El análisis de la expresión génica de las comunidades microbianas marinas con Transcriptómica Ambiental

Summary

Se presenta un método para la generación de cDNA a partir del ARNm del medio ambiente. En general, el ARN total se recogen la primera del medio ambiente, se elimina selectivamente rRNA, mRNA se amplifica de forma selectiva, y cDNA sintetizado a partir de la piscina es la secuencia de ARNm enriquecido. Secuencias recuperadas se pueden anotar utilizando las técnicas de bioinformática para identificar los genes que se expresan.

Abstract

Análoga a la metagenómica, la transcriptómica del medio ambiente (metatranscriptomics) recupera y las secuencias de ARNm del medio ambiente a partir de un conjunto microbiana sin conocimiento previo de lo que los genes de la comunidad puede expresar. Por lo tanto, ofrece la perspectiva más imparcial en la expresión de genes de la comunidad<em> In situ</em>. Protocolos ambientales transcriptómica son técnicamente difícil, ya que los ARNm procariotas generalmente carecen de la poli (A) las colas que hacen que el aislamiento de los mensajes de eucariotas relativamente sencillo¹ Y por la vida media relativamente corta de los ARNm². Además, los ARNm son mucho menos abundantes que en el total de rRNAs extractos de ARN, por lo tanto un fondo rRNA menudo sobrepasa las señales de ARNm. Sin embargo, las técnicas para la superación de algunas de estas dificultades se han desarrollado recientemente. Un procedimiento para analizar transcriptomes ambiental mediante la creación de bibliotecas clon usando cebadores aleatorios a inversa transcribir y ampliar los ARNm del medio ambiente fue descrito recientemente tuvo éxito en dos entornos naturales diferentes, pero los resultados estaban sesgados por la selección de los cebadores aleatorios usados ​​para iniciar la síntesis de ADNc³. Los avances en la amplificación lineal de ARNm de obviar la necesidad de cebadores aleatorios en la etapa de amplificación y hacer posible el uso de menos material de partida la disminución de la recogida y el tiempo de procesamiento de las muestras y lo que minimiza la degradación del ARN⁴.<em> In vitro</emMétodos> transcripción de ARNm de amplificación implican polyadenylating el ARNm y la incorporación de un promotor T7 en el extremo 3 de la transcripción. Amplifica ARN (ARNA), entonces se puede convertir en doble varados cDNA usando hexámeros al azar y secuenciado directamente por pirosecuenciación⁵. Un primer uso de este método en la Estación ALOHA demostrado su utilidad para la caracterización de la expresión de genes microbianos comunidad⁶.

Protocol

Trabajar con ARN Debido a RNasas son ubicuos y ARNm se degrada rápidamente, las precauciones estándar para trabajar en un ambiente libre de ribonucleasa se deben seguir y las muestras deben ser procesadas o en conserva tan pronto como sea posible después de la recolección. Parte 1: Colección Ambiental de ARN (diseñado para recoger la biomasa en la fracción de tamaño de 0,2 a 3,0 micras) Material necesario: <br /…

Discussion

La investigación de la expresión génica de las comunidades microbianas naturales se ha vuelto común en los últimos años como un medio para explorar los roles y funciones ecológicas de los microorganismos. Utilizado en combinación con la detección, cuantificación y caracterización de microorganismos marinos, análisis de expresión génica puede ser utilizado para conectar la filogenia de funcionar en las comunidades microbianas naturales. Muchas de las técnicas para dirigir la expresión de genes funcionales…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PowerSoil Bead Tubes	kit	MoBio	12866-25-PBT
RNeasy Mini Kit	kit	QIAGEN	74104
TURBO DNA-free	kit	Ambion	AM1907
mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit	kit	Epicentre	MOP51010/MOP51024
MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit	kit	Ambion	AM1905
MICROBEnrich kit	kit	Ambion	AM1901
MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit	kit	Ambion	AM1790
Universal RiboClone cDNA Synthesis System	kit	Promega	C4360
Wizard DNA Clean-Up System	kit	Promega	A7280