환경 Transcriptomics를 사용하여 해양 미생물 커뮤니티의 유전자 발현 분석
Summary
우리는 환경 mRNA로부터 cDNA 생성하는 방법을 제시한다. 일반적으로, 총 RNA는 먼저 환경에서 수집, rRNA는 선택, 제거 mRNA가 선택적으로 증폭되고 농축 mRNA 수영장에서 합성된 cDNA가 합성됩니다. 복구된 시퀀스는 표현 유전자를 식별하는 표준 생물 정보학 기술을 사용하여 주석하실 수 있습니다.
Abstract
metagenomics 유사, 환경 transcriptomics (metatranscriptomics) 검색 및 커뮤니티 표현이 될 일을 유전자의 사전 지식없이도 미생물의 조립에서 시퀀스 환경 mRNAs합니다. 그러므로 그것은 사회의 유전자 발현에 가장 불편 관점을 제공합니다<em> 현장에서</em>. prokaryotic mRNAs은 일반적으로 비교적 간단 진핵세포 메시지의 고립을 폴리 (A) 꼬리가 부족 때문에 환경 transcriptomics 프로토콜은 기술적으로 어렵습니다<sup> 1</sup> 때문에 mRNAs의 비교적 짧은 반 삶의<sup> 2</sup>. 또한, mRNAs 훨씬 덜 풍부한 총 RNA 추출물에 rRNAs보다되며, 따라서 rRNA 배경은 종종 mRNA 신호를 압도. 그러나, 이러한 어려움의 일부를 극복을위한 기술은 최근에 개발되었습니다. 리버스 녹음과 환경 mRNAs를 증폭하기 위해 무작위 primers를 사용하여 복제 라이브러리를 작성하여 환경 transcriptomes 분석을위한 절차는 최근에 두 개의 서로 다른 자연 환경에서 성공적으로 설명했지만, 결과는 cDNA 합성을 시작하는 데 사용되는 임의 primers의 선택에 의해 편향된되었습니다<sup> 3</sup>. mRNA의 선형 증폭의 진보는 증폭 단계에서 무작위로 primers의 필요성을 사전에 제거하다 그것이 가능한 샘플의 수집과 처리 시간을 감소시키고 RNA 저하를 최소화 적은 시작 자료를 사용할 수 있도록<sup> 4</sup>.<em> 체외에서</em확장 mRNA에 대한> 전송 방법은 mRNA를 polyadenylating 및 성적 증명서의 3 월말에 T7 프로 모터를 통합하는 방식입니다. 증폭된 RNA (아르나)는 pyrosequencing하여 다음 임의 hexamers를 사용하여 cDNA를 두 번 좌초로 변환하고 직접 합성 수 있습니다<sup> 5</sup>. 역 알로하에서이 메서드의 첫 번째 사용은 미생물 사회의 유전자 발현을 특성화에 대한 유틸리티를 시연<sup> 6</sup>.
Protocol
Discussion
천연 미생물 커뮤니티에 의해 유전자 발현의 조사 미생물의 생태 역할과 기능을 탐구하는 수단으로 최근 몇 년 동안 일반되었다. 해양 미생물의 감지, 부량, 그리고 특성화와 함께 사용, 유전자 발현의 분석은 자연 미생물 지역 사회에 기능 phylogeny를 연결하는 데 사용할 수 있습니다. 기능성 유전자 발현을 대상으로 많은 기술은 특정 프로브 또는 알려진 일련의 유전자위한 프라이머 세트에 의존?…
Acknowledgements
기금은 고든 무어와 베티 재단 보조금 및 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 MCB – 0702125에 의해 제공되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | QIAGEN | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega | A7280 |
References
- Liang, P., Pardee, A. B. . Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G., Belasco, J. G., Brawerman, G. Control of messenger RNA stability. , 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. . 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. . Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
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- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. . Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. . Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
