جمع والحفظ بالتبريد من البويضات والأجنة الهامستر ماوس
Summary
في هذه المقالة عن طريق الفيديو نقدم مظاهرة خطوة بخطوة حول كيفية جمع البويضات وcryopreserve الهامستر مع ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة بعد ذوبان الجليد. يمكن أيضا أن يطبق نفس الإجراء لتجميد والذوبان بنجاح أجنة فئران في مراحل مختلفة من التطور سابق للانغراس.
Abstract
وكانت أول أجنة البويضات cryopreserved بنجاح أكثر من 30 عاما مضت ، عندما يتنغهام<i> وآخرون.</i><sup> 1</sup> ويلموت<sup> 2</sup> صفها بشكل منفصل يمكن أن يتم تجميد الأجنة وتخزينها على الماوس -196 درجة مئوية ، وبعد سنوات قليلة ، Parkening<i> وآخرون</i>.<sup> 3</supذكرت> ولادة نسل الحية الناتجة عن التخصيب في المختبر (IVF) من البويضات cryopreserved. منذ ذلك الحين ، انتشر استخدام تقنيات الحفظ بالتبريد سريعا ليصبح عنصرا أساسيا في ممارسة المساعدة على الإنجاب البشري والحيواني والحفاظ على الموارد الوراثية الحيوانية. حاليا ، هناك اثنين من الطرق الرئيسية المستخدمة لcryopreserve البويضات والأجنة : تجميد بطيئة والتزجيج. وقد استخدمت مجموعة متنوعة واسعة من النهج في محاولة لتحسين كل من التقنيات والملايين من الحيوانات والآلاف من الأطفال قد ولدوا من أجنة cryopreserved. ومع ذلك ، وأوجه القصور الهامة المرتبطة الحفظ بالتبريد لا يزال يتعين التغلب عليها ، ومنذ تشكيل الجليد الكريستال ، وآثار الصدمة التناضحي الحل ويبدو أن السبب cryoinjuries عدة في مرحلة ما بعد إذابة البويضات والأجنة. تجميد التجميد البطيء مع برمجة لديه ميزة استخدام تركيزات منخفضة من cryoprotectants ، التي ترتبط عادة مع المواد الكيميائية والسمية التناضحي صدمة ، ولكن قدرتها محدودة لتجنب الجليد تشكيل الكريستال في تركيزات منخفضة. التجميد البطيء يدفع أيضا آثار supercooling أنه يجب تجنب استخدام بذر يدوية أو أوتوماتيكية<sup> 4</sup>. في عملية التزجيج ، تركيزات عالية من cryoprotectants يمنع تشكيل بلورات الجليد ، وتؤدي إلى تشكيل دولة المزجج شبيهة بالزجاج التي توطد الماء ، ولكن لا الموسعة. ومع ذلك ، ونظرا لسمية cyroprotectants في التركيزات المستخدمة ، لا يمكن إلا البويضات / الأجنة أن تتعرض للحل cryoprotectant لفترة قصيرة جدا من الزمن ، والحل في حجم الحد الأدنى ، وذلك قبل غمر العينات مباشرة في النيتروجين السائل<sup> 5</sup>. في العقد الأخير ، أصبح أكثر شعبية التزجيج لأنه هو وسيلة سريعة جدا التي تتطلب أية معدات باهظة الثمن (الفريزر برمجة). ومع ذلك ، يستمر التجميد البطيء ليكون الأسلوب الأكثر استخداما لالبويضة / جنين الحفظ بالتبريد. في هذا المقال نعرض الفيديو ، خطوة بخطوة ، وكيفية جمع وتجميد البويضات ببطء الهامستر مع ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة بعد ذوبان الجليد. يمكن أيضا أن يطبق نفس الإجراء لتجميد والذوبان بنجاح أجنة فئران في مراحل مختلفة من التطور سابق للانغراس.
Protocol
Discussion
يمكن أن يكون هذا مع البويضات والأجنة الهامستر بروتوكول الماوس cryopreserved بنجاح. المجمدة مرة واحدة ، يمكن تخزين البويضات / الأجنة في النيتروجين السائل الدبابات إلى أجل غير مسمى وتسترد في أي زمان أو مكان المطلوب. هذا يوفر ميزة وجود عينات جاهزة تقريبا لاستخدام كلما دعت الحاجة. من ناحي?…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل MINISTERIO Ciencia الاسبانية دي ذ Educación (BIO 2006-11792) وكتالونيا دي كاتالونيا (2005 SGR00437). وأود أن أشكر كتاب مارك لوكاس Jonatan Puigcerver ولما قدموه من مساعدة فنية في إعداد وسائل الإعلام. ومن المسلم به جميع الموظفين من Estabulari ديفوار Servei للإسكان الحيوانات ، وخصوصا خوان خوسيه مارتن وخافيير بنيتو لمساهمتهم إضافية حول تسجيل جزء من هذا الفيديو. البنك الأهلي التجاري هو زميل في الفقرة قرينتها البرتغالية ه Ciência بحوث والتكنولوجيا وسان جرمان هو زميل إسباني MINISTERIO دي Educación Ciencia ذ.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U. Cryobiological principles of embryo freezing. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).
- Vajta, G., Kuwayama, M. Improving cryopreservation systems. Theriogenology. 65, 236-244 (2006).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. JoVE. 3, (2007).
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
