Sammlung und Kryokonservierung von Oozyten Hamster und Maus Embryonen
Summary
In diesem Video-Artikel präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Demonstration von Möglichkeiten zur Sammlung und Kryokonservierung Hamster-Oozyten mit hoher post-Tau-Überlebensraten. Das gleiche Verfahren kann auch angewendet werden, um erfolgreich einfrieren und auftauen Maus-Embryonen in verschiedenen Stadien der Präimplantationsdiagnostik Entwicklung sein.
Abstract
Embryonen und Eizellen wurden zunächst erfolgreich mehr als 30 Jahren, kryokonserviert, wenn Whittingham<i> Et al.</i><sup> 1</sup> Und Wilmut<sup> 2</sup> Gesondert beschrieben, dass Maus-Embryonen eingefroren konnte und bei -196 ° C gelagert und, ein paar Jahre später, Parkening<i> Et al</i>.<sup> 3</sup> Berichtet die Geburt des lebenden Nachkommen, die aus in-vitro-Fertilisation (IVF) von kryokonservierten Eizellen. Seitdem hat sich die Verwendung von Kryokonservierungstechniken rasch ausbreiten, um eine wesentliche Komponente in der Praxis der menschlichen und tierischen assistierten Reproduktion und in der Erhaltung der tiergenetischen Ressourcen geworden. Derzeit gibt es zwei Methoden verwendet, um Eizellen und Embryonen Kryokonservierung: Langsames Gefrieren und Verglasung. Eine Vielzahl von Ansätzen verwendet wurden, um zu versuchen, beide Techniken und Millionen von Tieren und Tausende von Kindern zu verbessern wurden von kryokonservierten Embryonen geboren worden. Jedoch schwerwiegende Mängel zugeordneten Kryokonservierung noch zu überwinden, da Eis-Kristall-Bildung, Lösung Effekte und osmotischen Schock scheinen mehrere cryoinjuries in post-aufgetaut Eizellen und Embryonen führen. Langsames Gefrieren mit programmierbaren Gefriergeräte hat den Vorteil, mit geringen Konzentrationen von Frostschutzmitteln, die meist mit chemischen Toxizität und osmotischen Schock verbunden sind, aber ihre Fähigkeit, Eis-Kristall-Bildung bei niedrigen Konzentrationen zu vermeiden, ist begrenzt. Langsames Gefrieren induziert auch Unterkühlung Effekte, die vermieden werden durch manuelle oder automatische Aussaat muss<sup> 4</sup>. In die Verglasung Prozess hemmen hohe Konzentrationen von Frostschutzmitteln die Bildung von Eiskristallen und führen zu der Bildung einer glasartigen verglasten Zustand, in dem Wasser verfestigt, aber nicht erweitert. Aufgrund der Toxizität von cyroprotectants bei den verwendeten Konzentrationen können Eizellen / Embryonen nur für die Gefrierschutzmittel Lösung für eine sehr kurze Zeit und in einem minimalen Volumen-Lösung ausgesetzt werden, bevor das Eintauchen der Proben direkt in flüssigem Stickstoff<sup> 5</sup>. In den letzten zehn Jahren hat der Verglasung werden immer beliebter, weil es eine sehr schnelle Methode, in denen keine teure Ausrüstung (programmierbar Tiefkühler) erforderlich ist. Jedoch weiterhin langsamen Einfrieren der am weitesten verbreitete Methode zur Eizelle / Kryokonservierung von Embryonen werden. In diesem Video-Artikel zeigen wir, Schritt-für-Schritt, wie zu sammeln und zu langsam einfrieren Hamster-Oozyten mit hoher post-Tau-Überlebensraten. Das gleiche Verfahren kann auch angewendet werden, um erfolgreich einfrieren und auftauen Maus-Embryonen in verschiedenen Stadien der Präimplantationsdiagnostik Entwicklung sein.
Protocol
Discussion
Mit diesem Protokoll Hamster-Oozyten-und Maus-Embryonen erfolgreich kryokonserviert werden. Einmal gefroren, können Eizellen / Embryonen in flüssigem Stickstoff Tanks auf unbestimmte Zeit gespeichert und wiederhergestellt werden an jedem Ort und Zeit gewünscht. Dies bietet den Vorteil, dass Proben fast einsatzbereit, wann immer erforderlich. Auf der anderen Seite kann dieses Protokoll auch verwendet, um Embryo Kryobanken aus wertvollen Mausstämme (wie transgenen Linien), wie eine kostengünstige und sichere Alternative für die Aufrecht…
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der spanischen Ministerio de Educación y Ciencia (BIO 2006-11792) und der Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437) unterstützt. Autoren möchten Marc Puigcerver und Jonatan Lucas für ihre technische Unterstützung danken, bei der Vorbereitung der Medien. Alle Mitarbeiter aus dem Servei d'Estabulari ist für Tierhaltung anerkannt, und vor allem Juan Jose Martin und Javier Benito für ihre zusätzlichen Beitrag zur Aufzeichnung Teil dieses Video. NZB ist ein Fellow des portugiesischen Fundação para a Ciência e Tecnologia und SG ist ein Fellow des spanischen Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U. Cryobiological principles of embryo freezing. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).
- Vajta, G., Kuwayama, M. Improving cryopreservation systems. Theriogenology. 65, 236-244 (2006).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. JoVE. 3, (2007).
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
