Verzamelen en Cryopreservatie van Hamster Eicellen en muis embryo's
Summary
In deze video-artikel stellen we een stap-voor-stap demonstratie over hoe het verzamelen en hamster eicellen cryopreserve met een hoge post-dooi overleving. Dezelfde procedure kan ook worden toegepast om met succes vorst en dooi muis embryo's in verschillende stadia van pre-implantatie ontwikkeling.
Abstract
Embryo's en eicellen werden voor het eerst met succes meer dan 30 jaar geleden ingevroren, toen Whittingham<i> Et al..</i><sup> 1</sup> En Wilmut<sup> 2</sup> Apart beschreven dat de muis embryo's kunnen worden ingevroren en bewaard bij -196 ° C, en een paar jaar later, Parkening<i> Et al.</i>.<sup> 3</sup> Meldde de geboorte van levende nakomelingen als gevolg van in-vitrofertilisatie (IVF) van gecryopreserveerd eicellen. Sindsdien is het gebruik van cryopreservatie technieken zich snel verspreiden naar een essentieel onderdeel in de praktijk van mens en dier begeleide voortplanting en in het behoud van dierlijke genetische hulpbronnen worden. Momenteel zijn er twee manieren gebruikt worden om eicellen en embryo's cryopreserve: langzaam invriezen en verglazing. Een grote verscheidenheid van benaderingen zijn gebruikt om te proberen beide technieken en miljoenen dieren en duizenden kinderen te verbeteren, zijn geboren uit ingevroren embryo's. Evenwel nog belangrijke tekortkomingen verbonden aan cryopreservatie nog moeten worden overwonnen, omdat ijs-kristalvorming, oplossing effecten en osmotische shock lijken meerdere cryoinjuries in de post-ontdooide eicellen en embryo's kunnen veroorzaken. Langzame bevriezing met programmeerbare diepvriezers heeft het voordeel van het gebruik van lage concentraties van cryoprotectants, die meestal worden geassocieerd met chemische toxiciteit en osmotische shock, maar hun vermogen om ijs-kristalvorming te vermijden bij lage concentraties is beperkt. Langzame bevriezing induceert ook onderkoeling effecten die moeten worden vermeden met behulp van handmatige of automatische zaaien<sup> 4</sup>. In de verglazing proces, hoge concentraties van cryoprotectants remmen de vorming van ijskristallen en leiden tot de vorming van een glasachtig verglaasde toestand waarin water is gestold, maar niet uitgebreid. Echter, vanwege de toxiciteit van cyroprotectants bij de gebruikte concentraties, kunnen eicellen / embryo's alleen worden blootgesteld aan de cryoprotectant oplossing voor een zeer korte periode van tijd en in een minimum volume oplossing, voordat de monsters direct ondergedompeld in vloeibare stikstof<sup> 5</sup>. In de afgelopen tien jaar heeft verglazing steeds populairder geworden, omdat het een zeer snelle methode waarbij geen dure apparatuur (programmeerbaar diepvriezer) is vereist. Echter, langzaam invriezen nog steeds de meest gebruikte methode om eicellen / embryo cryopreservatie. In deze video-artikel tonen we, stap-voor-stap hoe te verzamelen en te langzaam te bevriezen hamster eicellen met een hoge post-dooi overleving. Dezelfde procedure kan ook worden toegepast om met succes vorst en dooi muis embryo's in verschillende stadia van pre-implantatie ontwikkeling.
Protocol
Discussion
Met dit protocol hamster eicellen en embryo's muis met succes kan worden ingevroren. Eenmaal bevroren, kunnen eicellen / embryo's worden opgeslagen in vloeibare stikstof tanks voor onbepaalde tijd en teruggewonnen op elk gewenst moment of plaats gewenst. Dit biedt het voordeel van het hebben van monsters bijna klaar voor gebruik wanneer dat nodig is. Aan de andere kant kan dit protocol ook gebruikt worden om embryo cryobanks genereren uit waardevolle muizenstammen (zoals transgene lijnen), als een economische en veiliger alternatief…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Spaanse Ministerio de Educación y Ciencia (BIO 2006 tot +11.792) en de Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Auteurs willen graag Marc Puigcerver en Jonatan Lucas bedanken voor hun technische bijstand bij de voorbereiding van de media. Alle medewerkers van de Servei d'Estabulari is erkend voor huisvesting van de dieren, en vooral Juan Jose Martin en Javier Benito voor hun extra bijdrage over het opnemen van een deel van deze video. NCB is een fellow van de Portugese Fundação para a Ciência e Tecnologia en SG is een fellow van het Spaanse Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U. Cryobiological principles of embryo freezing. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).
- Vajta, G., Kuwayama, M. Improving cryopreservation systems. Theriogenology. 65, 236-244 (2006).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. JoVE. 3, (2007).
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
