Kwantificeren van Gist Chronologisch Life Span door uitgroei van Aged cellen

Summary

Chronologische veroudering in gist verwijst naar het verlies van cel levensvatbaarheid geassocieerd met de tijd in de stationaire fase. Hier beschrijven we een high-throughput methode voor het kwantitatief bepalen van gist chronologische levensduur.

Abstract

De gist<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Heeft zich bewezen als een belangrijk model organisme in het gebied van vergrijzing onderzoek¹. De replicatieve en chronologische levensduur zijn twee gevestigde paradigma's gebruikt om te bestuderen veroudering in gist. Replicatieve veroudering wordt gedefinieerd als het aantal van de dochter van cellen een enkele gist moeder cel produceert voor veroudering, chronologische veroudering wordt bepaald door de lengte van de tijd cellen kunnen overleven in een niet-delende, rust-achtige toestand². Hebben we een high-throughput-methode voor kwantitatieve meting van de chronologische levensduur. Deze methode houdt veroudering van de cellen in een bepaald medium onder roeren en bij constante temperatuur. Op elke leeftijd-punt, is een sub-populatie van cellen verwijderd zijn van de vergrijzing cultuur en geënt in een rijke groei medium. Een hoge-resolutie groeicurve wordt dan verkregen voor deze sub-populatie van oude cellen met behulp van een Bioscreen C MBR machine. Een algoritme wordt vervolgens toegepast op het relatieve aandeel van levensvatbare cellen in elke sub-populatie op basis van de groei kinetiek bij elke leeftijd-point te bepalen. Deze methode vereist aanzienlijk minder tijd en middelen in vergelijking met andere chronologische levensduur testen met behoud van reproduceerbaarheid en precisie. De high-throughput aard van deze test moet het mogelijk maken voor grootschalige genetische en chemische screens om nieuwe lange levensduur modifiers te identificeren voor verdere testen in meer complexe organismen.

Protocol

Deel 1: Voorbereiding van het ouder worden culturen Streak stammen van interesse van bevroren voorraden op YEPD agarplaten (1% gistextract, 2% Bacto-pepton, 2% agar, 2% glucose). Incubeer de cellen bij 30 ˚ C gedurende 48 uur of totdat enkele kolonies verschijnen. Pick enkele kolonies en enten in 5 ml YEPD vloeibaar medium (1% gistextract, 2% Bacto-pepton, 2% glucose) in reageerbuizen. Grow culturen 's nachts bij 30 ˚ C, terwijl je continu roert met behulp van een shaker of…

Discussion

De high-throughput chronologische levensduur test hier beschreven is een effectieve methode voor het kwantificeren van de veroudering potentieel van grote aantallen van stammen met een hoge nauwkeurigheid en precisie. De primaire opmars van deze methode ten opzichte van klassieke methoden voor de bepaling te overleven door het tellen van kolonievormende eenheden (bijv. zie ³⁾ is het gebruik van een shaker / incubator / plaat leesapparaat, zoals de Bioscreen C MBR machine met een hoge resolutie groeicurven te …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Bacto Peptone	Reagent	BD	211677
Bacto Yeast Extract	Reagent	BD	288620
Difco Agar	Reagent	BD	214530
Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S.	Reagent	MidSci	J630-500G
Amino Acids	Reagent	Sigma
Ammonium Sulfate	Reagent	Spectrum	AM185
Dextrose	Reagent	Fisher	D16-10
Bioscreen C MBR machine	Tool	Growth Curves USA	5101370
Bioscreen 100-well Honeycomb plate	Tool	Growth Curves USA	9502550