Isolering av Protoplasts från vävnaderna på 14 dagar gamla plantor av Arabidopsis thaliana</em
Summary
Denna video visar ett förfarande för att isolera intakt protoplasts från vävnader i 14-dagar gamla plantor av Arabidopsis. Med tanke på att den isolerade protoplasts förblir intakta i minst 96h och är isolerade från plantor i stället för en månader gamla mogna anläggningar, påskyndar denna procedur analyser som kräver intakt protoplasts.
Abstract
Protoplasts är växtceller som har fått sina cellväggar enzymatiskt bort. Isolering av protoplasts från olika plantvävnader rapporterades första gången mer än 40 år sedan<sup> 1</sup> Och har sedan anpassats för att studera en mängd olika cellulära processer, såsom subcellulära lokalisering av proteiner, isolering av intakt organeller och riktade gen-inaktivering av dubbelsträngat RNA interferens (RNAi)<sup> 2-5</sup>. De flesta av de protokoll som protoplastfusion isolering används blad vävnader av mogna Arabidopsis (t.ex. 35 dagar gamla växter)<sup> 2-4</sup>. Vi ändrade befintliga protokoll genom att använda 14-dagar gamla Arabidopsis plantor. Vid detta förfarande gav ett gram 14-dagar gamla plantor 5 10<sup> 6</sup> -10<sup> 7</sup> Protoplasts att förbli intakt i minst 96 timmar. Avkastningen av protoplasts från plantor är jämförbar med preparat från blad av mogna Arabidopsis, men istället för 35-36 dagar, är isolering av protoplasts avslutades i 15 dagar. Detta gör att minska den tid och tillväxt kammare utrymme som krävs för att isolera protoplasts när mogna växter används och påskyndar de efterföljande studier som kräver intakt protoplasts.
Protocol
Discussion
För att garantera hög avkastning av intakt protoplastfusion det är mycket viktigt att starta med friska växter. Använd filter-sterilisera lösningar för att isolera protoplasts. Kom ihåg att protoplasts är sköra. Därför, när du hanterar protoplasts inte blanda, pipett eller virvel dem kraftigt eftersom det kommer att bromsa dem. Istället blanda protoplasts av långsamt roterande eller tejpning centrifugröret. Det beskrivna förfarandet ger intakt protoplasts som är livskraftiga i minst 96 h. Därför kan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Cornell University Agricultural Experiment Station (CUAES) NYC-125.433 Hatch Grant och Cornell startpeng tilldelas OKV
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Sigma | M5524 | ||
| Agar | Sigma | A1296 | ||
| Petri Dishes (100x15mm) | Kreckeler Scientific | 82-4001 | ||
| Cellulase (Onozuka R‐10) | RPI Corp | C32200 | ||
| Macerozyme (R10) | RPI Corp | M22010 | ||
| Cheesecloth wipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | ||
| Lab Rotator | Fisher Scientific | 1167152Q | ||
| Allegra X‐15R Centrifuge | VWR | 392932 | ||
| Axioskop2 Plus Microscope | Zeiss |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
