Analyse von Genexpressionsdaten aus marinen mikrobiellen Gemeinschaften mit Environmental Transcriptomics
Summary
Wir stellen eine Methode zur Erzeugung von cDNA aus Umwelt-mRNA. In der Regel Gesamt-RNA zunächst aus der Umgebung gesammelt, rRNA selektiv entfernt, mRNA wird selektiv verstärkt und cDNA aus der angereicherten mRNA-Pool synthetisiert wird sequenziert. Recovered Sequenzen annotiert werden unter Verwendung von Standard Bioinformatik Techniken, um die exprimierten Gene zu identifizieren.
Abstract
Analog zu Metagenomik, Umwelt Transkriptomik (metatranscriptomics) abruft und Sequenzen Umwelt mRNAs aus einer mikrobiellen Assemblage ohne vorherige Kenntnis, welche Gene die Gemeinde könnte zum Ausdruck. So bietet die unvoreingenommene Sicht auf Gemeinschaft Genexpression<em> In situ</em>. Environmental Transkriptomik Protokolle sind technisch schwierig, da prokaryotische mRNAs in der Regel die Poly (A)-Enden, die Isolation zu machen von eukaryotischen Nachrichten relativ einfach mangelnde<sup> 1</sup> Und wegen der relativ kurzen Halbwertszeiten von mRNAs<sup> 2</sup>. Darüber hinaus mRNAs viel seltener als rRNAs in Gesamt-RNA extrahiert werden, damit eine rRNA Hintergrund oft überfordert mRNA-Signale. Allerdings haben Techniken zur Überwindung einiger dieser Schwierigkeiten vor kurzem entwickelt worden. Ein Verfahren zur Analyse von Umwelt-Transkriptomen durch die Schaffung von Klon-Bibliotheken unter Verwendung zufälliger Primer Reverse Transkription und verstärken Umwelt mRNAs wurde kürzlich beschrieben, wurde in zwei verschiedenen natürlichen Umgebungen erfolgreich, aber die Ergebnisse waren durch die Wahl des zufälligen Primer verwendet, um cDNA-Synthese zu initiieren voreingenommen<sup> 3</sup>. Advances in lineare Verstärkung der mRNA überflüssig machen random Primer bei der Amplifikation Schritt und machen es möglich, weniger Ausgangsmaterial verwenden Verringerung der Erfassung und Verarbeitung von Proben und minimiert dadurch RNA-Abbau<sup> 4</sup>.<em> In-vitro-</em> Transkription Methoden zur Amplifikation mRNA beinhalten polyadenylating der mRNA wurden, mit einem T7-Promotor auf die 3 Ende des Transkripts. Amplified RNA (aRNA) kann dann auf den cDNA Doppelzimmer mit zufälligen Hexameren und direkt sequenziert von Pyrosequenzierung<sup> 5</sup>. Eine erste Anwendung dieser Methode an der Station ALOHA demonstriert seine Nützlichkeit für die Charakterisierung von mikrobiellen Gemeinschaft Genexpression<sup> 6</sup>.
Protocol
Discussion
Die Untersuchung der Genexpression durch natürliche mikrobielle Gemeinschaften hat sich in den letzten Jahren häufig als Mittel, um die ökologische Rolle und Funktion von Mikroorganismen zu entdecken. In Kombination mit dem Nachweis, Quantifizierung und Charakterisierung von marinen Mikroorganismen, können Analysen der Genexpression verwendet werden, um Phylogenie Link in natürlicher mikrobieller Gemeinschaften funktionieren. Viele Techniken der gezielten funktionellen Genexpression beruhen auf spezifischen Sonden …
Acknowledgements
Die Finanzierung wurde von der Gordon and Betty Moore Foundation Zuschüsse und der National Science Foundation Grant MCB-0702125 zur Verfügung gestellt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | QIAGEN | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega | A7280 |
References
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