Recolección y criopreservación de ovocitos de hámster y de embriones de ratón
Summary
En este video-artículo se presenta una demostración paso a paso sobre cómo recoger y criopreservar óvulos de hámster con altas tasas de supervivencia después de la descongelación. El mismo procedimiento se puede aplicar para congelar y descongelar con éxito embriones de ratón en las diferentes etapas de desarrollo de preimplantación.
Abstract
Embriones y ovocitos criopreservados fueron los primeros con éxito más de 30 años, cuando Whittingham<i> Et al.</i><sup> 1</sup> Wilmut y<sup> 2</sup> Descritos separadamente que los embriones de ratón podría ser congelado y almacenado a -196 ° C y, unos años más tarde, Parkening<i> Et al</i>.<sup> 3</sup> Reportó el nacimiento de crías vivas como resultado de la fertilización in vitro (FIV) de ovocitos criopreservados. Desde entonces, el uso de las técnicas de criopreservación se ha extendido rápidamente a convertirse en un componente esencial en la práctica de la reproducción asistida humana y animal y en la conservación de los recursos genéticos de los animales. En la actualidad, existen dos principales métodos utilizados para criopreservar óvulos y embriones: el congelamiento lento y la vitrificación. Una amplia variedad de enfoques se han utilizado para tratar de mejorar tanto las técnicas y los millones de animales y miles de niños han nacido a partir de embriones crioconservados. Sin embargo, subsisten deficiencias importantes asociados a la criopreservación todavía hay que superar, ya que la formación de cristales de hielo, los efectos de la solución y el shock osmótico parecen causar cryoinjuries varios descongelado después de ovocitos y embriones. La congelación lenta, con congelador programable tiene la ventaja de la utilización de bajas concentraciones de crioprotectores, que generalmente están asociados con la toxicidad química y el shock osmótico, pero su capacidad para evitar la formación de cristales de hielo en concentraciones bajas es limitado. La congelación lenta también induce efectos súper-que debe ser evitado el uso de la siembra manual o automático<sup> 4</sup>. En el proceso de vitrificación, las altas concentraciones de crioprotectores inhibir la formación de cristales de hielo y dar lugar a la formación de un estado semejante al vidrio vitrificado en el que el agua se solidifica, pero no ampliado. Sin embargo, debido a la toxicidad de cyroprotectants a las concentraciones utilizadas, los ovocitos / embriones sólo pueden ser expuestos a la solución de crioprotectores por un período muy corto de tiempo y en una solución de volumen mínimo, antes de sumergir las muestras directamente en nitrógeno líquido<sup> 5</sup>. En la última década, la vitrificación se ha vuelto más popular porque es un método muy rápido en el que no se requiere un equipo caro (congelador programable). Sin embargo, la congelación lenta sigue siendo el método más ampliamente utilizado para la criopreservación de ovocitos / embriones. En este video-artículo mostramos, paso a paso, cómo recoger y congelar lentamente ovocitos de hámster con altas tasas de supervivencia después de la descongelación. El mismo procedimiento se puede aplicar para congelar y descongelar con éxito embriones de ratón en las diferentes etapas de desarrollo de preimplantación.
Protocol
Discussion
Con este protocolo de ovocitos de hámster y de embriones de ratón pueden ser criopreservados con éxito. Una vez congelado, los ovocitos / embriones pueden ser almacenados en tanques de nitrógeno líquido por tiempo indefinido y se recuperó en cualquier momento o lugar deseado. Esto ofrece la ventaja de tener muestras de casi listo para su uso cuando sea necesario. Por otro lado, este protocolo también se puede utilizar para generar criobancos embrión a partir de cepas de ratón de gran valor (como las líneas de transgénicos), como …
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio español de Educación y Ciencia (BIO 2006 hasta 11.792) y la Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Los autores desean agradecer a Marc Puigcerver y Lucas Jonatan por su asistencia técnica en la preparación de los medios de comunicación. Todo el personal de la Estabulari Servei d'es reconocido por albergar a los animales y, especialmente, Juan José Martín y Javier Benito, por su contribución adicional sobre la grabación de parte de este video. BCN es un miembro de la Fundación un párrafo portugués Ciência e Tecnologia y SG es un compañero de la española Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U. Cryobiological principles of embryo freezing. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).
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