تحليل الجينات من المجتمعات الميكروبية البحرية باستخدام Transcriptomics البيئية
Summary
نقدم طريقة لتوليد [كدنا] من مرنا البيئية. بشكل عام ، يتم تجميعها أولا من مجموع الحمض النووي الريبي والبيئة ، ويتم إزالة بشكل انتقائي الرنا الريباسي ، يتم تضخيمه بشكل انتقائي مرنا ، والتسلسل [كدنا] توليفها من تجمع مرنا المخصب. متواليات يمكن استردادها المشروح باستخدام معيار تقنيات المعلوماتية الحيوية لتحديد الجينات التي أعرب عنها.
Abstract
مماثلة لmetagenomics ، transcriptomics البيئية (metatranscriptomics) باسترداد ومتواليات mRNAs البيئية فيف من الجراثيم دون معرفة مسبقة لما الجينات قد يكون التعبير عن المجتمع. وبالتالي فإنه يوفر وجهة نظر غير منحازة أكثر على التعبير الجيني المجتمع<em> في الموقع</em>. البروتوكولات البيئية transcriptomics صعبة من الناحية الفنية منذ mRNAs بروكاريوتيك عموما تفتقر إلى بولي (A) التي تجعل من ذيول عزلة حقيقية النواة رسائل واضحة نسبيا<sup> 1</sup> ولأن من نصف سكان العالم يعيشون قصيرة نسبيا من mRNAs<sup> 2</sup>. بالإضافة إلى ذلك ، mRNAs هي اقل بكثير من وفرة في rRNAs مقتطفات الحمض النووي الريبي مجموع ، وبالتالي خلفية الرنا الريباسي يثقل كاهل كثير من الأحيان إشارات مرنا. ومع ذلك ، فقد تم مؤخرا التقنيات للتغلب على بعض هذه الصعوبات المتقدمة. وقد وصفت مؤخرا إجراء تحليل transcriptomes البيئية من خلال إنشاء مكتبات استنساخ باستخدام بادئات عشوائية لعكس تدوين وتضخيم mRNAs البيئية كان ناجحا في البيئتين الطبيعية المختلفة ، ولكن النتائج التي كانت متحيزة اختيار عشوائي الاشعال تستخدم لبدء تجميع [كدنا]<sup> 3</sup>. التقدم في تضخيم خطي مرنا يغني عن الحاجة إلى الاشعال عشوائية في خطوة التضخيم وتجعل من الممكن استخدام مواد أقل بدءا خفض الوقت اللازم للتجهيز وجمع عينات من الحمض النووي الريبي ، وبالتالي الحد من تدهور<sup> 4</sup>.<em> في المختبر</emطرق النسخ> مرنا لتضخيم تنطوي polyadenylating ومرنا وإدماج المروج T7 إلى نهاية 3 من النص. ويمكن بعد ذلك تضخيم الحمض النووي الريبي (آرنا) يمكن تحويلها إلى مضاعفة [كدنا] تقطعت به hexamers العشوائية والتسلسل مباشرة pyrosequencing<sup> 5</sup>. أظهر أول استخدام لهذه الطريقة في محطة الوها فائدتها للتميز الميكروبية التعبير الجيني المجتمع<sup> 6</sup>.
Protocol
Discussion
وقد أصبح التحقيق في التعبير الجيني للمجتمعات الميكروبية الطبيعية شيوعا في السنوات الأخيرة كوسيلة لاستكشاف الأدوار البيئية ووظائف الكائنات الحية الدقيقة. استعملت في تآلف مع الكشف والتقدير الكمي ، وتوصيف الكائنات المجهرية البحرية ، ويمكن استخدام تحليل التعبير الجي…
Acknowledgements
تم توفير التمويل بواسطة غوردون وبيتي مور منح المؤسسة والمؤسسة الوطنية للعلوم منح MCB – 0702125.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | QIAGEN | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega | A7280 |
References
- Liang, P., Pardee, A. B. . Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G., Belasco, J. G., Brawerman, G. Control of messenger RNA stability. , 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. . 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. . Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. . Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. . Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. . Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
