Çevre transkriptomik kullanarak Deniz Mikrobiyal Toplulukları Gen İfade Analizi
Summary
Biz çevre mRNA cDNA üreten için bir yöntem sunuyoruz. Genel olarak, toplam RNA ilk çevreden toplanan, rRNA seçici kaldırılır mRNA seçici yükseltilir ve zenginleştirilmiş mRNA havuzu sentezlenen cDNA dizisi. Kurtarılan dizileri ifade genleri tanımlamak için standart biyoinformatik teknikleri kullanarak açıklamalı olabilir.
Abstract
Metagenomics benzer, çevre transkriptomik (metatranscriptomics) alır ve topluluk ifade ne olabilir genler hakkında önceden bilgi sahibi olmadan bir mikrobiyal birleşmesi dizileri çevre mRNA'ların. Böylece toplum gen ekspresyonu en tarafsız bir bakış açısı sağlar<em> In situ</em>. Çevre transkriptomik protokolleri prokaryotik mRNA'ların genellikle oldukça basit bir ökaryotik mesajları izolasyonu poli (A) kuyrukları eksikliği bu yana teknik olarak zor<sup> 1</sup> Çünkü mRNA'ların nispeten kısa yarım hayatımızın<sup> 2</sup>. Buna ek olarak, mRNA'ların toplam RNA özleri rRNA göre çok daha az bol, böylece bir rRNA arka plan genellikle mRNA sinyalleri bunaltıyor. Ancak, bu zorlukların üstesinden gelmek için teknikleri geliştirilmiştir. Ters yazıya ve çevresel mRNA'ların yükseltmek için rastgele primerler kullanılarak klon kütüphaneler oluşturarak çevresel transcriptomes analiz için bir prosedür son zamanlarda iki farklı doğal ortamlarda başarılı oldu tarif edilmiştir, ancak sonuçları cDNA sentezi başlatmak için kullanılan rastgele primerler seçimi önyargılı<sup> 3</sup>. MRNA doğrusal amplifikasyon gelişmeler amplifikasyon adımda rastgele primerler için ihtiyaç bırakmayacak ve mümkün numune toplama ve işleme süresini azaltarak ve böylece RNA bozulması en aza indirerek daha az başlangıç materyali kullanmak<sup> 4</sup>.<em> In vitro</em> Yükseltme mRNA transkripsiyon yöntemleri mRNA polyadenylating ve transkript, 3 ucuna bir T7 organizatörü içeren içerir. Amplifiye RNA (Arna) pyrosequencing sonra rastgele hekzamer kullanarak mahsur cDNA çift dönüştürülecek ve doğrudan sıralı.<sup> 5</sup>. Bu yöntemin ilk kullanımı İstasyonu ALOHA mikrobiyal topluluğun gen ekspresyonu tanımlamak için kendi programını gösterdi<sup> 6</sup>.
Protocol
Discussion
Gen ekspresyonu doğal mikrobiyal topluluklar tarafından soruşturma mikroorganizmaların ekolojik rolleri ve fonksiyonları keşfetmek için bir araç olarak son yıllarda yaygın hale gelmiştir. Deniz mikroorganizmaların tespiti, ölçme ve karakterizasyonu ile birlikte kullanıldığında, gen ekspresyon analizi, doğal mikrobiyal topluluklar fonksiyonu filogeni bağlantı kullanılabilir. Fonksiyonel gen ekspresyonu hedefleyen için pek çok teknikler dizisi bilinen genler için tasarlanmış spesifik problar vey…
Acknowledgements
Finansman Gordon ve Betty Moore Vakfı hibe ve Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB-0702125 tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | QIAGEN | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega | A7280 |
References
- Liang, P., Pardee, A. B. . Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G., Belasco, J. G., Brawerman, G. Control of messenger RNA stability. , 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. . 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. . Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. . Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. . Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. . Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
