Сбор и Криоконсервация ооцитов хомяка и мыши Эмбрионы
Summary
В этом видео-статье мы представляем шаг за шагом демонстрацию о том, как собирать и cryopreserve хомяка ооциты с высоким после оттепели выживаемости. Аналогичная процедура может быть применен и к успешно замораживания и оттаивания эмбрионов мыши на разных этапах предимплантационной развития.
Abstract
Эмбрионы и ооцитов были впервые успешно криоконсервированных более 30 лет назад, когда Уиттингем<i> Соавт.</i><sup> 1</sup> И Вильмута<sup> 2</sup> Отдельно рассказал, что мыши эмбрионы могут быть заморожены и храниться при температуре -196 ° C, и, спустя несколько лет, Parkening<i> И др.</i>.<sup> 3</sup> Сообщили рождения живое потомство в результате экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) криоконсервированных ооцитов. С тех пор, использование методов криоконсервации быстро распространяться, чтобы стать важным компонентом в практике человека и животных, оплодотворения и в области сохранения генетических ресурсов животных. В настоящее время Есть две основные методы, используемые для cryopreserve яйцеклеток и эмбрионов: медленное замораживание и стеклования. Широкое разнообразие подходов были использованы, чтобы попытаться улучшить оба метода и миллионы животных и тысячи детей были рождены от криоконсервированных эмбрионов. Тем не менее, серьезные недостатки, связанные с криоконсервации еще должны быть преодолены, так как лед-образования кристаллов, решение эффектов и осмотический шок, кажется, вызывают несколько cryoinjuries в пост-талого ооцитов и эмбрионов. Медленное замораживание с программируемым морозильники имеет преимущество использования низких концентраций криопротекторов, которые обычно связаны с химической токсичности и осмотический шок, но их способность избежать ледяных кристаллов образование при низких концентрациях ограничен. Медленное замораживание также вызывает переохлаждение эффектов, которых следует избегать с помощью ручного или автоматического посева<sup> 4</sup>. В стеклования процесса, высоких концентраций криопротекторов препятствует образованию льда кристаллов и привести к образованию стеклоподобной керамической состояние, в котором вода затвердевает, но не раскрывается. Однако из-за токсичности cyroprotectants в используемых концентрациях, ооцитов / эмбрионов может быть только подвергается криопротектора решение в течение очень короткого периода времени и в минимальном объеме раствора, перед погружением образцов непосредственно в жидком азоте<sup> 5</sup>. В последнее десятилетие стеклования стала более популярной, потому что это очень быстрый метод, в котором нет дорогостоящего оборудования (программируемые морозильная камера) не требуется. Тем не менее, медленное замораживание продолжает быть наиболее широко используемый метод для ооцитов / эмбрионов криоконсервации. В этом видео-статье мы покажем, шаг за шагом, как собирать и медленно заморозить хомяка ооциты с высоким после оттепели выживаемости. Аналогичная процедура может быть применен и к успешно замораживания и оттаивания эмбрионов мыши на разных этапах предимплантационной развития.
Protocol
Discussion
С помощью этого протокола хомяка ооцитов и эмбрионов мыши могут быть успешно криоконсервированных. Как только замороженные, ооциты / эмбрионы могут храниться в жидком азоте танки на неопределенный срок и восстановления в любое время или место лучшего. Это дает преимущество, что образцы почти гот?…
Acknowledgements
Эта работа была поддержана испанский Ministerio де Educación у Ciencia (BIO 2006-11792) и Женералитата Каталонии (2005-SGR00437). Авторы хотели бы поблагодарить Марка Puigcerver и Джонатан Лукас за техническую помощь в подготовке информации. Все сотрудники Servei d'Estabulari признается для содержания животных, и особенно Хуан Хосе Мартин и Хавьера Бенито для их дополнительного взноса на запись часть этого видео. НЦБ является членом португальской Fundação пункт Ciencia электронной Tecnologia и SG является членом испанской Ministerio де Educación у Ciencia.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U. Cryobiological principles of embryo freezing. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).
- Vajta, G., Kuwayama, M. Improving cryopreservation systems. Theriogenology. 65, 236-244 (2006).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. JoVE. 3, (2007).
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
