の14日齢の苗の組織からのプロトプラストの単離シロイヌナズナ</em
Summary
このビデオでは、シロイヌナズナの14日齢の実生の組織から無傷のプロトプラストを単離するための手順を示しています。分離されたプロトプラストは、少なくとも96時間のためにそのまま残るし、代わりに一ヶ月の成熟植物の苗から分離されていることを考えると、この手順は、無傷プロトプラストを必要とするアッセイを迅速に処理されます。
Abstract
プロトプラストは細胞壁が酵素的に除去あった植物細胞である。異なる植物組織からのプロトプラストの単離は、最初の40年以上前に報告された<sup> 1</sup>それ以来このような細胞内タンパク質の局在、無傷の細胞小器官の分離と二本鎖RNA干渉（RNAi）による遺伝子不活性化標的としての細胞プロセスの様々な、研究するために適応されています<sup> 2月5日</sup>。プロトプラストの分離プロトコルのほとんどは、成熟したシロイヌナズナの葉組織（例えば、35日齢の植物）を使用してください<sup> 2月4日</sup>。我々は、14日齢のシロイヌナズナの苗を用いることにより、既存のプロトコルを変更。この手順では、14日齢の実生の1グラムは、5 10が得られた<sup> 6</sup> -10<sup> 7</sup>少なくとも96時間そのまま残りますプロトプラスト。苗からのプロトプラストの収量は、成熟したシロイヌナズナの葉から調製品と同等ですが、代わりに35〜36日から、プロトプラストの単離は、15日間で完了します。これは成熟した植物を使用するときにプロトプラストを単離するために必要な時間と成長室のスペースを減少させることができ、そのままプロトプラストを必要と下流の研究を促進します。
Protocol
Discussion
無傷のプロトプラストを高収率を確保するためには、健康な植物で、起動に非常に重要です。プロトプラストを単離するための溶液をろ過滅菌して使用してください。プロトプラストが壊れやすいことに注意してください。したがって、プロトプラストを処理する際に、ピペットまたはそれはそれらを制動される精力的に以来、渦、それらを混在させないでください。代わりに、徐々に遠心?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、スタートアップ助成金は、OKVに授与コーネル大学農業試験場（CUAES）NYC – 125433ハッチグラントとコーネルによってサポートされていました
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma | M5524 | ||
| Agar | Sigma | A1296 | ||
| Petri Dishes (100x15mm) | Kreckeler Scientific | 82-4001 | ||
| Cellulase (Onozuka R‐10) | RPI Corp | C32200 | ||
| Macerozyme (R10) | RPI Corp | M22010 | ||
| Cheesecloth wipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | ||
| Lab Rotator | Fisher Scientific | 1167152Q | ||
| Allegra X‐15R Centrifuge | VWR | 392932 | ||
| Axioskop2 Plus Microscope | Zeiss |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
