从14日龄的幼苗组织原生质体的分离拟南芥</em
Summary
这个视频展示了从14日龄拟南芥幼苗组织中分离完整的原生质体的过程。此过程加快，原生质体保持不变的至少96小时，是从，而不是一月龄成熟的植物幼苗孤立的，需要完整的原生质体的检测。
Abstract
原生质体是植物细胞有细胞壁酶去除的。超过40年前首次报道从不同植物组织的原生质体的分离<sup> 1</sup>，并一直适应研究各种细胞过程，如蛋白质的亚细胞定位，完整的细胞器的隔离和有针对性的双链RNA干扰（RNAi）基因失活，<sup> 2-5</sup>。原生质体分离协议大多采用成熟的拟南芥叶组织（例如35天的老厂）<sup> 2-4</sup>。我们采用14日龄的拟南芥幼苗修改现有的协议。在此过程中，一克14日龄的幼苗产生5 10<sup> 6</sup> -10<sup> 7</sup>原生质体至少96小时保持不变。从幼苗原生质体的产量是准备成熟的拟南芥叶相媲美，但原生质体的分离，而不是35-36天，在15天完成。这使得减少的时间和需要隔离时，使用成熟的植物原生质体的生长室空间，并加快下游研究，需要完整的原生质体。
Protocol
第1部分。制备固体培养基上生长的植物。 我们通常集中Murasige和Skoog（MS）培养基上的文化植物辅以1％蔗糖和0.7％的琼脂。它包含了所有必要的成分，保持健康的植物。 准备介质pH值5.7的MS，1L 在1.5 – 2.0L高压灭菌瓶，加入到800毫升的水的MS粉2.15克。 放置一个搅拌棒装入瓶中，并解散MS粉搅拌，搅拌板介质。 边搅拌，加，…
Discussion
为了确保完整的原生质体的产量高，它是非常重要的启动与健康的植物。使用过滤消毒隔离原生质体解决方案。记住，原生质体是脆弱的。因此，当你正在处理的原生质体时，不要混用，吸管或涡他们大力，因为这将制动他们。相反，混合，通过缓慢旋转或胶带的离心管中的原生质体。所描述的过程产量完整的原生质体是可行的至少96小时。因此，原生质体，可用于研究各种细胞过程，如蛋白质?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国康奈尔大学农业试验站（CUAES）NYC – 125433哈奇格兰特和康奈尔大学的支持，启动拨款，批到OKV
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma | M5524 | ||
| Agar | Sigma | A1296 | ||
| Petri Dishes (100x15mm) | Kreckeler Scientific | 82-4001 | ||
| Cellulase (Onozuka R‐10) | RPI Corp | C32200 | ||
| Macerozyme (R10) | RPI Corp | M22010 | ||
| Cheesecloth wipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | ||
| Lab Rotator | Fisher Scientific | 1167152Q | ||
| Allegra X‐15R Centrifuge | VWR | 392932 | ||
| Axioskop2 Plus Microscope | Zeiss |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
Tags
IsolationProtoplasts14-day-old SeedlingsArabidopsis ThalianaCell WallsEnzymatically RemovedPlant CellsCellular ProcessesSubcellular LocalizationProteinsIntact OrganellesTargeted Gene-inactivationDouble Stranded RNA Interference (RNAi)Protoplast Isolation ProtocolsMature Arabidopsis PlantsModified Protocols15 DaysYield Of ProtoplastsTime-savingGrowth Chamber SpaceDownstream Studies
Cite This Article
Zhai, Z., Jung, H., Vatamaniuk, O. K. Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (30), e1149, doi:10.3791/1149 (2009).