Collecte et cryoconservation des ovocytes de hamster et d'embryons de souris
Summary
Dans cette vidéo, article, nous présentons une démonstration étape par étape sur la façon de recueillir et de cryopréservation des ovocytes de hamster avec des taux élevés de survie post-dégel. La même procédure peut également être appliquée avec succès gel et de dégel des embryons de souris à différents stades de développement préimplantatoire.
Abstract
Les embryons et ovocytes ont d'abord été cryoconservés avec succès plus de 30 ans, quand Whittingham<i> Et al.</i><sup> 1</sup> Et Wilmut<sup> 2</sup> Décrits séparément que les embryons de souris pourrait être congelés et conservés à -196 ° C et, quelques années plus tard, Parkening<i> Et al</i>.<sup> 3</sup> Rapporté la naissance de descendants vivants résultant de la fécondation in vitro (FIV) des ovocytes cryoconservés. Depuis lors, l'utilisation de techniques de cryopréservation s'est propagé rapidement à devenir une composante essentielle dans la pratique de la procréation assistée et animale et à la conservation des ressources génétiques animales. Actuellement, il existe deux méthodes principales utilisées pour cryopréservation des ovocytes et des embryons: la congélation lente et la vitrification. Une grande variété d'approches ont été utilisées pour tenter d'améliorer à la fois techniques et des millions d'animaux et des milliers d'enfants sont nés à partir d'embryons cryoconservés. Toutefois, d'importantes lacunes liées à la cryoconservation ont encore à surmonter, puisque la formation de cristaux de glace, les effets de solution et un choc osmotique semble pas causer de plusieurs cryoinjuries en post-décongélation des ovocytes et des embryons. Congélation lente avec congélateurs programmables a l'avantage d'utiliser de faibles concentrations de cryoprotecteurs, qui sont généralement associés à la toxicité chimique et un choc osmotique, mais leur capacité à éviter la formation de cristaux de glace à de faibles concentrations est limitée. Congélation lente induit également des effets de surfusion qui doit être évité en utilisant le semis manuel ou automatique<sup> 4</sup>. Dans le procédé de vitrification, des concentrations élevées de cryoprotecteurs inhiber la formation de cristaux de glace et de conduire à la formation d'un état vitreux vitrifiés dans lequel l'eau est solidifiée, mais pas élargi. Toutefois, en raison de la toxicité des cyroprotectants aux concentrations utilisées, les ovocytes / embryons ne peuvent être exposées à la solution cryoprotecteur pour une période de temps très court et dans une solution de volume minimum, avant de plonger les échantillons directement dans l'azote liquide<sup> 5</sup>. Dans la dernière décennie, la vitrification est devenu plus populaire parce qu'il est une méthode très rapide dans lequel aucun équipement coûteux (congélateur programmable) est nécessaire. Cependant, la congélation lente continue à être la méthode la plus largement utilisée pour ovocyte / embryon cryoconservation. Dans cette vidéo, article, nous montrons, étape par étape, comment collecter et lentement gel des ovocytes de hamster avec des taux élevés de survie post-dégel. La même procédure peut également être appliquée avec succès gel et de dégel des embryons de souris à différents stades de développement préimplantatoire.
Protocol
Discussion
Avec ce protocole d'ovocytes de hamster et d'embryons de souris peuvent être cryoconservés avec succès. Une fois congelés, les ovocytes / embryons peuvent être conservés dans des cuves d'azote liquide indéfiniment et récupérer à tout moment ou le lieu désiré. Ceci offre l'avantage d'avoir des échantillons de presque prêt à utiliser dès que nécessaire. D'autre part, ce protocole peut également être utilisé pour générer cryobanques embryon à partir de souches de souris précieuses (telles que des…
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Espagnols Ministerio de Educación y Ciencia (BIO 2006 à 11792) et la Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Auteurs tiens à remercier Marc Puigcerver et Jonatan Lucas pour leur assistance technique dans la préparation du support. Tout le personnel de la Estabulari Servei d'est reconnu pour le logement des animaux, et surtout Juan José Martin et Javier Benito, pour leur contribution supplémentaire sur l'enregistrement une partie de cette vidéo. PNE est un membre de la Fundação para portugaise une Ciência e Tecnologia et SG est un fellow de l'Espagne Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U. Cryobiological principles of embryo freezing. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).
- Vajta, G., Kuwayama, M. Improving cryopreservation systems. Theriogenology. 65, 236-244 (2006).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. JoVE. 3, (2007).
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
