Выделение протопластов из тканей 14-дневных Рассаду Arabidopsis thaliana</em
Summary
Это видео показывает процедуру выделения нетронутыми протопластов из тканей 14-дневных проростков арабидопсиса. Учитывая, что изолированных протопластов остаются неизменными, по крайней мере 96 ч и изолированы от саженцев, а не один-месячного взрослых растений, эта процедура ускоряет анализов требует нетронутыми протопластов.
Abstract
Протопласты растительных клеток, которые имели их клеточных стенок ферментативно удалены. Выделение протопластов из различных растительных тканях впервые сообщили о более чем 40 лет назад<sup> 1</sup> И с тех пор была адаптирована для изучения различных клеточных процессов, таких как внутриклеточную локализацию белков, изоляция интактных органелл и целевого гена-инактивации двухцепочечной РНК-интерференция (RNAi)<sup> 2-5</sup>. Большинство протоколов протопластов изоляции используем лиственные тканей зрелого Arabidopsis (например, 35-дневных растений)<sup> 2-4</sup>. Мы изменили существующие протоколы, используя 14-дневных проростков Arabidopsis. В этой процедуре, один грамм 14-дневных проростков дали 5 10<sup> 6</sup> -10<sup> 7</sup> Протопластов, которые остаются неизменными по крайней мере 96 часов. Выход протопластов из саженцев сравнима с препаратами из листьев зрелых Arabidopsis, но вместо 35-36 дней, выделение протопластов завершен в течение 15 дней. Это позволяет уменьшить время и пространство роста камеры, которые необходимы для выделения протопластов, когда взрослые растения используются, и ускоряет течение исследований, которые требуют нетронутыми протопластов.
Protocol
Discussion
Для обеспечения высокого выхода интактных протопластов это очень важно для запуска со здоровыми растениями. Использовать фильтр-стерилизовать решения для выделения протопластов. Помните, что протопласты хрупкой. Поэтому, когда вы обращаетесь протопластов, не смешиваются, пипетки ил?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Корнельского университета Сельскохозяйственной Экспериментальной Станции (CUAES) Нью-Йоркской-125433 Hatch Грант и Корнельский Start-Up Грант присуждается OKV
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma | M5524 | ||
| Agar | Sigma | A1296 | ||
| Petri Dishes (100x15mm) | Kreckeler Scientific | 82-4001 | ||
| Cellulase (Onozuka R‐10) | RPI Corp | C32200 | ||
| Macerozyme (R10) | RPI Corp | M22010 | ||
| Cheesecloth wipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | ||
| Lab Rotator | Fisher Scientific | 1167152Q | ||
| Allegra X‐15R Centrifuge | VWR | 392932 | ||
| Axioskop2 Plus Microscope | Zeiss |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
