Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

RNA-interferens i egget parasitoid, Trichogramma dendrolimi matsumura

Published: November 21, 2023 doi: 10.3791/66250
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,2, 1
1College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, 2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences

Summary

Manipulering av RNA-interferens (RNAi) gir en formidabel utfordring hos mange parasitoide arter med liten størrelse, som Trichogramma-veps . Denne studien avgrenset en effektiv RNAi-metode i Trichogramma denrolimi. Dagens metodikk gir en robust modell for å undersøke genregulering hos Trichogramma-veps .

Abstract

Eggparasitoider, Trichogramma spp, er anerkjent som effektive biologiske bekjempelsesmidler mot ulike lepidopteran i jord- og skog. De umodne stadiene av Trichogramma-avkom utvikler seg i vertsegget, og viser bemerkelsesverdig diminutivitet (ca. 0,5 mm i voksen lengde). RNA-interferens (RNAi) metodikk har dukket opp som et avgjørende verktøy for å belyse genfunksjoner i mange organismer. Imidlertid har manipulering av RNAi hos visse små parasitoide arter, som Trichogramma, generelt utgjort betydelige utfordringer. I denne studien presenterer vi en effektiv RNAi-metode i Trichogramma denrolimi. Den skisserte prosedyren omfatter oppkjøp og isolering av individuelle T. dendrolimi-prøver fra vertsegg, design og syntese av dobbeltstrenget RNA (dsRNA), in vitro-transplantasjon og dyrking av T. dendrolimi-pupper , mikroinjeksjon av dsRNA og den påfølgende vurderingen av målgen-knockdown gjennom RT-qPCR-analyse. Denne studien gir en omfattende, visuelt detaljert prosedyre for å gjennomføre RNAi-eksperimenter i T. dendrolimi, og dermed gjøre det mulig for forskere å undersøke genreguleringen i denne arten. Videre er denne metoden tilpasningsdyktig for RNAi-studier eller mikroinjeksjoner i andre Trichogramma-arter med mindre justeringer, noe som gjør den til en verdifull referanse for å utføre RNAi-eksperimenter i andre endoparasittiske arter.

Introduction

Trichogramma spp. er en gruppe eggparasitoider som har blitt mye brukt som svært effektive biologiske kontrollmidler mot et bredt spekter av lepidopteran i landbruks- og skogøkosystemer over hele verden 1,2,3,4. Anvendelsen av masseoppdrettet Trichogramma gir en miljøvennlig tilnærming til bærekraftig forvaltning av 5,6,7. Å forstå molekylærbiologien til Trichogramma-veps gir verdifull innsikt i å forbedre masseoppdrettseffektiviteten og feltytelsen til disse biologiske kontrollmidlene 8,9 ved å undersøke metodikken for genregulering og genomredigering10.

Siden oppdagelsen av dobbeltstrenget RNA (dsRNA) -mediert spesifikk genetisk interferens i Caenorhabditis elegans i 1998, har RNA-interferens (RNAi) -metoden utviklet seg til en viktig genetisk verktøykasse for å utforske regulatoriske mekanismer av organismer ved å undertrykke uttrykket av målgener11. RNAi-eksperimenter har blitt en standardmetodikk som er mye brukt for å studere genfunksjon i mange insektarter12,13. Likevel utgjør manipuleringen av RNAi en formidabel utfordring hos mange parasitoide arter, spesielt blant de som tilhører den endoparasittiske Chalcidoidea-familien 14,15,16. RNAi-metoden er dokumentert hos minst 13 parasitoide arter: 14,15,16,17,18,19. Blant disse har RNAi-tilnærmingen blitt grundig utført i Nasonia-veps og gjelder gjennom utviklingsstadiene, inkludert embryoer, larver, pupper og voksne 14,15,16. Det er bemerkelsesverdig at Nasonia-veps er ektoparasitoider, med deres avkom som utvikler seg i det interstitielle rommet mellom vertspuppen og pupariumet, noe som muliggjør dyrking in vitro og får dem til å tolerere visse behandlinger, for eksempel mikroinjeksjon. I motsetning til Nasonia-veps, gjennomgår Trichogramma-individer hele embryonal-, larve- og puppeutviklingen indre vertsegget. Laget på embryo- og larvestadier (som kan hindre dsRNA-permeabilitet), sårbarhet for skade og vanskeligheten med å overleve in vitro presenterer formidable hindringer 20,21,22. I tillegg gjør den lille størrelsen på Trichogramma-individer, omtrent ~ 0,5 mm i voksen eller puppelengde, dem svært intrikate for å manipulere 20,21,22.

I denne studien skisserer vi en omfattende prosedyre for å gjennomføre RNA-interferens (RNAi) eksperimenter i Trichogramma denrolimi Matsumura. Denne prosedyren omfatter følgende prosedyrer: (1) design og syntese av dobbeltstrenget RNA (dsRNA), (2) mikroinjeksjon av T. denrolimi pupper, (3) transplantasjon og in vitro inkubasjon av disse puppene, og (4) påvisning av målgenknockdown gjennom RT-qPCR-analyse. Målgenet valgt for RNAi-eksperimentet er ferritin tungkjedehomologi (Ferhch). FerHCH, et jernbindende protein, inneholder et ferroksidasesenter utstyrt med antioksidantegenskaper, noe som letter oksidasjonen av Fe2+ til Fe3+. Det spiller en uunnværlig rolle i vekst og utvikling av ulike organismer ved å opprettholde redokslikevekt og jernhomeostase. Uttømming av FerHCH kan resultere i overakkumulering av jern, noe som fører til irreversibel vevsskade, og kulminerer ofte i betydelige fenotypiske endringer, inkludert vekstdefekter, deformiteter og dødelighet23,24. Denne studien gir en trinnvis veiledning for å gjennomføre RNAi i T. denrolimi, som vil være uvurderlig for å undersøke genfunksjonene i den bredere sammenhengen med Trichogramma-veps.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, instrumenter, programvare og reagenser som brukes i denne protokollen.

1. Innsamling og vedlikehold av insektkultur

  1. Fest en gruppe på ~ 5,000 egg av Corcyra cephalonica (Stainton) på et 9 cm x 16 cm kort ved hjelp av en 1: 5 (v / v) løsning av tyggegummi arabisk pulver og vann25,26.
    MERK: Unngå å feste for mange vertsegg til kortet, da overbefolkning gjør det upraktisk for påfølgende overførings- og disseksjonsprosedyrer.
  2. For å forhindre klekking av vertsegg, utsett vertseggkortene for 30 minutter ultrafiolett (UV) bestråling (figur 1-i). Deretter skjærer du papiret med inaktiverte egg i eggkort som måler 1 cm tykt og 8 cm i diameter, som hver inneholder ca. 300-500 egg (figur 1-ii)25,26,27.
  3. Introduser en kohort på 80-120 T. denrolimi veps i et glassrør som måler 2 cm i diameter og 8 cm i lengde. Forsegl røret med bomull.
    MERK: Hold vepsene ved en temperatur på 25 ± 1 °C, med en lys/mørk syklus på 16 timer lys og 8 timer mørke, og oppretthold en relativ fuktighet på ca. 75 %.
  4. Presenter et vertseggkort til vepsene for parasitisering (figur 1-ii). La vepsene legge eggene sine i vertseggene i 6 timer, og fjern deretter vepsene umiddelbart.
    MERK: Unngå å forlenge parasitiseringsperioden overdrevet, da dette kan føre til overbefolkning av T. denrolimi avkom i et vertsegg, noe som resulterer i økt avkom veps dødelighet28,29.

2. Syntese av dsRNA

  1. Design primersett som inneholder en T7-promotor for syntese av dobbeltstrenget RNA (dsRNA). Velg et 300-400 bp segment fra det målrettede genet (Ferhch) for dsRNA-syntese.
  2. Skaff kommersielt syntetiserte primersett for produksjon av dsRNA for det målrettede genet og dsGFP for bruk som en negativ kontroll.
  3. Trekk ut RNA-innhold fra 100 T. denrolimi veps ved hjelp av det refererte settet etter produsentens protokoll9. Kontroller kvaliteten på RNA-innholdet; fortsett hvis verdien av OD260 / OD280 varierer fra 1,8 til 2,09.
  4. Rens RNA-innholdet med 2 μL 5x buffer (1 U / 50 μL), 1 μL DNAse (1 U / 50 μL) og 6,5 μL RNA (~ 100 ng / μL), 0,5 μL H2O ved 42 ° C i 2 minutter.
  5. Utfør revers transkriptasepolymerasekjedereaksjon (RT-PCR) for å generere en cDNA-mal med 10 μL renset RNA (~100 ng / μL), 4 μL 5x buffer (1 U / 50 μL), 1 μL enzymblanding I (1 U / 50 μL) og 4 μL H2O. Utfør RT-PCR med følgende innstillinger: 37 °C i 15 minutter, 85 °C i 5 s. Oppbevar cDNA-produktet ved -4 °C til bruk.
  6. Utfør polymerasekjedereaksjon (PCR) for å amplifisere dsRNA-sekvensene i samsvar med den refererte masterblandingen (10 μL Taq II [1 U / 50 μL], 0,8 μL fremoverprimer [0,4 μM], 0,8 μL reversprimer [0,4 μM], 0,8 μL DNA-mal [40 ng / μL] og 7,6 μL H2O). Utfør PCR med følgende innstillinger: 94 °C i 2 minutter; 35 sykluser med 94 °C i 30 s, 60 °C i 30 s, 72 °C i 30; 72 °C i 2 min.
  7. Vurder kvaliteten på PCR-produkter ved elektroforese på en 2.0% agarosegel 5,9 og bekreft målsekvensen gjennom Sanger-sekvensering.
  8. Rens PCR-produktet ved hjelp av Gel Extraction Kit i henhold til produsentens retningslinjer 9,23.
  9. Bruk et RNAi-system til å syntetisere dsRNA for målgenet med 10 μL 2x buffer (0,02 U / μL), 8 μL DNA-mal (75 ng / μL) og 2 μL enzymblanding (1 U / 50 μL) med følgende innstillinger: 37 ° C i 30 minutter, 70 ° C i 10 minutter og 25 ° C i 20 minutter. Elute det syntetiserte dsRNA med 30 μL nukleasefritt vann.
  10. Vurder kvaliteten på dsRNA-produktet ved å visualisere det på en 1,0% agarosegel 5,9. Fortynn dsRNA til 7,000 ng / μL. Kontroller kvaliteten på dsRNA-produktet; fortsett hvis verdien av OD260 / OD280 varierer fra 1,8 til 2,09. Oppbevar dsRNA-produktet ved -20 °C til bruk.

3. Transplantasjon av T. denrolimi pupper

  1. Dyrk de parasiterte vertseggene i omtrent 8 dager ved 25 ± 1 ° C, opprettholde en 16 t lys / 8 h mørk syklus og en relativ fuktighet på ~ 75%. De parasitiserte vertseggene vil sverte etter 5 dager30 (figur 1-iv,v).
  2. Overfør vertseggkortet til et dissekerende mikroskop. Bruk et par wolframnåler (figur 1-vi) for omhyggelig å fjerne korionen fra vertseggene (figur 1-vii) og hente puppen innenfra (figur 1-viii) 5,17,18.
    MERK: Spissen av skillenålen skal være mindre enn 0,05 mm.
  3. Forbered en ren plate for underlaget. Hell ut 10-15 ml av en 15 g/l agaroppløsning, slik at den blir naturlig avkjølt (figur 2-i).
    MERK: Bland agaroppløsningen med 0,5 g streptomycin for å hemme veksten av forurensninger in vitro.
  4. Bruk en desinfisert graver til å etse flere spor som måler 0,2-0,3 mm i dybden og 0,4-0,8 mm i bredden (figur 2-ii).
  5. Bruk en liten pensel (figur 2-iii) til å transplantere en puppe fra det dissekerte vertsegget inn i et av sporene på agarsubstratet (figur 2-iv).
  6. Gjenta trinn 3.4 og 3.5, transplanter 100-300 pupper individuelt i sporene en etter en (figur 2-v).

4. Mikroinjiserende dsRNA i T. denrolimi puppe

  1. Bruk en kanyletrekker til å trekke en glasskapillær (figur 3-i,ii). Sett varmen til 280, hastigheten til 170, forsinkelsen til 250 og trekket til 30 på en nåletrekker (figur 3-iii). Klargjør flere kapillære glassnåler til mikroinjeksjon (figur 3-iv,v).
  2. Skråkant spissen av glassnålen med en slipeplate (figur 3-vi).
    MERK: Forsikre deg om at kanylens spiss forblir skarp. Ellers kan det føre til dødelighet av pupper eller hindre reagensstrømmen gjennom nålen (figur 3-vii).
  3. Legg ca. 2 μL av dsRNA-injeksjonsoppløsningen med 7000 ng/μL inn i den klargjorte injeksjonsnålen ved hjelp av en mikroinjeksjonspumpe (figur 3-vii).
  4. Overfør agarsubstratet som inneholder hundrevis av pupper til plattformen i et sammensatt mikroskop (figur 3-viii).
  5. Stikk injeksjonsnålen forsiktig inn i buken på en T. denrolimi-puppe i ~30° vinkel mot magen under linsen (figur 3-ix).
  6. Injiser ~5 nL av injeksjonsvæsken (trinn 4.3) gradvis inn i T. denrolimi puppen så forsiktig som mulig.
    MERK: T. denrolimi puppen kan hovne litt opp når dsRNA-oppløsningen injiseres. Injisering av en overdreven mengde oppløsning i puppen eller bruk av nåler med altfor store åpninger kan føre til for tidlig puppedød. Bytt nåler når de blir tilstoppet etter å ha injisert flere til titalls pupper.
  7. Gjenta trinn 4.5 og 4.6, injiser dsRNA i 600 pupper en etter en.
    MERK: For pålitelig RT-qPCR-analyse bør RNA-innhold isoleres fra minst 100 pupper. Injiser minst 600 pupper for tre replikater i dsRNA-behandlingen og tre replikater i dsGFP-negativ kontroll9.

5. Inkubasjon av T. denrolimi pupper

  1. Overfør substratet som inneholder injiserte pupper til en inkubator ved 25 ± 1 °C med en 16 timer / 8 h lys / mørk syklus og ~ 75% RF.
  2. Inkuber ca. 700 T. denrolimi pupper per behandling i enten 24 timer eller 48 timer. Trekk ut RNA-innhold fra en gruppe på 100 pupper per replikat9.
    MERK: Fjern de krympede puppene (døde pupper) fra prøvene; Ellers kan det føre til feil i påvisning av genuttrykk.
  3. Inkuber ~50 T. denrolimi pupper per behandling til vepsene dukker opp (Figur 3-x). Registrer fremvekstraten og deformitetshastigheten.

6. Påvisning av målrettet genuttrykk

  1. Design primersettet for målgenet og referansegenene for RT-qPCR ved hjelp av et designverktøy.
    MERK: Forsikre deg om at sekvensene til RT-qPCR-primerne ikke overlapper med det målrettede området av dsRNA.
  2. Bruk gengaffelhodeboksen O (FoxO) som referansegen i RT-qPCR-analysen; primerne til FoxO har blitt rapportert tidligere9.
  3. Få kommersielt syntetiserte primersett. Utfør RT-qPCR med 10 μL Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL fremoverprimer (0,4 μM), 0,8 μL reversprimer (0,4 μM), 0,8 μL mal (10 ng/μL) og 7,6 μLH2O. Utfør RT-qPCR med følgende innstillinger: 95 °C i 30 s; 35 sykluser med 95 °C i 5 s, 57 °C i 30 s, 72 °C i 30; 95 °C i 10 s; 60 °C i 5 s, og 95 °C i 5 s.
  4. Beregn ekspresjonsverdien til det målrettede genet ved å bruke 2-ΔΔCt-metoden 9,25.
  5. Bruk Kruskal-Wallis-testen for å analysere uttrykket av målgenet under påvirkning av forskjellige behandlinger (dsFerhch, dsGFP, ikke-injeksjon).
    MERK: Unngå å bruke parametriske tester ( f.eks. t-test) for post-hoc-sammenligninger, da dataenes heteroscedastisitet og ikke-normalitet kan føre til feilaktige konklusjoner25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forekomsten av T. denrolimi-pupper injisert med dsFerhch var signifikant lavere enn hos de som ble injisert med dsGFP eller de uten injeksjon (tabell 1). Blant de oppståtte vepsene utviklet 51,85% av T. denrolimi-vepsene utsatt for dsFerhch deformerte små vinger. De deformerte vepsene ble ikke observert hos vepsene injisert med dsGFP eller uten injeksjon (tab 1). Videre viste magen til T. denrolimi-pupper injisert med dsFerhch melanisme som er fenotypen av unormal jernmetabolisme23. Melanismen ble ikke observert hos T. denrolimi-pupper injisert med dsGFP eller de uten injeksjon (figur 4).

RT-qPCR-analyse viste at uttrykket av Ferhch i T. denrolimi pupper, 24 timer etter dsFerhch injeksjon (0,6460 ± 0,0056), var signifikant nedregulert i forhold til de injisert med dsGFP (1,4514 ± 0,5402; P = 0,0415). Det skilte seg imidlertid ikke vesentlig fra uttrykket hos pupper uten injeksjon (1.0000 ± 0.1953; P = 0,8725). Ferhch-uttrykk i T. denrolimi-pupper , 48 timer etter dsFerhch-injeksjon (0,5170 ± 0,0575), ble signifikant nedregulert sammenlignet med pupper injisert med dsGFP (0,8515 ± 0,0233; P = 0,0182) og de uten injeksjon (1,0548 ± 0,3006; P = 0,0113) (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Innsamling og vedlikehold av Trichogramma denrolimi kultur. (i) Utsett vertseggkortene for ultrafiolett (UV) bestråling. (ii) Skjær papiret med inaktiverte egg i eggekort. (iii) Presenter et vertseggkort til vepsene for parasitisering. (iv) Dyrk de parasitiserte vertseggene i 8 dager. (v) De parasitiserte vertseggene vil sverte etter 5 dager. (vi) Dissekeringsnålen med 0,04 mm spiss. (vii) Fjern korionen fra vertseggene. (viii) T. denrolimi puppe . Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Transplantasjon og inkubasjon av Trichogramma denrolimi pupper. (i) Agar-substratet. (ii) Bruk en desinfisert graver for å etse flere spor på underlaget. (iii) Bruk en liten børste til å (iv) transplantere puppene fra det dissekerte vertsegget til et spor på underlaget. (v) Transplantere 100-300 pupper individuelt i sporene en etter en. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Prosedyre for mikroinjeksjon. (i) Glass kapillær. (ii) Glasskanyletrekker. (iii) Innstillinger for nåletrekker. (iv) Klargjør flere kapillære glassnåler for mikroinjeksjon. (v) Spissen av kapillærglassnålen. (vi) Skråkant spissen av glassnålen med en slipeplate. (vii) Legg ca. 2 μl av dsRNA-injeksjonsoppløsningen. (viii) Sammensatt mikroskop. (ix) Stikk injeksjonsnålen inn i magen og injiser injeksjonsvæsken. (x) Fremveksten av veps. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Morfologiske egenskaper av Trichogramma denrolimi puppe og veps. Puppen og vepsen injisert med dsFerhch utviser melanisme med svart kroppsfarge. Vepsen injisert med dsFerhch viser et par deformerte små vinger. Melanisme og deformerte vinger observeres ikke i puppen og vepsen injisert med dsGFP eller de uten injeksjon. Skalastenger = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Ekspresjon av målgenet Ferhch i forhold til FoxO ved 24 timer og 48 timer etter dsFerhch eller dsGFP-injeksjon , eller ikke-injeksjon. Feilfelt angir standardfeilene. Ulike små bokstaver indikerer en signifikant forskjell ved P < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Variabler dsFerhch dsGFP Ikke-injeksjon χ2 P
Nødsituasjon rate 54,00 % (27/50) b 78,00 % (39/50) a 90,00 % (45/50) a 17.46 <.001
Deformitetsgrad 51,85 % (14/27) A 0 % (0/39) B 0 % (0/45) B 49.84 <.001

Tabell 1: Tilsynekomst og deformitet av Trichogramma denrolimi injisert av dsFerhch, dsGFP eller uten injeksjon. Ulike små bokstaver indikerer signifikante forskjeller i nødsituasjon ved P < 0,05. Ulike store bokstaver indikerer signifikante forskjeller i deformitetsrate ved P < 0,05. Verdiene av χ2 og P oppført i tabellen er estimert ved χ2 uavhengig test og indikerer den totale effekten av tre behandlingsnivåer på fremvekstraten og deformitetsraten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trichogramma veps er anerkjent som effektive biologiske kontrollmidler, spesielt rettet mot en rekke lepidopteran i jord- og skogbruk1. Disse diminutive vepsene gjennomgår sine umodne stadier i vertsegget, en egenskap som gir utfordringer med å gjennomføre RNAi-eksperimenter 5,18. Denne studien gir en omfattende visuell veiledning for å gjennomføre RNAi-eksperimenter i T. denrolimi. Gitt de delte biologiske egenskapene blant Trichogramma-arter, kan prosedyren lett tilpasses for RNAi-studier eller mikroinjeksjoner i andre Trichogramma-arter og endoparasittiske arter med noen justeringer.

Prosedyren introduserer flere innovative tilnærminger, som muliggjør effektive mikroinjeksjoner av dsRNA-innhold, strømlinjeformer RT-qPCR-prosessen for T. denrolimi, og optimaliserer transplantasjonen og in vitro-inkubasjonen av T. denrolimi-pupper. Ifølge denne studien nådde fremveksten av transplanterte pupper 90% uten injeksjon. Når de transplanterte puppene ble utsatt for dsGFP-injeksjon, var forekomsten av disse puppene 78 % (tabell 1). Vellykkede RNAi-eksperimenter i Trichogramma henger betydelig på presise mikroinjeksjoner og forsiktig inkubasjon av pupper in vitro. Følsomheten til isolerte Trichogramma-pupper for skade under injeksjon kan skyldes store mikroinjeksjonsnåler, forhastede injeksjonsteknikker eller mikrobiell forurensning på agarsubstratet. Den detaljerte visuelle metoden som presenteres her, gir også innsikt i mikroinjeksjonsteknikken i T. denrolimi, som ikke bare er avgjørende for andre genetiske redigeringsverktøy (f.eks. CRISPR-Cas9-systemet), men også for å utføre ulike fysiologiske eksperimenter (f.eks. kunstig transinfeksjon av symbionter og levering av hemmere eller aktivatorer av fysiologiske responser)1,14,15,16.

For RT-qPCR-analyse ble ca. 1 500 pupper injisert i denne studien. Gitt den lille størrelsen på T. denrolimi, er det nødvendig med minimum 100 pupper per replikat for å sikre tilstrekkelig RNA-kvalitet og kvantitet for RT-qPCR-analyse9. Følgelig er det viktig å injisere dsRNA i hundrevis av pupper. I tillegg kreves forbedringer i RNA-isolasjonsprosedyren (f.eks. Bruk av et spesifikt RNA-ekstraksjonssett, raffinering av PCR-programmer) for å oppnå kvalifisert RNA-innhold fra et redusert antall Trichogramma-individer per replikat. En alternativ tilnærming innebærer levering av dsRNA gjennom soaking eller fôring, noe som kan være mer praktisk for å skaffe et betydelig antall individer utsatt for dsRNA. I tillegg er det viktig å merke seg at den nåværende RNAi-prosedyren kun gjelder på puppestadiet av T. denrolimi. Fremtidig forskning bør legge særlig vekt på utvikling av effektive RNAi-metoder for embryo- og larvestadiene15,16.

Oppsummert har denne studien avgrenset en effektiv RNAi-metode i T. denrolimi. I flere tiår har genfunksjoner innen hele Trichogramma-slekten sjelden blitt utforsket. Den nåværende metodikken gir en robust modell for å undersøke genreguleringer under utviklingsmessige og fysiologiske aktiviteter i Trichogramma veps. Fremtidig forskning bør legge vekt på utvikling av genetiske verktøy, som genomredigering og RNA-interferens i Trichogramma-veps. Dybdeutforskningen av molekylærbiologien til Trichogramma-vepsene gir verdifull innsikt for å forbedre masseoppdrettseffektiviteten og feltytelsen til disse biologiske kontrollmidlene for kontroll av 8,9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne forskningen ble finansiert av prosjektene fra National Natural Science Foundation of China (32172476, 32102275), Agricultural Science and Technology Innovation Program (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) og Central Funds Guiding the Local Science and Technology Development (XZ202301YD0042C).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye) Cowin Biotech, China CW0690H To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6) Sangon Biotech, China B540627-0500 To dilute dsRNA
Agar strip Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China n/a To make culture medium
Ampicillin sodium Sangon Biotech, China A610028 To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath  BIOER, China MB-102 To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary  WPI, USA 1B100-4 To pull capillary glass needle
Clean bench  Airtech, China SW-CJ-1FD To extract RNA
Double distilled water Sangon Biotech, China A500197-0500 To dilute cDNA
Environmental Testing chamber  Panasonic, Japan MLR-352H-PC To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge  Eppendrof, Germany 5418R To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i Eppendrof, Germany FemtoJet 4i To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge  Eppendrof, Germany 5810R Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free) Aladdin, China M052131-500ml To extract RNA
Gel Extraction Kit Omega, USA D25000-02 To extract cDNA
GUM Arabic Solarbio, China CG5991-500g To make egg card
Isopropyl alchohol Aladdin, China 80109218 To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller  SUTTER, USA P-2000 To pull capillary glass needle
Microloader  Eppendrof, Germany 20 µL To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder  LICHEN, China LC-TG-24 To grind T. denrolimi
Needle Grinder  SUTTER, USA BV-10-E To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water Sangon Biotech, China To dilute RNA
OLYMPUS Microscope OLYMPUS, Japan XZX16 To observe T. denrolimi
PCR machine  Bio-rad, USA S-1000 For DNA amplification
PowerPac Basic Bio-rad, USA PowerPacTM Basic To detect the quality of dsRNA 
Primer of dsGFP (Forward) [TAATACGACTCACTATAGGG]
ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse) [TAATACGACTCACTATAGGG]
CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward) TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse) CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse) [TAATACGACTCACTATAGGG]AG
TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward) [TAATACGACTCACTATAGGG]
ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward) CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse) TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) TaKaRa, Japan RR047A
Quantitative Real-time PCR  Bio-rad, USA CFX 96 Touch To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System Promega, USA P1700 To synthesis dsRNA  in vitro 
TB Green Premix Ex TaqTM Equation 1 (Til RnaseH Plus) TaKaRa, Japan RR820A To perform RT-qPCR
Trichloromethane KESHI, China GB/T682-2002 To extract RNA
TRIzol Reagent Ambion, USA 15596018 To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer  Thermo, USA Forma 911

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives. Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).
  2. Zhou, J. C., et al. Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Lepidoptera: Saturniidae). Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).
  3. Li, T. H., et al. Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids. J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).
  4. Zhou, J. C., et al. Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing. Sci Rep. 9 (1), 18114 (2019).
  5. Zhou, J. C., et al. Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs. Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).
  6. Huang, N. X., et al. Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China. Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).
  7. Wang, P., et al. Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis. Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).
  8. Ning, S. F., et al. The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). Front Physiol. 14, 1243753 (2023).
  9. Huo, L. X., et al. Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae). J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883 (2022).
  10. Leung, K., et al. Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics. Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).
  11. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  12. Leonard, S. P., et al. Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens. Science. 367 (6477), 573-576 (2020).
  13. Sun, Y., et al. Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants. Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).
  14. Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. J Vis Exp. 130, e56990 (2017).
  15. Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis. J Vis Exp. 166, e61892 (2020).
  16. Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
  17. Zhu, K. Y., Palli, S. R. Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference. Annu Rev Entomol. 65, 293-311 (2020).
  18. Colinet, D., et al. Development of RNAi in a Drosophila endoparasitoid wasp and demonstration of its efficiency in impairing venom protein production. J Insect Physiol. 63, 56-61 (2014).
  19. Wang, B., et al. A digestive tract expressing α-amylase influences the adult lifespan of Pteromalus puparum revealed through RNAi and rescue analyses. Pest Manag Sci. 75 (12), 3346-3355 (2019).
  20. Zhou, J. C., et al. Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi is outcompeted by its uninfected counterpart in superparasitism but does not have developmental delay. Pest Manag Sci. 79 (3), 1005-1017 (2023).
  21. Zhou, J. C., et al. Posterior concentration of Wolbachia during the early embryogenesis of the host dynamically shapes the tissue tropism of Wolbachia in host Trichogramma wasps. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1198428 (2023).
  22. Lee, T. Y. The development of Trichogramma evanescens Westw. and its influence on the embryonic development of its host, Attacus cynthia ricini Boisd. Acta Entomol Sin Z. 11 (1), 89-119 (1961).
  23. Shen, Y., Chen, Y. Z., Zhang, C. X. RNAi-mediated silencing of genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens affects survival, growth and female fecundity. Pest Manag Sci. 77 (1), 365-377 (2021).
  24. Wu, S., Yin, S., Zhou, B. Molecular physiology of iron trafficking in Drosophila melanogaster. Curr Res Insect Sci. 50, 100888 (2022).
  25. Zhou, J. C., et al. Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission. mBio. 13 (6), e0236222 (2022).
  26. Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia. PeerJ. 7, e7567 (2019).
  27. Zhang, C., et al. Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi. Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).
  28. Zhang, X., et al. Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi. Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).
  29. Zhou, J. C., et al. Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts. Front Ecol Evol. 9, 730664 (2021).
  30. Flanders, S. E. Notes on the life history and anatomy of Trichogramma. Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).

Tags

Biologi utgave 201
RNA-interferens i egget parasitoid, <em>Trichogramma dendrolimi</em> matsumura
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, L. x., Dong, Q. j., Yang, S., … More

Zhang, L. x., Dong, Q. j., Yang, S., Che, W. n., Zhang, L. s., Zhou, J. c., Dong, H. RNA Interference in the Egg Parasitoid, Trichogramma dendrolimi Matsumura. J. Vis. Exp. (201), e66250, doi:10.3791/66250 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter