عزلة Protoplasts من أنسجة لمدة 14 يوما من عمره الشتلات thaliana Arabidopsis</em
Summary
هذا الفيديو يظهر إجراء لعزل protoplasts سليمة من أنسجة لمدة 14 يوما من العمر شتلة من Arabidopsis. بالنظر إلى أن protoplasts معزولة لا تزال سليمة على الأقل 96h ومعزولة من الشتلات بدلا من شهر واحد من العمر محطات ناضجة ، وهذا الإجراء يعجل المقايسات التي تتطلب protoplasts سليمة.
Abstract
Protoplasts هي الخلايا النباتية التي كانت جدران الزنزانة لازالة إنزيمي. وكانت أول من العزلة protoplasts من الأنسجة النباتية المختلفة أكثر من 40 عاما<sup> 1</sup> ومنذ ذلك الحين تم تكييفها لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية ، مثل توطين التحت خلوية من البروتينات ، والعزلة من عضيات سليمة واستهدفت تعطيل الجينات التي تدخل RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (رني)<sup> 2-5</sup>. معظم بروتوكولات العزل الجبلة المجردة استخدام أنسجة نبات من Arabidopsis الناضجة (مثل 35 يوما من العمر النباتات)<sup> 2-4</sup>. نحن تعديل البروتوكولات القائمة من خلال توظيف Arabidopsis الشتلات لمدة 14 يوما من عمره. في هذا الإجراء ، أسفرت عن 14 غراما واحدا من أيام عمره الشتلات 5 10<sup> 6</sup> -10<sup> 7</sup> protoplasts التي لا تزال على حالها لا يقل عن 96 ساعة. العائد من protoplasts من الشتلات هو مقارنة مع الاستعدادات من أوراق من Arabidopsis ناضجة ، ولكن بدلا من 35-36 يوما ، يتم الانتهاء من العزلة protoplasts في 15 يوما. وهذا يسمح بخفض الوقت ونمو مساحة الغرفة التي مطلوبة من أجل عزل protoplasts عندما تستخدم محطات ناضجة ، ويعجل من الدراسات اللاحقة التي تتطلب protoplasts سليمة.
Protocol
Discussion
لضمان عالية الغلة من الجبلة المجردة سليمة من المهم جدا البدء مع النباتات صحية. استخدام فلتر تعقيم حلول لعزل protoplasts. تذكر أن protoplasts هشة. لذلك ، عندما كنت التعامل مع protoplasts ، لا يختلطان الماصة أو دوامة منهم منذ ذلك بقوة ستحد منها. بدلا من ذلك ، مزيج protoplasts عن طريق تناوب ببط?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل محطة جامعة كورنيل التجربة الزراعية (CUAES) NYC – 125433 هاتش غرانت وكورنيل بدء المنحة لOKV
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma | M5524 | ||
| Agar | Sigma | A1296 | ||
| Petri Dishes (100x15mm) | Kreckeler Scientific | 82-4001 | ||
| Cellulase (Onozuka R‐10) | RPI Corp | C32200 | ||
| Macerozyme (R10) | RPI Corp | M22010 | ||
| Cheesecloth wipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | ||
| Lab Rotator | Fisher Scientific | 1167152Q | ||
| Allegra X‐15R Centrifuge | VWR | 392932 | ||
| Axioskop2 Plus Microscope | Zeiss |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
