環境トランスクリプトミクスを使って海洋微生物群集からの遺伝子発現の分析
Summary
私たちは、環境のmRNAからcDNAを生成するための方法を提示する。一般的に、トータルRNAは、最初の環境から収集され、rRNAを選択的に除去され、mRNAが選択的に増幅され、濃縮mRNAのプールから合成したcDNAは、配列決定される。回収された配列は、発現遺伝子を識別するために、標準的なバイオインフォマティクス技術を用いて注釈を付けることができます。
Abstract
コミュニティが表現されるかもしれないものの遺伝子の事前の知識がなくてもメタゲノム、環境トランスクリプト（metatranscriptomics）を取得し、配列の微生物集団からの環境のmRNAに似ています。したがって、コミュニティの遺伝子発現に最も公平な視点を提供<em>その場で</em>。原核生物のmRNAは、一般に真核生物のメッセージの分離は比較的簡単なようにポリ（A）テールが不足しているため、環境トランスクリプトミクスのプロトコルは、技術的に困難です。<sup> 1</sup>とするためのmRNAの比較的短い半減期の<sup> 2</sup>。さらに、mRNAがあまり豊富なトータルRNAの抽出物中のrRNAsよりも、こうしてrRNAの背景には、多くの場合、mRNAの信号を圧倒する。しかし、これらの困難のいくつかを克服するための手法が最近開発されている。逆転写と環境mRNAを増幅するためのランダムプライマーを用いてクローンライブラリを作成することにより、環境のトランスクリプトームを分析するための手順は、最近記述されていた二つの異なる自然環境では正常終了しましたが、結果はcDNA合成を開始するために使用されるランダムプライマーの選択によってバイアスされた<sup> 3</sup>。 mRNAの線形増幅の進歩により、増幅の段階でランダムプライマーの必要性を未然に防ぐ、それが可能なサンプルの収集と処理時間を減少し、それによってRNAの分解を最小限に少なく、出発物質を使用すること<sup> 4</sup>。<em>試験管内で</em>増幅mRNAの転写の方法は、mRNAをpolyadenylatingと転写産物の3末端にT7プロモーターを組み込んだ伴う。増幅RNA（aRNAを）パイロシーケンシングによって、ランダムヘキサマーを用いて本鎖cDNAをdouble型に変換されると直接配列決定することができます<sup> 5</sup>。駅ALOHAにおけるこのメソッドの最初の使用は、微生物群集の遺伝子発現を特徴付けるために、その有用性を実証<sup> 6</sup>。
Protocol
Discussion
天然の微生物群集による遺伝子発現の調査では、微生物の生態学的役割と機能を探求するための手段として近年一般的になっている。海洋微生物の検出、定量、および特性評価と組み合わせて使用される、遺伝子発現の解析は、自然の微生物群集に機能するように系統発生をリンクするために使用することができます。機能的な遺伝子発現を標的とするための多くの技術は、特定のプロ?…
Acknowledgements
資金は、ゴードンとベティムーア財団の助成金と国立科学財団の助成金MCB – 0702125で提供されていました。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | QIAGEN | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega | A7280 |
References
- Liang, P., Pardee, A. B. . Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G., Belasco, J. G., Brawerman, G. Control of messenger RNA stability. , 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. . 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. . Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. . Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. . Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. . Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
