Isolamento de Protoplastos de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis thaliana</em
Summary
Este vídeo mostra um procedimento para isolar protoplastos intactos a partir de tecidos de 14 dias de idade, mudas de Arabidopsis. Dado que o protoplastos isolados permanecem intactos por pelo menos 96h e são isoladas de mudas, em vez de um mês de idade plantas maduras, esse procedimento agiliza ensaios exigindo protoplastos intactos.
Abstract
Protoplastos são células vegetais que tiveram suas paredes celulares enzimaticamente removido. Isolamento de protoplastos a partir de tecidos diferentes de plantas foi relatada pela primeira vez mais de 40 anos atrás<sup> 1</sup> E desde então tem sido adaptado para estudar uma variedade de processos celulares, tais como localização subcelular de proteínas, o isolamento de organelas intactas e orientada inativação de genes por interferência de RNA dupla fita (RNAi)<sup> 05/02</sup>. A maioria dos protocolos de isolamento de protoplastos use tecidos de folhas de Arabidopsis maduros (por exemplo, 35 dias de idade das plantas)<sup> 04/02</sup>. Nós modificamos os protocolos existentes, empregando mudas de 14 dias de idade Arabidopsis. Neste procedimento, um grama de 14 dias de idade mudas rendeu 5 10<sup> 6</sup> -10<sup> 7</sup> Protoplastos que permanecem intactos, pelo menos, 96 horas. O rendimento de protoplastos a partir de mudas é comparável com os preparativos das folhas de Arabidopsis maduro, mas ao invés de 35-36 dias, o isolamento de protoplastos é concluído em 15 dias. Isto permite diminuir o tempo eo espaço câmara de crescimento que são necessários para isolar protoplastos quando as plantas maduras são usadas, e acelera os estudos a jusante que exigem protoplastos intactos.
Protocol
Discussion
Para garantir o alto rendimento de protoplastos intactos é muito importante para start-up com as plantas saudáveis. Use filtro esterilizar soluções para isolar protoplastos. Lembre-se que protoplastos são frágeis. Portanto, quando você está lidando com protoplastos, não se misturam, pipeta ou vortex-os vigorosamente, uma vez que vai de freio-los. Em vez disso, misture protoplastos girando lentamente ou com fita do tubo de centrifugação. O procedimento descrito rendimento de protoplastos intactos que são viá…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Estação Experimental Agrícola da Universidade de Cornell (CUAES) NYC-125433 escotilha Grant e Cornell Start-Up Grant concedido a OKV
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma | M5524 | ||
| Agar | Sigma | A1296 | ||
| Petri Dishes (100x15mm) | Kreckeler Scientific | 82-4001 | ||
| Cellulase (Onozuka R‐10) | RPI Corp | C32200 | ||
| Macerozyme (R10) | RPI Corp | M22010 | ||
| Cheesecloth wipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | ||
| Lab Rotator | Fisher Scientific | 1167152Q | ||
| Allegra X‐15R Centrifuge | VWR | 392932 | ||
| Axioskop2 Plus Microscope | Zeiss |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
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- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
