本视频展示了一种从14天龄拟南芥幼苗组织中分离完整原生质体的方法。由于所分离的原生质体至少可保持完整状态96小时，且来源于幼苗而非一个月大的成熟植株，因此该方法可加快需要完整原生质体的实验检测流程。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
原生质体是通过酶解法去除细胞壁后的植物细胞。从不同植物组织中分离原生质体的方法早在40多年前即有报道。1并已被用于研究多种细胞过程，例如蛋白质的亚细胞定位、完整细胞器的分离，以及通过双链RNA干扰（RNAi）实现靶向基因失活2-5. 大多数原生质体分离方案使用成熟拟南芥的叶片组织（例如，35天大的植株）2-4. 我们通过采用14天大的拟南芥幼苗改进了现有方案。在此过程中，1克14天大的幼苗可产生5 × 106-107至少能保持完整的原生质体时间为96小时。从幼苗中获得的原生质体产量与从成熟拟南芥叶片中制备的产量相当，但与成熟植株所需的35-36天相比，幼苗原生质体的分离可在15天内完成。这减少了使用成熟植株分离原生质体所需的时间和生长室空间，同时加快了需要完整原生质体的后续研究进程。
方案
第1部分. 植物培养用固体培养基的制备。
我们通常在添加了1%蔗糖和0.7%琼脂的浓缩MS（Murasige和Skoog）培养基上培养植物。该培养基含有维持植物健康所需的所有必要成分。
配制1L MS培养基，pH 5.7
- 在1.5–2.0 L的可高压灭菌瓶中，将2.15 g MS粉末加入800 ml水中。
- 将搅拌子放入瓶中，并在搅拌板上搅拌使MS粉末溶解。
- 在搅拌过程中，逐滴加入1N KOH，调节MS培养基的pH至5.7。
- 加入10 g蔗糖，继续搅拌。
- 加入7 g琼脂*。
- 将配制好的培养基定容至1000 ml，并通过高压灭菌进行灭菌*。
- 将高压灭菌后的培养基置于搅拌板上，在搅拌条件下冷却，以防止琼脂在瓶底沉淀。将培养基冷却至约60 °C*。
- 倒入100 mm的培养皿中。将培养皿保存在4 °C条件下。
*提示 1：不要试图溶解琼脂。它将在灭菌过程中溶解。
*提示 2：灭菌时将搅拌子保留在瓶中，后续步骤会用到。
*提示 3：如果您的手能够握住已灭菌的瓶子持续 10 秒，说明培养基已充分冷却，可以开始倒平板。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
为了获得高产量的完整原生质体，必须从健康的植株开始实验。用于分离原生质体的溶液需经过滤除菌。请注意，原生质体十分脆弱，因此在操作过程中切勿剧烈混合、吹打或涡旋，以免将其破坏。应通过缓慢旋转或轻弹离心管的方式温和混匀原生质体。本方法所获得的完整原生质体至少可在 96 小时内保持活性。因此，这些原生质体可用于研究多种细胞过程，例如蛋白质的亚细胞定位、完整细胞器的分离与分析，以及利用双链 RNA 干扰（RNAi）实现靶向基因失活等3-5。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
描述该植物基因功能分析方法的临时专利已于2008年6月提交至康奈尔技术企业与商业化中心（CCTEC）。案卷号50341/015001：Vatamaniuk, O.K. 和 Zhai, Z. 植物基因快速功能分析方法。
致谢
本工作由康奈尔大学农业实验站（CUAES）NYC-125433 哈奇基金以及授予 O.K.V. 的康奈尔大学启动基金资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MS基本盐混合物（Murashige和Skoog） | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| 琼脂 | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 培养皿（100×15 mm） | Krackeler Scientific, Inc. | 82-4001 | |
| 纤维素酶（Onozuka R‐10） | Research Products International Corp. | C32200 | |
| 离析酶（Macerozyme R10） | Research Products International Corp. | M22010 | |
| 纱布擦拭巾 | Fisher Scientific | 06-665-29 | |
| 实验室旋转仪（LabRotator） | Fisher Scientific | 1167152Q | |
| Allegra X‐15R 离心机 | VWR international | 392932 | |
| Axioskop 2 Plus 显微镜 | Carl Zeiss, Inc. |
参考文献
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
