,23.
- Utilice un sistema de ARNi para sintetizar dsRNA para el gen diana con 10 μL de tampón 2x (0,02 U/μL), 8 μL de molde de ADN (75 ng/μL) y 2 μL de mezcla de enzimas (1 U/50 μL) con los siguientes ajustes: 37 °C durante 30 min, 70 °C durante 10 min, y 25 °C durante 20 min. Eluir el dsRNA sintetizado con 30 μL de agua libre de nucleasas.
- Evaluar la calidad del producto dsRNA visualizándolo en un gel de agarosa al 1,0% 5,9. Diluir el dsRNA a 7.000 ng/μL. Comprobar la calidad del producto dsRNA; si el valor de OD260/OD280 oscila entre 1,8 y 2,09. Almacenar el producto dsRNA a -20 °C hasta su uso.
3. Trasplante de pupas de T. denrolimi
- Cultive los huevos del huésped parasitado durante aproximadamente 8 días a 25 ± 1 ° C, manteniendo un ciclo de 16 h de luz/8 h de oscuridad y una humedad relativa de ~ 75%. Los huevos del huésped parasitado se ennegrecerán después de 5 días30 (Figura 1-iv, v).
- Transfiera la tarjeta del huevo huésped a un microscopio de disección. Emplee un par de agujas de tungsteno (Figura 1-vi) para eliminar meticulosamente el corion de los huevos del huésped (Figura 1-vii) y recuperar la pupa del interior (Figura 1-viii)5,17,18.
NOTA: La punta de la aguja de disección debe ser inferior a 0,05 mm. - Prepare una placa limpia para el sustrato. Vierta 10-15 ml de una solución de agar de 15 g/L, dejando que se enfríe naturalmente (Figura 2-i).
NOTA: Mezcle la solución de agar con 0,5 g de estreptomicina para inhibir el crecimiento de contaminantes in vitro. - Emplee un buril desinfectado para grabar varias ranuras que midan 0,2-0,3 mm de profundidad y 0,4-0,8 mm de ancho (Figura 2-ii).
- Use un cepillo pequeño (Figura 2-iii) para trasplantar una pupa del huevo huésped diseccionado a una de las ranuras del sustrato de agar (Figura 2-iv).
- Repita los pasos 3.4 y 3.5, trasplantando 100-300 pupas individualmente en los surcos uno por uno (Figura 2-v).
4. Microinyección de dsRNA en la pupa de T. denrolimi
- Use un extractor de agujas de vidrio para extraer un capilar de vidrio (Figura 3-i, ii). Ajuste el calor a 280, la velocidad a 170, el retardo a 250 y el tirón a 30 en un extractor de agujas (Figura 3-iii). Prepare varias agujas de vidrio capilar para la microinyección (Figura 3-iv, v).
- Biselar la punta de la aguja de vidrio con una placa abrasiva (Figura 3-vi).
NOTA: Asegúrese de que la punta de la aguja de inyección permanezca afilada; de lo contrario, puede provocar la mortalidad de la pupa o impedir el flujo de reactivos a través de la aguja (Figura 3-vii). - Cargue aproximadamente 2 μL de la solución inyectable de dsRNA con 7.000 ng/μL en la aguja de inyección preparada utilizando una bomba de microinyección (Figura 3-vii).
- Transfiera el sustrato de agar que contiene cientos de pupas a la plataforma de un microscopio compuesto (Figura 3-viii).
- Inserte con cuidado la aguja de inyección en el abdomen de una pupa de T. denrolimi en un ángulo de ~30° con respecto al abdomen debajo de la lente (Figura 3-ix).
- Inyecte gradualmente ~ 5 nL de la solución inyectable (paso 4.3) en la pupa de T. denrolimi lo más suavemente posible.
NOTA: La pupa de T. denrolimi puede hincharse ligeramente a medida que se inyecta la solución de dsRNA. La inyección de una cantidad excesiva de solución en la pupa o el uso de agujas con aberturas demasiado grandes puede provocar la muerte prematura de la pupa. Cambie las agujas cuando se obstruyan después de inyectar varias o decenas de pupas. - Repita los pasos 4.5 y 4.6, inyectando dsRNA en 600 pupas una por una.
NOTA: Para un análisis confiable de RT-qPCR, el contenido de ARN debe aislarse de al menos 100 pupas. Inyectar al menos 600 pupas para tres réplicas en el tratamiento con dsRNA y tres réplicas en el control negativo de dsGFP 9.
5. Incubación de pupas de T. denrolimi
- Transfiera el sustrato que contiene las pupas inyectadas a una incubadora a 25 ± 1 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 16 h/8 h y ~75% HR.
- Incubar aproximadamente 700 pupas de T. denrolimi por tratamiento durante 24 h o 48 h. Extraer el contenido de ARN de un grupo de 100 pupas por réplica9.
NOTA: Retire las pupas encogidas (pupas muertas) de las muestras; de lo contrario, puede dar lugar a errores en la detección de la expresión génica. - Incubar ~50 pupas de T. denrolimi por tratamiento hasta que emerjan las avispas (Figura 3-x). Registre la tasa de emergencia y la tasa de deformidad.
6. Detección de la expresión génica diana
- Diseñar el conjunto de cebadores para el gen diana y los genes de referencia para RT-qPCR utilizando una herramienta de diseño.
NOTA: Asegúrese de que las secuencias de los cebadores RT-qPCR no se superpongan con la región objetivo del dsRNA. - Emplear el gen forkhead box O (FoxO) como gen de referencia en el análisis de RT-qPCR; los cebadores de FoxO han sido reportados previamente9.
- Obtener juegos de cebadores sintetizados comercialmente. Realice RT-qPCR con 10 μL de Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL de cebador directo (0,4 μM), 0,8 μL de cebador inverso (0,4 μM), 0,8 μL de molde (10 ng/μL) y 7,6 μL deH2O. Realice RT-qPCR con los siguientes ajustes: 95 °C durante 30 s; 35 ciclos con 95 °C durante 5 s, 57 °C durante 30 s, 72 °C durante 30; 95 °C durante 10 s; 60 °C durante 5 s y 95 °C durante 5 s.
- Calcular el valor de expresión del gen diana mediante el método 2-ΔΔCt 9,25.
- Emplear la prueba de Kruskal-Wallis para analizar la expresión del gen diana bajo la influencia de diferentes tratamientos (dsFerhch, dsGFP, no inyección).
NOTA: Evite el uso de pruebas paramétricas (p. ej., prueba t) para comparaciones post-hoc, ya que la heterocedasticidad y la no normalidad de los datos pueden llevar a conclusiones erróneas25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La tasa de emergencia de pupas de T. denrolimi inyectadas con dsFerhch fue significativamente menor que la de las inyectadas con dsGFP o las que no lo recibieron (Tabla 1). Entre las avispas emergidas, el 51,85% de las avispas T. denrolimi sometidas a dsFerhch desarrollaron pequeñas alas deformadas. Las avispas deformadas no se observaron en las avispas inyectadas con dsGFP o sin ninguna inyección (Tabla 1). Además, los abdómenes de las pupas de T. denrolimi inyectadas con dsFerhch exhibieron melanismo, que es el fenotipo del metabolismo anormal del hierro23. El melanismo no se observó en las pupas de T. denrolimi inyectadas con dsGFP ni en las que no lo recibieron (Figura 4).
El análisis de RT-qPCR mostró que la expresión de Ferhch en las pupas de T. denrolimi , 24 h después de la inyección de dsFerhch (0,6460 ± 0,0056), se reguló significativamente a la baja en comparación con las inyectadas con dsGFP (1,4514 ± 0,5402; P = 0,0415). Sin embargo, no difirió significativamente de la expresión en pupas sin ninguna inyección (1,0000 ± 0,1953; P = 0,8725). La expresión de Ferhch en pupas de T. denrolimi , 48 h después de la inyección de dsFerhch (0,5170 ± 0,0575), se reguló significativamente a la baja en comparación con las pupas inyectadas con dsGFP (0,8515 ± 0,0233; P = 0,0182) y los que no recibieron ninguna inyección (1,0548 ± 0,3006; P = 0,0113) (Figura 5).
Figura 1: Recolección y mantenimiento del cultivo de Trichogramma denrolimi . (i) Exponer las tarjetas de huevo del huésped a la irradiación ultravioleta (UV). (ii) Cortar el papel con huevos inactivados en tarjetas de huevos. (iii) Presentar una tarjeta de huevo huésped a las avispas para su parasitación. (iv) Cultivar los huevos del huésped parasitado durante 8 días. (v) Los huevos del huésped parasitado se ennegrecerán después de 5 días. (vi) La aguja de disección con punta de 0,04 mm. (vii) Retire el corion de los huevos del huésped. viii) Pupa de T. denrolimi . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Trasplante e incubación de pupas de Trichogramma denrolimi . i) El sustrato de agar. (ii) Emplee un grabador desinfectado para grabar varias ranuras en el sustrato. (iii) Use un cepillo pequeño para (iv) trasplantar las pupas del huevo huésped disecado a una ranura en el sustrato. (v) Trasplantar 100-300 pupas individualmente en las ranuras una por una. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Procedimiento de microinyección. i) Capilar de vidrio. (ii) Extractor de agujas de vidrio. (iii) Ajustes para el extractor de agujas. (iv) Preparar múltiples agujas de vidrio capilar para la microinyección. (v) La punta de la aguja de vidrio capilar. (vi) Biselar la punta de la aguja de vidrio con una placa abrasiva. (vii) Cargue aproximadamente 2 μL de la solución inyectable de dsRNA. viii) Microscopio compuesto. ix) Inserte la aguja de inyección en el abdomen e inyecte la solución inyectable. x) Aparición de avispas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Características morfológicas de la pupa y avispa Trichogramma denrolimi . La pupa y la avispa inyectadas con dsFerhch exhiben melanismo con el color del cuerpo ennegrecido. La avispa inyectada con dsFerhch muestra un par de pequeñas alas deformadas. El melanismo y las alas deformadas no se observan en la pupa y la avispa inyectadas con dsGFP ni en las que no lo tienen. Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Expresión del gen diana Ferhch en relación con FoxO a las 24 h y 48 h después de la inyección de dsFerhch o dsGFP , o no inyección. Las barras de error indican los errores estándar. Diferentes letras minúsculas indican una diferencia significativa en P < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Variables | dsFerhch | dsGFP | Sin inyección | χ2 | P |
| Tasa de emergencia | 54,00% (27/50) b | 78,00% (39/50) a | 90.00% (45/50) a | 17.46 | <.001 |
| Tasa de deformidad | 51.85% (14/27) A | 0% (0/39) B | 0% (0/45) B | 49.84 | <.001 |
Tabla 1: Aparición y deformidad de Trichogramma denrolimi inyectado por dsFerhch, dsGFP o sin inyección. Diferentes letras minúsculas indican diferencias significativas en la tasa de emergencia a P < 0.05. Diferentes letras mayúsculas indican diferencias significativas en la tasa de deformidad a P < 0,05. Los valores de χ2 y P enumerados en la tabla se estiman mediante la prueba independiente χ2 e indican el efecto total de tres niveles de tratamiento sobre la tasa de emergencia y la tasa de deformidad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las avispas Trichogramma son reconocidas como agentes de control biológico eficaces, dirigidos específicamente a una variedad de plagas de lepidópteros en la agricultura y la silvicultura1. Estas diminutas avispas pasan por sus etapas inmaduras dentro del huevo huésped, una característica que presenta desafíos en la realización de experimentos de ARNi 5,18. Este estudio ofrece una guía visual completa para la realización de experimentos de ARNi en T. denrolimi. Dados los rasgos biológicos compartidos entre las especies de Trichogramma, el procedimiento puede adaptarse fácilmente para estudios de ARNi o microinyecciones en otras especies de Trichogramma y especies endoparásitas con algunos ajustes.
El procedimiento introduce varios enfoques innovadores, que facilitan microinyecciones eficientes del contenido de dsRNA, agilizan el proceso de RT-qPCR para T. denrolimi y optimizan el trasplante y la incubación in vitro de las pupas de T. denrolimi. Según este estudio, la tasa de emergencia de pupas trasplantadas alcanzó el 90% sin ninguna inyección. Cuando las pupas trasplantadas fueron sometidas a la inyección de dsGFP, la tasa de emergencia de estas pupas fue del 78% (Tabla 1). El éxito de los experimentos de ARNi en Trichogramma depende en gran medida de microinyecciones precisas y de la incubación cuidadosa de las pupas in vitro. La susceptibilidad de las pupas aisladas de Trichogramma al daño durante la inyección puede deberse a agujas de microinyección de gran tamaño, técnicas de inyección apresuradas o contaminación microbiana en el sustrato de agar. El método visual detallado que se presenta aquí también ofrece información sobre la técnica de microinyección en T. denrolimi, que no solo es esencial para otras herramientas de edición genética (por ejemplo, el sistema CRISPR-Cas9), sino también para realizar diversos experimentos fisiológicos (por ejemplo, la transinfección artificial de simbiontes y la administración de inhibidores o activadores de respuestas fisiológicas)1,14,15,16.
Para el análisis de RT-qPCR, se inyectaron aproximadamente 1.500 pupas en este estudio. Dado el pequeño tamaño de T. denrolimi, es necesario un mínimo de 100 pupas por réplica para garantizar una calidad y cantidad de ARN suficiente para el análisis de RT-qPCR9. En consecuencia, es imperativo inyectar dsRNA en cientos de pupas. Además, se requieren mejoras en el procedimiento de aislamiento de ARN (por ejemplo, emplear un kit de extracción de ARN específico, refinar los programas de PCR) para obtener el contenido de ARN elegible de un número reducido de individuos de Trichogramma por réplica. Un enfoque alternativo implica la administración de dsRNA a través del remojo o la alimentación, lo que puede ser más conveniente para obtener un número sustancial de individuos sometidos a dsRNA. Además, es esencial tener en cuenta que el procedimiento actual de ARNi es aplicable solo en la etapa de pupa de T. denrolimi. La investigación futura debe poner especial énfasis en el desarrollo de métodos eficientes de ARNi para los estadios embrionario y larvario15,16.
En resumen, este estudio ha delineado un método eficiente de ARNi en T. denrolimi. Durante décadas, las funciones de los genes dentro de todo el género Trichogramma han sido raramente exploradas. La presente metodología proporciona un modelo robusto para investigar las regulaciones génicas durante el desarrollo y las actividades fisiológicas en avispas Trichogramma. La investigación futura debería enfatizar el desarrollo de herramientas genéticas, como la edición del genoma y la interferencia de ARN en avispas Trichogramma. La exploración en profundidad de la biología molecular de las avispas Trichogramma ofrece información valiosa para mejorar la eficiencia de la cría masiva y el rendimiento en campo de estos agentes de control biológico para el control de plagas 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por los Proyectos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32172476, 32102275), el Programa de Innovación en Ciencia y Tecnología Agrícola (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) y los Fondos Centrales que Orientan el Desarrollo Local de la Ciencia y la Tecnología (XZ202301YD0042C).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2x ES Taq MasterMix (Dye) | Cowin Biotech, China | CW0690H | To amplify the dsRNA sequences |
| 20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6) | Sangon Biotech, China | B540627-0500 | To dilute dsRNA |
| Agar strip | Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China | n/a | To make culture medium |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech, China | A610028 | To make culture medium |
| Bioer Constant temperature metal bath | BIOER, China | MB-102 | To synthesis dsRNA |
| Borosilicate glass capillary | WPI, USA | 1B100-4 | To pull capillary glass needle |
| Clean bench | Airtech, China | SW-CJ-1FD | To extract RNA |
| Double distilled water | Sangon Biotech, China | A500197-0500 | To dilute cDNA |
| Environmental Testing chamber | Panasonic, Japan | MLR-352H-PC | To culture T. denrolimi |
| Eppendorf Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5418R | To store RNA content |
| Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendrof, Germany | FemtoJet 4i | To inject T. denrolimi |
| Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendrof, Germany | 5810R | Centrifuge |
| Ethanol solution (75%, RNase-free) | Aladdin, China | M052131-500ml | To extract RNA |
| Gel Extraction Kit | Omega, USA | D25000-02 | To extract cDNA |
| GUM Arabic | Solarbio, China | CG5991-500g | To make egg card |
| Isopropyl alchohol | Aladdin, China | 80109218 | To extract RNA |
| Laser-Based Micropipette Puller | SUTTER, USA | P-2000 | To pull capillary glass needle |
| Microloader | Eppendrof, Germany | 20 µL | To load dsRNA |
| Multi-sample tissue grinder | LICHEN, China | LC-TG-24 | To grind T. denrolimi |
| Needle Grinder | SUTTER, USA | BV-10-E | To grind capillary glass needle |
| Nuclease-Free Water | Sangon Biotech, China | To dilute RNA | |
| OLYMPUS Microscope | OLYMPUS, Japan | XZX16 | To observe T. denrolimi |
| PCR machine | Bio-rad, USA | S-1000 | For DNA amplification |
| PowerPac Basic | Bio-rad, USA | PowerPacTM Basic | To detect the quality of dsRNA |
| Primer of dsGFP (Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA |
||
| Primer of dsGFP (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG |
||
| Primer of Ferhch for qPCR (Forward) | TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT | ||
| Primer of Ferhch for qPCR (Reverse) | CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT | ||
| Primer of Ferhch for RNAi (Reverse) | [TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC |
||
| Primer of Ferhch for RNAi(Forward) | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG |
||
| Primer of FoxO for qPCR (Forward) | CTACGCCGATCTCATAACGC | ||
| Primer of FoxO for qPCR (Reverse) | TGCTGTCGCCCTTGTCCT | ||
| PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) | TaKaRa, Japan | RR047A | |
| Quantitative Real-time PCR | Bio-rad, USA | CFX 96 Touch | To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) |
| Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool | https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ | ||
| T7 RiBoMAX Express RNAi System | Promega, USA | P1700 | To synthesis dsRNA in vitro |
TB Green Premix Ex TaqTM  (Til RnaseH Plus) |
TaKaRa, Japan | RR820A | To perform RT-qPCR |
| Trichloromethane | KESHI, China | GB/T682-2002 | To extract RNA |
| TRIzol Reagent | Ambion, USA | 15596018 | To extract total RNA content from samples |
| Ultra-low Temperature Freezer | Thermo, USA | Forma 911 |
References
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
- Zhou, J. C., et al. Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Lepidoptera: Saturniidae). Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).
- Li, T. H., et al. Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids. J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).
- Zhou, J. C., et al. Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing. Sci Rep. 9 (1), 18114 (2019).
- Zhou, J. C., et al. Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs. Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).
- Huang, N. X., et al. Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China. Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).
- Wang, P., et al. Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis. Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).
- Ning, S. F., et al. The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). Front Physiol. 14, 1243753 (2023).
- Huo, L. X., et al. Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883 (2022).
- Leung, K., et al. Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics. Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
- Sun, Y., et al. Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants. Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. J Vis Exp. 130, e56990 (2017).
- Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis. J Vis Exp. 166, e61892 (2020).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
- Zhu, K. Y., Palli, S. R. Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference. Annu Rev Entomol. 65, 293-311 (2020).
- Colinet, D., et al. Development of RNAi in a Drosophila endoparasitoid wasp and demonstration of its efficiency in impairing venom protein production. J Insect Physiol. 63, 56-61 (2014).
- Wang, B., et al. A digestive tract expressing α-amylase influences the adult lifespan of Pteromalus puparum revealed through RNAi and rescue analyses. Pest Manag Sci. 75 (12), 3346-3355 (2019).
- Zhou, J. C., et al. Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi is outcompeted by its uninfected counterpart in superparasitism but does not have developmental delay. Pest Manag Sci. 79 (3), 1005-1017 (2023).
- Zhou, J. C., et al. Posterior concentration of Wolbachia during the early embryogenesis of the host dynamically shapes the tissue tropism of Wolbachia in host Trichogramma wasps. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1198428 (2023).
- Lee, T. Y. The development of Trichogramma evanescens Westw. and its influence on the embryonic development of its host, Attacus cynthia ricini Boisd. Acta Entomol Sin Z. 11 (1), 89-119 (1961).
- Shen, Y., Chen, Y. Z., Zhang, C. X. RNAi-mediated silencing of genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens affects survival, growth and female fecundity. Pest Manag Sci. 77 (1), 365-377 (2021).
- Wu, S., Yin, S., Zhou, B. Molecular physiology of iron trafficking in Drosophila melanogaster. Curr Res Insect Sci. 50, 100888 (2022).
- Zhou, J. C., et al. Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission. mBio. 13 (6), e0236222 (2022).
- Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia. PeerJ. 7, e7567 (2019).
- Zhang, C., et al. Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi. Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).
- Zhang, X., et al. Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi. Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).
- Zhou, J. C., et al. Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts. Front Ecol Evol. 9, 730664 (2021).
- Flanders, S. E. Notes on the life history and anatomy of Trichogramma. Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).
